Introduction
Verkrijgen van hoge kwaliteit DNA voor menselijke genetische studies is essentieel in de ziektegen ontdekkingsproces. Blood, maar die een invasieve procedure en ook duurder dan speeksel collectie, de voorkeur voor het maken geïmmortaliseerde cellijnen als een onuitputtelijke bron van DNA of iPSCs voor functionele studies en soms bloed DNA wordt gebruikt wanneer cellijnen beschikbaar. Echter, het verkrijgen van bloed vereist een getrainde phlebotomist en bloed heeft een kortere halfwaardetijd dan speeksel 1. DNA van speeksel is goedkoper en gemakkelijker te verkrijgen, omdat het kan worden opgehaald en verzonden via de mail zonder de noodzaak van een phlebotomist, waardoor de potentiële proefpersoon zwembaden ver buiten het stroomgebied van ziekenhuizen en laboratoria 2. Studie inschrijving kan worden verbeterd wanneer proefpersonen de mogelijkheid van het geven van een speeksel monster in plaats van bloed 3, 4. Zorgen over de kwantiteit en kwaliteit van het DNA uit speeksel kunnen hebben beperkt het wijdverbreide onse ondanks talrijke studies recente studies die de geschiktheid van speeksel, met een gemiddelde van 4,3 x 10 5 cellen per milliliter, voor het testen van DNA via oudere speekselmonsters methoden waarbij geen significante hoeveelheden speeksel 2, 3, 4, 5 hebben verkregen, 6. Terwijl een bescheiden literatuur bestaat die de geschiktheid van de hele speeksel afgeleide DNA voor genotypering toepassingen, waaronder-microarray gebaseerde methoden 8, 9, 10, geen studies hebben onderzocht next generation sequencing (NGS). Het doel voor het optimaliseren van deze hele speeksel DNA-extractie protocol was om kwantiteit en kwaliteit voor de genetica toepassingen te maximaliseren in een kosteneffectieve manier die gemakkelijk wordt uitgevoerd in laboratoria met gemeenschappelijke reagentia en verbruiksgoederen.
DNA-extractie van speeksel vereist een aantal procedures: 1) het verzamelen en opslaan, 2) cellysis, 3) RNase behandeling, 4) eiwitprecipitatie, 5) ethanolprecipitatie, 6) DNA rehydratatie. De DNA Stabilization Buffer oplossing, beschrevenvoorheen 2, adequaat functioneert zonder wijziging. Geen poging de RNase behandeling en DNA stappen rehydratatie optimaliseren gemaakt. Voor elke stap die nog overblijft, werden verschillende variabelen die van invloed kunnen de opbrengst geïdentificeerd. Elke variabele werd individueel gemanipuleerd en verbetering van opbrengst en kwaliteit werd statistisch onderzocht. Voor variabelen die werden naar opbrengst en / of DNA te verbeteren, worden de optimale waarden in de definitieve protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Voorafgaand aan het verstrekken van speeksel alle proefpersonen gaven informed consent die voldoen aan de richtlijnen voor de behandeling van menselijke proefpersonen bij Nationwide Children's Hospital.
1 Speeksel Collection en opslag
- Voorafgaand aan speeksel verzamelen, zorgen dat de mond van het onderwerp is vrij van voedsel of andere vreemde stoffen door het hebben van het onderwerp van hun mond te spoelen met water en het vermijden van het eten of drinken gedurende 30 minuten voor het verzamelen van het monster.
- Open een 15 ml centrifugebuis met 2,5 ml van het DNA stabilisatie buffer 2 en zorg ervoor om te voorkomen dat het aanraken van de binnenkant van de dop of buis, en hebben het onderwerp spuwen 2,5 ml speeksel in de bufferoplossing. Opmerking: Het verzamelen van meer dan 2,5 ml speeksel kan leiden tot degradatie van een monster onvoldoende verhouding van monster DNA stabilisatie buffer. Het verzamelen van te weinig speeksel zal verwachte opbrengsten van het protocol te verminderen. Om collectie volumes te evalueren, gebruiken de genummerde hellingen aan de kant van thij tube.
