Abstract
In intern bemesten dieren wordt zaadvocht meestal toegevoegd aan de spermatozoa, vormen samen het sperma of ejaculaat. Naast voedende en activeren sperma kunnen de componenten in de zaadvloeistof ook invloed vrouwelijke fysiologie bevruchting succes van het sperma donor vergroten. Terwijl veel studies dergelijke effecten in soorten met gescheiden seksen hebben gemeld, hebben weinig studies dit aangepakt gelijktijdig hermafrodiete dieren. Deze video protocol presenteert een methode om effecten van zaadvloeistof in buikpotigen bestuderen, met behulp van een gelijktijdig hermafrodiete zoetwaterslak, de grote vijver Lymnaea stagnalis, als modelorganisme. Terwijl de procedure wordt gegeven met volledige prostaatklier extracten kunnen individuele componenten (dat wil zeggen, eiwitten, peptiden, en andere verbindingen) van de zaadvloeistof getest op dezelfde manier. Effecten van de ontvangst van het ejaculaat componenten op de eileg kan worden gekwantificeerd in termen van frequentie van de eileg ensubtieler schattingen van vrouwelijke reproductieve prestaties zoals ei nummers binnen elk ei massa. Resultaten tonen aan dat zaadvocht eiwitten beïnvloeden vrouwelijke reproductieve output in deze simultaan hermafrodiet, met de nadruk hun belang voor seksuele selectie.
Introduction
Bij overdracht worden spermatozoa meestal vergezeld van rudimentaire vloeistof geproduceerd door mannelijke accessoire klieren. Terwijl sommige ejaculaat componenten een rol spelen in het voeden en het activeren van sperma 1, anderen te beïnvloeden vrouwelijke fysiologie om bevruchting succes van de spermadonor 2-4 te verhogen. Dergelijke effecten zijn speciaal geselecteerd voor, via seksuele selectie, als een soort is zeer promiscue en heeft efficiënte sperma opslag en sperma spijsvertering. Onder dergelijke omstandigheden, sperma donoren zwaar strijden om de bevruchting van eieren 5. Hoewel er een overvloedige correlationeel bewijs voor het belang van het zaadvocht stoffen voor mannelijke bevruchting succes, direct bewijs is meer zeldzaam en weinig studies hebben zich verdiept in de details van de fysiologische veranderingen en / of stoffen 6.
Bij soorten met gescheiden seksen (dwz, mannetjes en vrouwtjes; gonochorists) zijn er een paar goed onderzocht model species als het gaat om zaadvloeistof samenstelling en hun effecten. Voorbeelden hiervan zijn de fruitvlieg, Drosophila melanogaster 6, de malariamug, Anopheles gambiae 7, en de rode bloem kever, Tribolium castaneum 8. Dergelijke zaadvloeistof studies zijn veel zeldzamer als het gaat om soorten die tegelijkertijd hermafrodiete (dwz individuen functioneel mannelijk en vrouwelijk tegelijk), hoewel deze wijze van voortplanting is gebruikelijk in het dierenrijk 9. De meest opvallende hermafrodiete voorbeeld van de overdracht van een accessoire klier stof is waarschijnlijk het neerschieten van zogenaamde liefde-darts in landslakken 2,10, waar de stof wordt overgebracht door de spermadonor via onderhuidse injectie 11,12, dat wil zeggen, niet samen met de spermatozoa. Maar er zijn veel simultaan hermafrodieten dat mannelijke accessoire klier producten dragen samen met hun sperma,zoals het model soort hier gebruikt, de grote vijver Lymnaea stagnalis. Eerder onderzoek heeft al aangetoond dat de ontvangst van zaadvocht beïnvloedt de vrouwelijke reproductieve output van deze soort 13-15, en een aantal van de betrokken zaadvocht eiwitten geïdentificeerd 16,17.
De algemene doelstelling van dit protocol, dat is een uitbreiding van de methoden vermeld in Koene et al. 16, is aan de gevolgen van zaadvloeistof eiwitten op verschillende parameters van de eileg in buikpotigen testen. Dit wordt bereikt door dissectie van de prostaat (dwz de mannelijke accessoire klier produceert het zaadvocht) van seksueel geïsoleerd donor slakken uit een gestandaardiseerde laboratorium cultuur. Ten tweede wordt het sperma donor vanuit de zaadblaasjes en de verschillende behandelingsmogelijkheden gemaakt. Vervolgens worden testen slakken verdoofd en intravaginally geïnjecteerd met een testoplossing (bijvoorbeeldprostaatklier extract alleen, prostaat-extract met zaadcellen, alleen, vervoerder alleen medium). Deze proef slakken worden vervolgens gecontroleerd op de volgende dagen tot weken, onder normale omstandigheden, tot het leggen van eieren te leggen. Ei massa's worden verzameld, digitaal gescand voor het tellen en meten van diverse parameters, en vervolgens in individuele flesjes voor het uitkomen. Na ongeveer twee weken zijn de jongen geteld en digitaal gescand. Alle scans, zowel ei massa en jongen, worden vervolgens geanalyseerd met een vrij verkrijgbare beeldanalyse softwarepakket.
