Introduction
인간 유전 연구 고품질 DNA를 얻는 것은 질병 유전자 발견 프로세스에 필수적이다. 혈액, 타액 수집보다 더 비싼 또한 침략적인 절차를 요구하고 있지만, 기능 연구에 대한 무한 DNA의 소스 또는 iPSCs로 불후의 세포 라인을 만드는 선호하고, 세포주를 사용할 수없는 경우 때때로 혈액 DNA가 사용됩니다. 그러나, 혈액을 획득하는 훈련 된 phlebotomist을 필요로 피가 침 하나보다 짧은 반감기를 가지고있다. 그것을 수집함으로써 잘 병원 실험실 (2)의 집수 영역을 넘어 전위 피사체 풀을 증가 phlebotomist 필요없이 이메일을 통해 전송 될 수 있기 때문에 타액으로부터 DNA는 얻을 저렴하고 용이하다. 과목 대신 혈액 3, 4의 타액 샘플을 채취 할 수있는 옵션이있을 때 연구 등록이 개선 될 수있다. 수량과 타액에서 DNA의 질에 대한 우려는 우리가 널리 제한되어 있습니다타액 2, 3, 4, 5의 상당한 양을 구하는 않았다 이전 협측 면봉 방법을 통해 DNA 테스트에 대한 밀리리터 당 4.3 × 105 세포의 평균으로, 전체 타액의 적합성을 나타내는 수많은 연구 최근의 연구에도 불구하고, 즉, 6. 겸손한 문학 마이크로 어레이 기반 방식 팔을 포함하여 유전자형 응용 프로그램에 대한 전체 타액 유래 DNA의 적합성을 보여주는 존재하지만 9, 10, 더 연구가 시도되지 않은 차세대 시퀀싱 (NGS). 이 모든 타액 DNA 추출 프로토콜을 최적화하는 목적은 쉽게 일반적인 시약 및 소모품으로 실험실에서 구현 비용 효과적인 방식으로 응용 프로그램에 대한 유전학 수량 및 품질을 최대화하는 것이다.
타액에서 DNA 추출은 여러 절차가 필요합니다 : 1) 수집 및 저장, 2) 세포 용해, 3)의 RNase 처리, 4) 단백질 침전, 5) 에탄올 침전, 6) DNA의 수분 보충을. 기재된 DNA 안정화 버퍼 용액이전에이 적절하게 변경없이 작동합니다. 의 RNase 처리 및 DNA의 수분 보충 단계를 최적화하기위한 어떠한 시도도하지 않았다. 나머지 각 단계의 수율에 영향을 미칠 수있는 여러 변수가 확인되었다. 각 변수를 개별적으로 조작하고, 수율 및 품질의 향상이 통계적으로 평가 하였다. 수율 및 / 또는 DNA의 품질을 향상시키기 위해 도시 된 변수의 최적 값은 최종 프로토콜에 포함되었다.
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Protocol
참고 : 이전 타액 샘플을 제공하기 위해 모든 주제는 전국 어린이 병원에서 사람을 대상으로 치료를위한 가이드 라인을 준수 동의를 통보했다.
1 타액 수집 및 저장
- 타액을 수집하기 전에 피사체의 입 피사체가 물로 입을 헹구어 갖는 식사를 피하거나 샘플을 수집하기 전에 30 분 동안 마시는 음식이나 이물질이 없는지 확인합니다.
- 캡 또는 튜브의 내부에 손이 닿지 않도록 확인하는 DNA 안정화 버퍼 (2) 2.5 ㎖로 15 ㎖의 원심 분리기 튜브를 열고 피사체가 완충 용액에 침 2.5 ㎖의 침이있다. 참고 : 타액의 이상 2.5 ml의 수집은 DNA 안정화 버퍼에 샘플의 부족 비율에서 샘플이 저하 될 수 있습니다. 너무 작은 타액을 수집하는 프로토콜에서 예상 수확량을 감소시킬 것이다. 컬렉션 볼륨을 평가하려면, t 측에 번호 그라디언트를 사용그는 튜브.