- Plaats de dop en meng door omkeren tot het mengsel wordt gehomogeniseerd. Krachtig schudden is niet noodzakelijk. Bewaar de monsters bij kamertemperatuur kortstondige opslag of 4 ° C voor langdurige opslag (> 3 maanden).
2 eerste voorbereidingen en cellysis
- Voorafgaand aan het starten van de winning, warmte een waterbad tot 37 ° C, en voor te bereiden een ijsemmer. Drie 15 ml conische centrifugebuizen nodig zal zijn voor elke gewonnen monster. De drie buizen worden gebruikt om de cel en eiwit pellet, de laatste geëxtraheerde gDNA, en isopropanol en ethanol supernatanten houden.
- Ophalen monsters uit de opslag, en omkeren monsters meerdere keren vervolgens vortex met gemiddelde snelheid gedurende 15 sec.
- Verdeel 2,5 ml monster in een schone centrifugebuis van 15 ml en voeg 5 ml Cell Lysis Solution. Meng het monster 50 maal door omkeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3 RNA verwijderen
- Voeg 40 gl RNase A Solution bij 100 mg / ml en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Verwijder het monster uit het 37 ° C waterbad koel op ijs gedurende 3 minuten.
- Na RNase A incubatie, verhoog de temperatuur van het waterbad tot 65 ° C voor het DNA rehydratatie stap van het protocol.
4 Eiwit en Lipid Removal
- Voeg 50 pl Proteinase K oplossing 20 mg / ml, meng meerdere malen door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Opmerking: Dit is een mogelijke pauzeren punt voor het protocol. Na de toevoeging van het proteïnase K-oplossing kan het monster bij 4 ° C opgeslagen tot de extractie kan worden voltooid. Opslag bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur werd niet aangetoond dat het een significant effect op de extractie rendement of de DNA-kwaliteit hebben. Langdurige opslag in dit stadium nog niet is geëvalueerd.
- Voeg 1,7 ml Protein Precipitation Solution, vortex krachtig gedurende 20 seconden bij hoge snelheid en plaats op ijs gedurende 10 minuten. Wanneer de monsters op ijs afgekoeld gedurende 10 min gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 3000 xg en 4 ° C. De geprecipiteerde eiwitten dient een hecht pellet blijven. Als de pellet is niet strak of de oplossing nog troebel is, kunnen de monsters op ijs gekoeld worden gedurende 5 minuten meer en centrifugeren herhaald. De monsters moeten worden bewaard op ijs om een strakke pellet garanderen.
5 Isolatie en zuivering van gDNA
- In een schone 15 ml centrifugebuis Pipetteer 5 ml isopropanol en 8 pi zuivere Glycogeen oplossing bij 20 mg / ml.
- Giet het supernatant dat het gDNA van stap 4.3 in de buis met de Isopropanol en Glycogen Solution, achterlating het neergeslagen proteïne pellet. Nadat de supernatant toegevoegd, meng het monster 50 maal door omkeren en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 3000 xg en 4 ° C.
- Giet de supernatant langzaam in een schone 15 ml buis. Na verwijdering van het supernatant, voeg 1 ml 70% ethanolWas de pellet door langzaam schommelen en voorzichtig bewegen ethanol via pellet neergeslagen meerdere malen. Bewaar de ethanol in de buis.
- Na de eerste wasbeurt, centrifugeer het monster gedurende 1 min bij 2000 xg en 20 ° C. Deze centrifugatiestap kan bij hetzij 4 ° C of 20 ° C. Geen significant effect van temperatuur is aangetoond voor deze stap.
- Na de eerste wassen en centrifugeren van de pellet, giet langzaam de ethanol te wassen uit de tube en weggooien, vervolgens een tweede wasbeurt door herhalen van de stappen 5.3 en 5.4.