Voor dit protocol het laboratorium stam van de grote vijver slak, Lymnaea stagnalis, wordt gebruikt, die wordt gekweekt aan de Vrije Universiteit in Amsterdam. Deze soort dient als een modelsysteem voor het onderzoeken van vragen over seksuele selectie en voortplanting bij hermafrodieten. Relatief grote omvang van het dier maakt het experimenteel zeer toegankelijk. Bovendien, omdat het wordt gebruikt als model species in vele biological disciplines weten we al veel over de fundamentele biologie van deze dieren. Deze methode zal helpen om vragen over processen van seksuele selectie die worden gemedieerd via zaadvocht eiwitten in het algemeen te bestuderen. Bovendien, omdat deze simultaan hermafrodieten, is het mogelijk aan te pakken of dergelijke proteïnen zijn in soortgelijke en / of verschillende manieren zoals in soorten waarvoor de geslachten gescheiden 16,17.
Protocol
1. Fokkerij
- Verkrijgen volwassen exemplaren van Lymnaea stagnalis (L.) uit een laboratorium cultuur zoals die aan de Vrije Universiteit.
- Handhaaf het lage koper water van 20 ° C in zowel de fokkerij (molluscarium) en experimentele tanks, die continue water uitwisseling hebben.
- Zet de licht / donker cyclus bij 12 uur: 12 uur.
- Voor de fokkerij, voeden de volwassen slakken onbespoten sla ad libitum, voeden de jonge jongeren met TetraPhyll (visvoer) vlokken. Handhaaf slakken in aparte tanks volgens hun leeftijd, vanaf ei massa's die worden gelegd binnen een 24 uur tijdsbestek.
- Zodra slakken uit de kweekbakken ze niet teruggekeerd, de effecten van voorkomen hebben onder enigszins verschillende omstandigheden alsmede pseudoreplication voorkomen gehouden.
2. Dissection
- Isoleer de slakken voor 1 week, en voer ze ad libitum, naar tha zorgent ze vol sperma en zaadvocht winkels.
- Bereid een stereo-microscoop, een dissectie plaat met pinnen, kleine chirurgische schaar, grove en fijne tang, een 10 ml spuit gevuld met een 50 mM MgCl2 oplossing, injectienaalden (0,3 mm x 13 mm) en wat keukenpapier.
- Euthanaseren een slak door het injecteren van MgCl2-oplossing (meestal 3 ml of meer voor volwassen slakken met een schelp lengte van 31,6 ± 2,1 mm en nat gewicht van 2,89 ± 0,55 g). Doordringen in de voet met de injectienaald in een hoek van 45 ° en spuit door zachtjes druk uit te oefenen continu totdat de slak ontspant en blijft verlengd (binnen enkele seconden). Verwijder de injectienaald en controleer of de slak wordt gedood (bijvoorbeeld door te controleren of de tentakel terugtrekking reflex afwezig is).
- Verwijder voorzichtig de dop na de kromming door het gebruik van grof tang. Halverwege, voorzichtig los de columellar spier van het reservoir door schrapen met de tang. Draai zachtjes thij slak uit zijn schelp, het kronkelende richting van de schelp.
- Plaats de slak op de dissectie plaat en pin vaststelling van de achterkant van de voet. Plaats dan een pin door het hoofd en doe er wat spanning op de slak om dissectie vergemakkelijken.
- Lokaliseer de vrouwelijke gonopore, die later op een referentiepunt voor dissectie zal zijn.
- De chirurgische schaar en fijne tang, maken het eerste incisie net onder de rand van de mantel en snijd naar de vrouwelijke gonopore. Wanneer een van de bladen schaar 'onder het lichaam muur wordt gedrukt, til het iets omhoog om ervoor te zorgen dat alleen het lichaam muur, en geen van de interne organen, wordt gesneden. Blijven snijden boven de gonopore naar het hoofd en snijd in een rechte lijn.
- Lokaliseren van de prostaat (posterior) en zaadblaasjes (anterior). Ontleden deze uit en bewaar ze op ijs. Gebruik deze om de testoplossingen met zaadvocht en / of sperma te maken. Gebruik fysiologische Lymnaea saline (5,83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) als dragermedium.