- 캡을 교체하고, 혼합물을 균질화 될 때까지 반전으로 섞는다. 격렬한 흔들림이 필요하지 않습니다. 단기 기억 또는 장기 저장을위한 4 ° C (> 3 개월)에 대한 RT에서 샘플을 보관합니다.
2 초기 준비 및 세포 용해
- 이전 추출을 시작으로, 37 ° C에 수조를 가열하고, 얼음 양동이를 준비합니다. 세 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브는 각 추출 된 샘플에 대해 필요합니다. 세 튜브 세포 단백질 펠렛, 최종 gDNA를 추출하고, 이소프로판올 및 에탄올 상청액을 보유하는 데 사용된다.
- 15 초 후 중간 속도로 소용돌이를 저장에서 샘플 및 반전 샘플을 여러 번 검색합니다.
- 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에 시료를 2.5 ㎖에 분배하고, 세포 용해 용액 5 ㎖를 추가합니다. 반전에 의해 시료 50 시간 혼합하고, 30 분 동안 RT에서 배양한다.
3 RNA 제거
- 의 RNase 솔의 40 μl를 추가100 ㎎ / ㎖에서의 ution, 그리고 15 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 3 분 동안 얼음에 37 ° C의 물을 욕조에서 샘플을 제거하고 멋진.
- 의 RNase 인큐베이션 후, 프로토콜의 DNA의 재수 단계에서 65 ° C로 수조의 온도를 증가시킨다.
(4) 단백질 및 지질 제거
- , ㎖ / 20 밀리그램에 테 K 솔루션의 50 μl를 추가 반전에 의해 여러 번 혼합과 30 분의 최소 RT 부화. 참고 :이 프로토콜에 대한 가능한 일시 정지 포인트입니다. 추출이 완료 될 때까지 K 테 수용액을 첨가 한 후, 샘플을 4 ° C에서 저장 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 보관 추출 수율 또는 DNA의 품질에 상당한 영향을 미치는 것으로 도시되지 않았다. 이 단계에서 장기 저장이 평가되지 않았습니다.
- 10 분 동안 얼음에 20 고속 초, 및 장소를 적극적 소용돌이 단백질 침전 솔루션의 1.7 ML을 추가합니다. 샘플은 3000 XG에 10 분, 4 ° C에 10 분, 원심 분리기에 얼음에 냉각 한 후에. 침전 된 단백질은 단단한 펠릿이 계속 형성해야합니다. 펠릿을 꽉 없거나 흐린 용액이 여전히 있다면, 샘플은 5 분 더 얼음 위에서 냉각 할 수 있고, 원심 분리를 반복. 샘플은 단단한 펠릿을 보장하기 위해 얼음에 보관해야합니다.
(5) 분리 및 gDNA를 정제
- 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에, 피펫 아이소 프로필 알코올 5 ㎖ 및 20 ㎎ / ㎖에서 순수 글리코겐 솔루션의 8 μL.
- 침전 된 단백질 펠렛을 남겨두고, 아이소 프로필 알코올과 글리코겐 솔루션을 포함하는 튜브에 4.3 단계에서 gDNA를가 포함 된 상층 액을 붓는다. 상층 액을 추가 한 후, 부드럽게 3000 XG 및 4 ℃에서 30 분 동안 샘플을보기 반전 원심 분리에 의해 50 시간 혼합한다.
- 깨끗한 15 ML 튜브에 천천히 뜨는을 붓고. 상청액을 제거한 후, 70 % 에탄올 1 ㎖를 추가 할수회 천천히 부드럽게 흔들 석출 펠렛 위에 에탄올을 이동하여 펠렛을 씻는다. 튜브에서 에탄올을 유지합니다.