- Na verwijdering van het supernatant van de tweede wasbeurt, de pellet aan de lucht drogen gedurende 15 minuten.
- Als het monster is niet helemaal droog, de lucht drogen voor nog eens 15 minuten.
6 Rehydratatie van gDNA
- Nadat het monster is gedroogd, voeg 300 ul Tris-EDTA op de gedroogde pellet gDNA hydrateren.
- Vortex het monster gedurende 5 sec met gemiddelde snelheid en plaats in een65 ° C waterbad gedurende 1 uur.
- Verwijder de monsters uit het waterbad en incubeer O / N bij kamertemperatuur.
Opmerking: Alle producten en reagentia gebruikte materialen in de tabel vermelde, en Tabel 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de optimale parameters te bepalen voor DNA-extractie van een reeks gekoppelde DNA extracties werd uitgevoerd. Een enkele speeksel monster werd gesplitst en elk deel daarop een van twee mogelijke waarden voor een gegeven variabele. Ten minste acht replicaten van elke gepaarde proef uitgevoerd (bijvoorbeeld, werd een speeksel monster porties verdeeld extractie testen met en zonder initiële 50 ° C incubatie). Optimalisatie is gebaseerd op vier standaard metrics: totale DNA opbrengst, de 260/280 waarde, de waarde 260/230, en de visuele inspectie van de elektroforese van DNA fragmentatie beoordelen. Niet alle mogelijke combinaties van de variabelen werden beoordeeld statistische interacties (N = 169 combinaties) hij gekozen tot de marginale effect van iedere variabele afzonderlijk beoordelen. Effecten werden getest met behulp van een multi-way herhaalde metingen ANOVA en de geschatte effecten zijn afgeleid van de equivalente regressievergelijking. Alle significante effecten worden samengevat in Tabel 1 getoond als averleeftijd verandering in opbrengst (ng / ul per ml speeksel input) of DNA-kwaliteit (260/280 en 260/230).
Cell lysis (stap 2) werd geoptimaliseerd door het bepalen: 1) de aanwezigheid / afwezigheid van 50 ° C incubatie (1 uur) voorafgaand aan cellysis zodat Proteinase K afbraak en cellysis gemedieerd door de opslagbuffer ging voltooid, 2 ) de aanwezigheid / afwezigheid van een homogenisatie door vortexen stap (medium snelheid 15 sec), en 3) lysisoplossing incubatietijd (5 versus 30 min). De 30 min cellysis incubatie verhoogde opbrengst met gemiddeld 3,5% (p <.01), maar geen andere cel lysis variabele had een significant effect op de opbrengst. Vortexen daalde de verhouding 260/280 door een statistisch significant (p <0,001) maar praktisch klein 0.03.
Eiwitneerslag (stap 4) wordt voorafgegaan door Proteinase K digestie met aminozuur ketens verstoren, verbetering eiwitprecipitatie efficiency en loslaten gevangen DNA. De hoeveelheid Proteinase K werd gevarieerd tienvoudig.Centrifugeren temperatuur werd verlaagd van 20 ° C tot 4 ° C. Het verhogen van Proteinase K veroorzaakte een statistisch significante afname in opbrengst (8,7%) en enigszins verbeterde zowel de 260/280 en 260/230 ratio.
Ethanolprecipitatie (stap 5) werd de laatste fase van de onderzochte protocol. De hoeveelheid glycogeen drager (0, 8 pl) was gevarieerd, zoals de totale centrifugeertijd (5 tegen 30 min 11) was. Alleen centrifugeertijd significant beïnvloed opbrengst, met een gemiddelde stijging van 290%. Hoe langer draaien daalde ook de 260/280 verhouding iets (0,05). Geen significant effect op de opbrengst van glycogeen werd waargenomen tijdens de experimenten; hoewel de totale hoeveelheid DNA in deze extracties was voldoende groot dat glycogeen niet kenmerkend worden gebruikt. Ondanks het ontbreken van effect in deze monsters, is het nog steeds aanbevolen om glycogeen te gebruiken om het risico van verminderde opbrengsten minimaliseren wanneer speeksel ingang volume kleiner is dan hier of ther gegevene is een andere reden om te geloven dat de opbrengst zal laag zijn.