- Verzamel de zaadvloeistof die in het lumen van de prostaat en de sperma van de zaadblaasjes is. Vervolgens schorsen zowel in zoutoplossing in afzonderlijke flacons door voorzichtig het uiten van hun inhoud en het verwijderen van het orgaan weefsel met een pincet. Blijf op ijs en maken gebruik van dezelfde dag. Later, meng deze suspensies om de verschillende behandeling oplossingen te creëren.
3. Intravaginale Injectie
- Alvorens de intravaginale injectieprocedure, stelt een siliconen omhulsel-vorm (aan het uiteinde van het reservoir past), 1 mm spuiten, 10-12 cm siliconenslang met een diameter van 1 mm, stomp injectienaalden (0,3 mm x 13 mm ), grof tang en dezelfde 10 ml spuit, gevuld met een 50 mM MgCl2-oplossing voorzien van een scherpe injectienaald.
- Verzamel de zaadcellen, die nodig zijn om toe te voegen aan de zaadvloeistof (of individuele zaadvocht eiwitten) in sommige behandelingen; een biologisch relevante dosis is gelijk aan 1/3 van een prostaat en zaadblaasjes per injectie.
OPMERKING: In de resultaten representatief deel (figuur 1) de resultaten van een experiment met drie verschillende behandelingen worden getoond: Controle (dragermateriaal, dat wil zeggen, zoutoplossing), Ovipostatin (een van de geïdentificeerde zaadvocht eiwitten) alleen en Ovipostatin gepaard met sperma. Ook de biologisch relevante dosis bij andere soorten schatten bepalen het verschil in gewicht van de prostaat individuen die onlangs gepaard en individuen die overbleven seksueel geïsoleerde 16. - Bereid 1 ml spuiten voor elk van de bereide testoplossingen. Vul elke spuit met een oplossing en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in.
- Monteer een afgestompte injectienaald op elke spuit.
- Voor injectie gebruiken een 1mm siliconenslang met een lengte van 10 cm hoogte.
- Schuif de siliconenslang over de injectienaald, zorg ervoor dat de buis niet te doorboren, en verwijder de lucht uit de buis door voorzichtig het toepassen van de druk op de spuit.
- Verdoven een slak door het volgen van hetzelfde protocol als in punt 2.3. Deze keer zorg ervoor dat meer dan 2-3 ml 50 mM MgCl2 niet te injecteren.
- Leg de slak in de schelp-mal om het in een stabiele positie te houden.
- Zoek de vrouwelijke gonopore, dat duidelijk zichtbaar als witte vlek op de rechterzijde van het dier, voorafgaande aan de juiste tentakel en mannelijke gonopore (deze plaats geldt ook voor andere soorten van zoetwater slakken). Zorg ervoor dat u vrij toegang hebben.
- Gebruik een tang om het einde van de siliconenslang houden en breng dan ongeveer 2-4 mm van de siliconenslang in het vrouwelijke gonopore.
- Breng zorgvuldig druk op de spuit en injecteer 0,03 ml van de testoplossing. Wacht een half minute de druk in de buis te verspreiden in de vrouwelijke tractus alvorens de buis mogelijk.
- De terugkeer van de behandelde slak aan zijn isolement container, waar het kan worden gecontroleerd, en laat het herstellen van sedatie in de experimentele tank.
4. Bioassay
- Label elke slak voor de identificatie en meet zijn schelp lengte. De laatste is een goede indicator van de omvang, die relevant is kwantificering voortplantingsresultaat.
- Houd elke slak geïsoleerd in een 460 ml container die is geperforeerd om voor water-uitwisseling binnen de experimentele tank. Het is belangrijk dat alle containers in de juiste oriëntatie met de perforaties in de richting van de waterstroom, zodat efficiënte waterverversing.
- Tijdens de biologische, voeden slakken regelmatig met een gestandaardiseerde hoeveelheid van sla. Gebruik een ronde, metalen puncher om sla te snijden. In dit protocol sla schijven van 19,6 cm2 worden gebruikt, die een benadertmonteer ze maximaal kunnen eten in een dag.
- Verzamel een ei massa met de platte kant van een spatel en schraap het ei massa van de container muur. Gebruik de lepel kant om het ei massa te verzamelen.
OPMERKING: Ondoorzichtige ei massa's die net zijn gelegd kunnen niet worden gebruikt voor het scannen (ze transparant worden binnen een paar uur na het leggen). Voor het model soorten in dit protocol, Lymnaea stagnalis, controleer ei massa's elke dag, omdat ze produceren 2-3 ei massa's per week. Dit kan verschillen bij andere soorten. - Scan de verzamelde ei massa's digitaal, met behulp van een (laptop) computer met de scanner driver, een flat bed scanner, een standaard millimeter schaal, een spatel, het overbrengen van borden en glazen tegels.
- Plaats elk ei massa op de overdracht platen en herhalen totdat de platen vol. Vervolgens dep de ei massa droog op keukenpapier en overbrengen op het glas tegels in dezelfde volgorde als de overdracht platen.