- 초기 세척 한 후, 2000 XG에 1 분, 20 ° C에 대한 샘플을 원심 분리기. 이 원심 분리 단계는 4 ° C에서 20 ° C 중 하나에서 수행 할 수 있습니다. 온도의 큰 영향이 단계에서는 도시되지 않았다.
- 펠렛의 초기 세척 및 원심 분리 후, 천천히 튜브에서 에탄올 세척을 부어 버리고, 다음 단계 5.3 및 5.4를 반복하여 두 번째 세척을 수행합니다.
- 두 번째 세척에서 상층 액의 제거 후, 15 분간 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다.
- 시료를 완전히 건조되지 않은 경우, 또 다른 15 분 동안 공기 건조.
gDNA를의 6 재수
- 샘플이 건조되면, 건조 gDNA를 펠렛을 재수하는 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 300 μl를 추가합니다.
- 중간 속도와 장소에서 5 초 동안 소용돌이 샘플1 시간 동안 65 ° C 온수 목욕입니다.
- 수조에서 샘플을 제거하고 RT에서 O / N을 품어.
참고 : 모든 제품 및 시약 재료 표에 나와있는 사용뿐만 아니라, 표 4.
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Representative Results
DNA는 한 쌍의 DNA를 추출하는 일련의이 수행 된 추출을위한 최적의 매개 변수를 결정합니다. 하나의 타액 샘플을 분할하고 각 부분은 주어진 변수에 대한 두 가지 값 중 하나를 사용하여 테스트되었습니다. 각 쌍 테스트 적어도 8 회 반복 (예를 들어, 하나의 타액 샘플과 초기 50 ° C에서 배양없이 모두 추출을 테스트하기 위해 분주했다)을 시행 하였다. 총 DNA 수율, 280 분의 260 값 230분의 260 값과 분열을 평가하기 위해 전기 영동 DNA의 육안 검사 : 최적화는 네 표준 통계에 근거했다. 변수의 모든 가능한 조합을 개별적으로 각 변수의 한계 효과를 평가하기 위해 대신 사용 중단, (N = 169의 조합) 통계적인 상호 작용을 평가 하였다. 효과는 다중 방식보기 회 반복 측정 ANOVA를 사용하여 시험하였고, 예상 효과는 동등한 회귀 방정식으로부터 유도 하였다. 모든 중요한 효과는 단언로서 도시, 다음 표 1에 나타내었다수율 시대 변화 또는 DNA의 품질 (280 분의 260과 230분의 260) (침 입력 ml의 당 NG / μL).
세포 용해 (단계 2)를 평가하여 최적화 하였다 : 50 °의 C 배양 (1 시간) 중 하나)의 존재 / 부재를 테 K 저하 및 저장 버퍼에 의해 매개되는 세포 용해가 완료이 갔다되도록하여 세포 용해 전에 ) 존재 / 공정 (중간 속도, 15 초)에 의해 균질화 텍싱의 유무, 3) 세포 용해 액의 배양 시간 (5 대 30 분). 30 분간 세포 용해 인큐베이션은 3.5 % (p <0.01)의 평균하지만 다른 세포 용해 변수 수율에 큰 영향을 미치지 않았다하여 수율을 증가시켰다. 소용돌이로는 통계적으로 유의 하였다 (p <0.001) 그러나 0.03 실질적으로 작은하여 280 분의 260 비율이 감소했다.
단백질 침전 (단계 4) 단백질의 침전 효율을 향상 아미노산 사슬을 방해 테 K 소화 앞에는 및 DNA를 포착 열기. 프로 테이나 제 K의 양이 10 배 변화시켰다.원심 분리 온도는 4 ° C에 20 ° C에서 감소 하였다. 프로 테이나 제 K의 양을 증가 시키면 수율 (8.7 %)도 다소 향상 모두 230분의 260 및 280 분의 260 비율의 통계적으로 유의 한 감소를 일으켰다.