Visuele inspectie van de representatieve DNA monsters (figuur 1) geeft aan dat het geëxtraheerde DNA niet sterk gefragmenteerd voor speeksel DNA extractie procedure, maar vertoonden een passend hoog molecuulgewicht band zonder uitsmeren indicatief afgebroken DNA. Na RNase A spijsvertering, het protocol produceerde een gemiddelde van 260/280 1.74.
Figuur 1 Kwaliteit van speeksel afgeleide DNA. Vier extractie procedures werden toegepast op dezelfde speeksel collectie. (A) Monsters werden op een 0,8% agarose gel (250 ng DNA). Alle varianten van het speeksel DNA extractie protocollen tot hoog molecuulgewicht (> 20 kb) DNA, zonder bewijs van afbraak. Lane: 1 DNA ladder, 2 & 3 Oragene prepIT L2P Protocol monsters 4 en 5 Gentra Puregene lichaamsvloeistoffen Protocol, 6 en 7 de geoptimaliseerde protocol zonder RNA verwijderingsstap, 8 en 9 de geoptimaliseerde protocol met de RNA verwijderen stap. Lanen 2-7 zijn direct analoog protocollen op dezelfde speeksel monsters. Lanen 8 en 9 blijkt dat de RNA verwijderingsstap DNA degradatie niet te introduceren. (B) Monsters werden op een 2% agarose gel (150 ng DNA). Een kleine RNA piek waargenomen dichtbij de bodem van de gel in lanen 2 tot 7 (verdragen hierboven). Lanen 8 en 9 tonen de doeltreffendheid van de RNA verwijderingsstap.
De RNA Verwijdering Step (stap 3 met RNase A) is essentieel voor kwantificatie van DNA. Tijdens het testen werd constant hoge RNA inhoud waargenomen, zoals bepaald door de verhouding van dubbelstrengs DNA RNA gemeten door een Qubit 2.0 Fluorometer. Gemiddeld nucleïnezuur content van monsters zonder RNase bestond Een behandeling van 46,6% (± 0,4) RNA. Monsters die de RNA Verwijdering Step gelezen "<20 ng / ml", wat de laagste mogelijke lezing qubit het RNA detectie onderging.
De verkregen door middel van deze geoptimaliseerde protocol DNA was van voldoende kwaliteit zijn voor high throughput sequencing wanneer de extra RNase was een stap toegepast. Om gerichte resequencing gegevens te bereiken, werd een aangepaste Agilent SureSelect Target Enrichment kit toegepast op 24 monsters, targeting 2.6 Mb van sequence. High throughput sequencing werd uitgevoerd op 12 barcodes (geïndexeerd) monsters per rijstrook. Sequence leest werden BWA-afgestemd op de hg19 verwijzing genoom 12, dan is de toepassing van GATK 13 basiskwaliteit score herijking, indel herschikking, dubbele verwijderen, SNP detectie en genotypering gelijktijdig in alle 24 monsters werd uitgevoerd met behulp van de best practice harde filtering parameter waarden 14. Alle 24 monsters leverden hoge kwaliteit NGS (tabel 2). Of leest dat doorgegeven Illumina's standaard filters en had Q> 20, 91,4% afgestemd op de volgorde verrijking doelgebieden, die een gemiddelde dekking diepte van> 30x dekking on-target bij Q> 100, ruim binnen de vereiste limieten voor zeldzame SNP ontdekking in elk monster. De gemiddelde streng balans was 49,9%. Vergelijken variant gesprekken met Illumina microarray genotypes leverde een concordantie van 98,9%.
| Kandidaat Variable | ng / gl | 260/280 | 260/230 |
| Vortex | ns | -0.03 *** | ns |
| x30 min Cellysis Incubation | 3,5% ** | ns | ns |
| Proteinase K x10 | -8.7% * | -0.05 *** | -0.03 *** |
| 30 min centrifugeren | 290,2%*** | -0.05 *** | ns |
| Glycogeen | ns | ns | -0.37 *** |
Tabel 1: Effect Grootte van Geoptimaliseerd Variabele op Hoeveelheid / Kwaliteit Metrics. Alle effect maten zijn in de in de kolom header opgenomen eenheden. p-waarden uit ANOVA: * p <0,05; ** P <.01; *** P <.001; ns niet significant
| Kwaliteit Metric | Waarde |
| Doel lengte | 1.708 kb |
| Doel Overdekte> 30x | 85,22% |
| SNPs in dbSNP | 92.55% |
| Array overeenkomst | 98.99% |
Tabel 2: Kwaliteit van High Throughput Sequence van Target Verrijking.
| Nieuwe Optimized Protocol | Item | Distributeur | Catalog # | Inkoop Unit | Kosten / eenheid | Kosten / Collectie |
| 15 ml Centrifugeglazen | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 3,2690 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 L | $ 401,00 | $ 3,2080 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | 1 g | $ 713,00 | $ 1,5686 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 2,7200 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | Geval van 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,2434 | |
| Glycogeen Solution (20 mg / ml) | EZ-Bioresearch | S1003 | 1 ml | $ 51,00 | $ 0,8160 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | Bij 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0325 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0412 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) oplossing | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Natrium Dodecyl sulfaat | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Total Cost | $ 11,93 | |||||
| Oragene | Item | Distributeur | Catalog # | Inkoop Unit | Kosten / eenheid | Kosten / Collectie |
| 15 ml Centrifugeglazen | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 0,9340 | |
| 100% Ethanol | Fisher | BP2818-100 | 100 ml | $ 34,29 | $ 1,6459 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | Bij 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0081 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0687 | |
| 1.5 ml buisje | Genesee | 22-281A | 500 Tubes | $ 22,85 | $ 0,0457 | |
| Oragene Collection KIT | Oragene | OG-500 | 1 | $ 25,00 | $ 25,00 | |
| Total Cost | $ 27,70 | |||||
| Puregene | Item | Distributeur | Catalog # | Inkoop Unit | Kosten / eenheid | Kosten / Collectie |
| 15 ml Centrifugeglazen | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes $ 233,50 | $ 0,9340 | ||
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 L | $ 401,00 | $ 4,0100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158918 | 650 ml | $ 73,10 | $ 7,8723 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 4,0000 | |
| Isopropanol | Fisher | A4164 | Geval van 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,3650 | |
| Glycogeen Solution | Qiagen | 158930 | 500 ml | $ 64,30 | $ 2,5720 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | Bij 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0975 | |
| DNA Hydratatie Solution | Qiagen | 158914 | 100 ml | $ 69,80 | $ 0,1396 | |
| NaCl | Fisher | AC19409-0010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) oplossing | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Total Cost | $ 19,99 |
Tabel 3 Kostenvergelijking van de geoptimaliseerde protocol DNA extraheren uit 2 ml speeksel met andere commercieel beschikbare protocollen. All reagentia en verbruiksgoederen die nodig zijn voor DNA-extractie zijn beoordeeld met behulp van standaard catalogusprijzen beschikbaar op het internet op 30 september, 2013 Merk op dat dit protocol is geschreven om DNA te extraheren uit 1,25 ml speeksel (dwz 2,5 ml speeksel en buffer , zie stap 2.3) als deze waarde vertegenwoordigt de helft van het totale volume in het speeksel verzamelbuis. Voor de kosten vergelijking werd 2 ml gekozen als zijnde een bedrag geassocieerd met een gemeenschappelijke commercieel verkrijgbare kit (Oragene).