에탄올 침전 (5 단계) 시험 프로토콜의 마지막 단계였다. 전체 시간 원심 분리 (5 분, 11 대 30)이었던 것에 글리코겐 캐리어 (0, 8 μL)의 양은 변화시켰다. 전용 원심 분리 시간이 크게 290퍼센트의 평균 증가와 함께, 수율에 영향을 미쳤다. 이상 스핀도 280 분의 260 비율과 약간 (0.05) 감소되었다. 수율 글리코겐에 큰 영향은 실험 동안 관찰되지 않았다; 이러한 추출에서 DNA의 총량이 글리코겐 비록 일반적으로 사용되지 않을 정도로 충분히 크다. 이들 샘플의 효과의 부족에도 불구하고, 그것은 여전히 타액 투입량 여기 또는 거기는 주어진 경우보다 낮은 수율마다 감소의 위험을 최소화하기 위해 글리코겐을 사용하는 것이 권장된다전자는 수율이 낮은 것으로 판단하는 다른 이유입니다.
대표적인 DNA 샘플의 외관 검사 (도 1)는 추출한 DNA 크게 모든 타액 DNA 추출 절차 단편화되지 않았다는 것을 나타내는 것이 아니라 저하 된 DNA 나타내는 번짐없이 적절한 고 분자량의 밴드를 나타내었다. 의 RNase 소화 후 프로토콜은 1.74의 평균 260/280 생산.
타액 유래 DNA의 1 품질 도표. 포 추출 절차는 동일 타액 컬렉션에 적용 하였다. (A) 샘플은 0.8 % 아가 로스 겔 (250 NG의 DNA) 상에 전기 영동 하였다. 타액 DNA 추출 프로토콜의 모든 변화는 저하의 증거 높은 분자량 (> 20킬로바이트) DNA에 발생합니다. 레인 : 한 DNA의 laddeR, 2 및 3 Oragene 프리 피트 L2P 프로토콜 샘플, 4 & 5 젠트라 Puregene 체액 프로토콜, 6 및 7에 최적화 된 RNA 제거 단계없이 프로토콜, 8 및 9 RNA의 제거 단계와 최적화 된 프로토콜입니다. 레인 2-7 직접 같은 타액에 유사한 프로토콜입니다. 레인 8 및 9는 RNA 제거 단계는 DNA의 분해를 일으키지 않는 것을 알 수있다. (B) 샘플은 2 % 아가 로즈 젤 (150 NG의 DNA) 상에 전기 영동 하였다. 약간의 RNA 피크 7 (규칙 위)를 통해 차선이있는 젤의 맨 아래에있는 관측이다. 레인 8 및 9는 RNA 제거 단계의 효율성을 보여준다.
RNA 제거 단계 (의 RNase와 단계 3)은 DNA의 정확한 정량화 중요하다. 큐빗 2.0 형광에 의해 측정 된 RNA 이중 가닥 DNA의 비율에 의해 결정되는 테스팅 동안, 지속적으로 높은 RNA 함량이 관찰되었다. 샘플로부터의 RNase가없는 평균 핵산 함량을 치료 46.6 % (± 0.4) RN 이루어져큐빗 RNA의 검출 가능한 최저 읽기 인 "<20 NG / ㎖"로 판독 RNA 제거 단계를 시행 A. 샘플.