| DNA Stabilization Buffer (250 ml) | ||
| Component | Volume (ml) | [Final] |
| 1 M NaCl | 1.461 g | 0.1 M |
| Tris HCl | 2,5 | 0.01 M |
| 0.5M EDTA | 5 | 0.01 M |
| 10% SDS | 12.5 </ Td> | 0.014 M |
| Proteinase K oplossing (20 mg / ml) | 2,5 | 6.92x10 -6 M |
| DDH 2 O | 227.5 | |
| Proteinase K oplossing (20 mg / ml) | ||
| Component | Volume (ml) | [Final] |
| Proteinase K powder | 500 mg | 6.92x10 -4 M |
| DDH 2 O | 25 | |
| 70% ethanol (500 ml) | ||
| Component | Volume (ml) | [Final] |
| Ethanol 95% | 368,5 | 12.63 M |
| DDH 2 O | 131,5 | |
Tabel 4 Recepten voor Reagentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze procedure is een geoptimaliseerde DNA-extractie protocol aanzienlijk verbeterd rendement van hoog moleculair gewicht DNA vergeleken met standaard werkwijzen, zonder dat DNA kwaliteit. De kritische stap met het grootste effect op de opbrengst van de meest was stap 5.2, die een langere centrifugatiestap tijdens ethanolprecipitatie dan elke gepubliceerde protocol hier beoordeeld, behalve een die niet op grote schaal werd verspreid 11 bevat. Geen veranderingen in DNA kwaliteit waaraan deze langere centrifugatie werden gedetecteerd, wat aangeeft dat de meeste beschikbare DNA van speeksel ophaling niet afgebroken en hoog molecuulgewicht.
Speeksel collectie heeft beperkingen monster zodanige kwaliteit dat het potentieel voor vreemde verontreinigingen, die moet worden geminimaliseerd bij de gegevensverzameling, en de aanwezigheid van overmatige eiwit in het monster dat een teken van een onderliggende infectie kan zijn. Grote hoeveelheden eiwit of buitenlandse verontreinigingen kanblijven de laatste geëxtraheerde DNA waardoor kwantificatie onnauwkeurig maken. Als er overblijvende eiwitten of verontreinigingen na rehydratatie (stap 6) wordt vermoed, een steekproef schoonmaak kan worden uitgevoerd door te beginnen bij de proteïne neerslaan met reagensvolumes geschaald om het monster invoervolume weerspiegelen. Een andere beperking van het protocol is de tijd vereist om de stappen uit te voeren. Meerdere monsters kan worden uitgevoerd in parallel; echter, is het aanbevolen om niet meer dan 24 parallelle extracties tegelijk worden uitgevoerd. Dit is vooral van belang voor het eiwit precipitatiestap, waar het monster koude naar een strakke pellet en actief meer dan 24 monsters pellets tijd te geven om opnieuw oplossen waarborgen moet blijven.
De hier gepresenteerde protocol is de meest kosteneffectieve methode beschouwd (zie tabel 3). Hoewel dit protocol doet klare reagentia van de Puregene extractie kit, is een kleiner volume dan aanbevolen in de Puregene gebruikte protocolzonder afbreuk extractieopbrengst en het is deze reductie van reagentia een kostenbesparing ten opzichte van het protocol aandrijft. Merk op dat de berekende kosten voor de extractie gebruikt de catalogusprijs voor elk item en geen kortingen te geven. De kosten per extractie met de geoptimaliseerde protocol kan verder met bulk orders of kortingen via vertegenwoordigers bedrijf verkopen worden verminderd.
Bewijs is ook voorzien dat dit protocol is geschikt voor de volgende generatie sequencing. De verkregen gegevens levert verder bewijs van het nut van speeksel monsters voor menselijke genetica onderzoek bij vele ziekten waarbij bloed niet routinematig beschikbaar. Terwijl het bloed en cellijn afgeleide DNA blijft de favoriete bron van genetisch materiaal voor het testen zijn, geheel speeksel collectie is een goed alternatief wanneer deze bronnen niet beschikbaar zijn, wanneer de patiënt inschrijving wordt beïnvloed door hun collectie of aderlatingen niet beschikbaar is of onpraktisch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