추가의 RNase가 단계인가시이 최적화 된 프로토콜을 통해 얻어진 DNA는 높은 처리량 시퀀싱 충분한 품질이었다. 타겟 데이터 시퀀싱을 달성하기 위해, 지정 애질런트 SureSelect 대상 보충 키트는 서열의 2.6 메가 바이트를 타겟팅, 24 샘플에 적용 하였다. 높은 처리량 시퀀싱은 레인 당 12 바코드 (인덱스) 샘플을 실시했다. 순서는 GATK 13베이스 품질 평가 점수의 재 교정, INDEL 재배치, 중복 제거, SNP의 발견과 24 개 샘플에서 동시에 유전형의 다음 응용 프로그램이 가장 좋은 방법은 하드 필터링 매개 변수를 사용하여 수행 된 hg19 참조 게놈 12 BWA 정렬 된 읽기 14 값. 모든 샘플은 24 고품질 NGS 데이터 (표 2)를 수득 하였다. 의 ILLU 전달 읽기미나의 표준 필터와 Q가 있었다> 20, 각 웰 샘플 드문 SNP 발견을위한 필요한 범위 내에서, Q> 100> 30 배 범위의 평균 타겟 커버리지 깊이를 제공 시퀀스 농축 대상 영역에 정렬 91.4 %. 평균 가닥 밸런스가 49.9 %이었다. Illumina의 마이크로 어레이 (microarray) 유전자형과 비교 변형 호출은 98.9 %의 일치율을 얻었다.
| 후보 변수 | NG / μL | 280 분의 260 | 230분의 260 |
| 소용돌이 | NS | -0.03 *** | NS |
| X30 분 세포 용해 배양 | 3.5 % ** | NS | NS |
| 테 K X10 | -8.7 % * | -0.05 *** | -0.03 *** |
| 30 분간 스핀 | 290.2 %*** | -0.05 *** | NS |
| 글리코겐 | NS | NS | -0.37 *** |
수량 / 품질 메트릭에 최적화 된 변수의 표 1 효과의 크기. 모든 효과의 크기는 열 머리글에 나와있는 단위이다. ANOVA에서 P-값 : * P는 <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; 중요하지 NS
| 품질 메트릭 | 값 |
| 대상 길이 | 1천7백8킬로바이트 |
| 대상> 30 배 대상 | 85.22 % |
| dbSNP의 SNP를 | 92.55 % |
| 배열 계약 | 98.99 % |
대상 심화 학습에서 높은 처리량 순서 표 2 품질.
| 새로운 최적화 된 프로토콜 | 상품 | DISTRIBUTER | 카탈로그 번호 | 구매 단위 | 비용 / 단위 | 비용 / 컬렉션 |
| 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 | 피셔 | 12-565-268 | 500 튜브 | $ 233.50 | $ 3.2690 | |
| 세포 용해 솔루션 | 퀴 아젠 | 158908 | 1 L | $ 401.00 | $ 3.2080 | |
| 테 K | 시그마 | P6556 | 1g | $ 713.00 | $ 1.5686 | |
| 단백질 침전 솔루션 | 퀴 아젠 | 158912 | 350 ml의 | $ 350.00 | $ 2.7200 | |
| 아이소 프로필 알코올 | 피셔 | A416-4 | 4 × 4 L의 사례 | $ 486.71 | $ 0.2434 | |
| 글리코겐 용액 (20 ㎎ / ㎖) | EZ-티브 바이오 리서치 | S1003 | 1 ML | $ 51.00 | $ 0.8160 | |
| 70 % 에탄올 | 피셔 | 04-355-305 | 4 × 1 갤런의 케이스. | $ 123.03 | $ 0.0325 | |
| 트리스-EDTA (TE) | 피셔 | BP2473-1 | 1 L | $ 68.67 | $ 0.0412 | |
| 염화나트륨 | 피셔 | AC194090010 | 1kg | $ 34.65 | $ 0.000004 | |
| 트리스 염산 | 피셔 | BP1757-100 | 100 ml의 | $ 57.84 | $ 0.0116 | |
| EDTA (0.5 M) 솔루션 | 피셔 | 03-500-506 | 100 ml의 | $ 33.60 | $ 0.0134 | |
| 나트륨 도드ecyl 황산염 | 피셔 | BP166-100 | 100g | $ 59.95 | $ 0.0060 | |
| 총 비용 | $ 11.93 | |||||
| Oragene | 상품 | DISTRIBUTER | 카탈로그 번호 | 구매 단위 | 비용 / 단위 | 비용 / 컬렉션 |
| 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 | 피셔 | 12-565-268 | 500 튜브 | $ 233.50 | $ 0.9340 | |
| 100 % 에탄올 | 피셔 | BP2818-100 | 100 ml의 | $ 34.29 | $ 1.6459 | |
| 70 % 에탄올 | 피셔 | 04-355-305 | 4 × 1 갤런의 케이스. | $ 123.03 | $ 0.0081 | |
| 트리스-EDTA (TE) | 피셔 | BP2473-1 | 1 L | $ 68.67 | $ 0.0687 | |
| 1.5 ML 튜브 | 제네시 | 22-281A | 500 튜브 | $ 22.85 | $ 0.0457 | |
| Oragene 컬렉션 KIT | Oragene | OG-500 | 1 | $ 25.00 | $ 25.00 | |
| 총 비용 | $ 27.70 | |||||
| Puregene | 상품 | DISTRIBUTER | 카탈로그 번호 | 구매 단위 | 비용 / 단위 | 비용 / 컬렉션 |
| 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 | 피셔 | 12-565-268 | 500 튜브 $ 233.50 | $ 0.9340 | ||
| 세포 용해 솔루션 | 퀴 아젠 | 158908 | 1 L | $ 401.00 | $ 4.0100 | |
| 테 K | 퀴 아젠 | 158918 | 650 ml의 | $ 73.10 | $ 7.8723 | |
| 단백질 침전 솔루션 | 퀴 아젠 | 158912 | 350 ml의 | $ 350.00 | $ 4.0000 | |
| 아이소 프로필 알코올 | 피셔 | A4164 | 4 × 4 L의 사례 | $ 486.71 | $ 0.3650 | |
| 글리코겐 솔루션 | 퀴 아젠 | 158930 | 500 ml의 | $ 64.30 | $ 2.5720 | |
| 70 % 에탄올 | 피셔 | 04-355-305 | 4 × 1 갤런의 케이스. | $ 123.03 | $ 0.0975 | |
| DNA 수화 솔루션 | 퀴 아젠 | 158914 | 100 ml의 | $ 69.80 | $ 0.1396 | |
| 염화나트륨 | 피셔 | AC19409-0010 | 1kg | $ 34.65 | $ 0.000004 | |
| 트리스 염산 | 피셔 | BP1757-100 | 100 ml의 | $ 57.84 | $ 0.0116 | |
| EDTA (0.5 M) 솔루션 | 피셔 | 03-500-506 | 100 ml의 | $ 33.60 | $ 0.0134 | |
| 나트륨 도데 실 황산염 | 피셔 | BP166-100 | 100g | $ 59.95 | $ 0.0060 | |
| 총 비용 | $ 19.99 |
최적화 된 프로토콜의 표 3 비용 비교 다른 상업적으로 이용 가능한 프로토콜 전체 침 2 ㎖에서 DNA를 추출합니다.DNA 추출에 필요한 LL 시약 및 소모품은 9 월 30 일로 인터넷에서 사용할 표준 목록 가격을 사용하여 평가 한이 프로토콜은 전체 타액의 1.25 ㎖ (에서 DNA를 추출하기 위해 작성되어 2013 년 주 즉, 타액 및 버퍼의 2.5 ML 이 값이 타액 포집 관에서 총 부피의 절반을 의미로서) 단계 2.3 참조. 가격 비교를 위해 2 ml를이 공통 시판 키트 (Oragene)와 연결된 양이기 때문에 선택되었다.
| DNA 안정화 버퍼 (250 ㎖) | ||
| 구성 요소 | 볼륨 (ML) | [최종] |
| 1 M의 NaCl | 1.461 g | 0.1 M |
| 트리스 염산 | 2.5 | 0.01 M |
| 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 5 | 0.01 M |
| 10 % SDS | 12.5 </ TD> | 0.014 M |
| 테 K 용액 (20 ㎎ / ㎖) | 2.5 | 6.92x10 -6 M |
| DDH 2 O | 227.5 | |
| 테 K 용액 (20 ㎎ / ㎖) | ||
| 구성 요소 | 볼륨 (ML) | [최종] |
| 테 K 분말 | 500 mg의 | 6.92x10 -4 M |
| DDH 2 O | 25 | |
| 70 % 에탄올 (500 ㎖) | ||
| 구성 요소 | 볼륨 (ML) | [최종] |
| 에탄올 95 % | 368.5 | 12.63 M |
| DDH 2 O | 131.5 | |
표 시약 4 조리법.
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Discussion
본 절차는 상당히 DNA의 품질을 손상시키지 않고, 표준 방법에 비해 고 분자량 DNA의 수율이 향상되었다 최적화 DNA 추출 프로토콜이다. 수율을 최대한에 가장 큰 효과 중요한 단계 널리 11을 배포하지 않은 일을 제외하고, 여기에서 검토 게시 된 프로토콜에 비해 에탄올 침전 동안 이상 원심 분리 단계를 포함하는 단계 5.2였다. 이 이상 원심 분리와 관련된 DNA 품질의 변경은 전체 타액 컬렉션에서 사용할 수있는 DNA의 대부분은 분자량 저하와 높은이 불가능하다는 것을 나타냄 검출되지 않았다.
항목 타액 컬렉션은 수집 단계에서 최소화되어야 외래 오염물에 대한 잠재, 및 하부 감염의 징후 일 수있다 시료 과도한 단백질의 존재로 샘플 품질에 한계가있다. 단백질이나 이물질 오염 물질의 다량의 수하여 정량화가 부정확하고 최종 추출 된 DNA에 남아있다. 재수 화 (단계 6)이 의심 된 후 잔여 단백질이나 오염이있는 경우, 샘플은 샘플 입력 볼륨을 반영하기 위해 스케일 시약 볼륨이 단백질 침전 단계에서 시작하여 수행 될 수 정리. 프로토콜의 다른 제한 단계를 수행하는 데 필요한 시간의 길이이다. 여러 샘플들은 병렬로 실행될 수있다; 그러나, 그것은 더 이상 24 병렬 추출을 동시에 실행하지하는 것이 좋습니다. 이 샘플이 꽉 펠릿 다시 용해에 펠릿 시간을 허용 할 수 있습니다 24 개 이상의 샘플을 실행을 보장하기 위해 차가운 남아 있어야 단백질 침전 단계에 특히 중요하다.
여기에 제시된 프로토콜 간주 가장 비용 효과적인 방법 (표 3 참조). 이 프로토콜은 Puregene 추출 키트에서 사용 시약 않지만, Puregene 프로토콜 추천보다 작은 부피를 사용추출 수율을 저하시키지 않고 그리고 그 프로토콜을 기준으로 비용 절감을 구동 시약의 감소이다. 추출을위한 계산 된 비용은 각 항목에 대한 공시 가격을 사용하고 어떤 할인을 반영하지 않습니다. 최적화 된 프로토콜로 추출 당 비용은 회사의 영업 사원을 통해 더 대량 주문 또는 할인과 감소 될 수있다.
증거가이 프로토콜은 차세대 시퀀싱에 사용하기에 적합한 것을 제공하고있다. 얻어진 데이터는 피가 일상적으로 사용할 수없는 많은 질병에서 인간 유전학 연구를위한 타액 샘플 유틸리티의 추가 증거를 제공합니다. 혈액과 세포 라인 파생 된 DNA는 시험하기에 유전 물질의 적절한 소스로 계속하는 동안 같은 소스를 사용할 수없는 경우, 전체 타액 수집이 실행 가능한 대안이며, 환자 등록이 자신의 수집 또는 정맥 절개에 의해 영향을 사용할 수 실용적이지 수 없습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
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