- Draai elke tegel ondersteboven (deei massa zal vasthouden aan de glazen tegel) en leg hem voorzichtig op de flatbed scanner, net onder de millimeter schaal. Breng een beetje druk om het ei massa's plat, die gelijkmatig zal verdelen de eieren zodat ze allemaal zichtbaar binnen dezelfde focus vliegtuig. Monteer de tegels met een gestandaardiseerde hoeveelheid tape rond twee kanten om te verzekeren dat alle eieren gelijk worden afgevlakt.
- Pas de scanner instellingen. Het is belangrijk om de resolutie tot de maximale passen, maak een voorbeeld scan, bijsnijden het werkgebied, en pas de helderheid en het contrast. Scan de ei massa.
- Leg elk ei massa voor haar eigen label 20 ml glazen flacon voor verdere ontwikkeling en broedeieren.
- Vernieuw het water in het uitbroeden flesjes om de andere dag om het goed zuurstofrijk te houden. Doe dit volgens hatchling aantallen en grootte in de volgende volgorde: decanteren / afgieten (geen jongen), overlopen (begin van broedeieren) en extraheren uit het water met een pipet (veel jongen).
- Installeer de vrij verkrijgbare software voor beeldanalyse ImageJ (NIH, USA) en de cel teller plugin.
- Open ImageJ evenals een spreadsheetprogramma om de gegevens aan. Vervolgens opent u een gescande foto van ei massa's in ImageJ.
- Zet de schaal met behulp van de zoom-functie om te navigeren op de millimeter schaal. Zoom in en het venster aan te passen voor 1 mm tot het scherm opvullen. Trek een lijn met de lijn gereedschap tussen de twee lijnen die 1 mm aan te geven. Navigeer naar Analyseren en Set schaal. In het pop-upmenu de gemeten lengte optie zichtbaar, passen Bekende afstand tot 1 en eenheid van lengte mm. Vink het vakje Global, en sluit het venster.
- Stel de gewenste metingen (lengte, breedte, omtrek) door te navigeren naar Analyseren en Set Metingen door Ruimte en Feret Diameter (lengte en breedte) te selecteren. Klik op OK om te bevestigen en door te gaan met het beeld analyseert.
- Om de eieren te meten, ZoOm in op een ei van de eerste ei massa die moet worden gemeten. Een zoom van 800% wordt aanbevolen. Dan, met behulp van de elliptische gereedschap tekenen een ovaal precies rond het ei, druk op Ctrl + D om de omtrek te tekenen op de afbeelding (om te voorkomen dat het meten van dezelfde ei tweemaal). Druk dan op ctrl + M om de maatregel van de eigenschappen van het ovaal (lengte, breedte, omtrek) registreren; een pop-up scherm geopend met de metingen.
OPMERKING: Het gebruik van de elliptische tool om eieren te meten geldt niet voor alle soorten. Voor soorten met niet-gelijkmatig gevormde eieren, gebruikt u de vrije hand selecties plaats. - Meet zoveel eieren als nodig en sla de maatregelen. Xls werkblad. Eventueel, kopieert u de gegevens rechtstreeks in een werkblad.
- Vervolgens tellen de eieren in een ei massa, met behulp van de teller-venster en zet de tellingen handmatig in het werkblad.
- Als alternatief, de telling van de individuele eieren per ei massa met de hulp van de cel contra plug-in. Hiervoor gaat u naar plug-ins,vervolgens, Analyseren en selecteer Celgetalmeter. Het venster celgetalmeter verschijnt, controleert u de 'Bewaar de originele' vakje en druk op 'initialiseren'. Een nieuwe teller verschijnt, selecteert u de crosshair op de werkbalk en selecteer een teller in het menu cel teller. Tel de individuele eieren door te klikken op de individuele eieren in de cel teller venster. Let op de totale telling naast het type teller in het menu cel teller. Kopieer dit nummer handmatig in een spreadsheet of de resultaten te verkrijgen door op Resultaten.
- Count meerdere ei massa binnen een telling evenement door het toevoegen van soorten tegen te gaan, indien nodig.
Representative Results
Figuur 1 toont het percentage dieren eieren leggen na intravaginale injectie van ofwel de controlestof (zoutoplossing), Ovipostatin of Ovipostatin gepaard met sperma. N = 15 voor elke behandeling; zie Koene et al. 16 voor meer informatie en statistieken (Bron: Figuur 3 van Koene et al. 2010, PLoS ONE.)..
Figuur 1. Effect van Ovipostatin op eieren massaproductie van Lymnaea stagnalis. De grafiek toont het percentage dieren eieren leggen na intravaginal injectie van hetzij de controle stof (zoutoplossing), Ovipostatin of Ovipostatin gepaard met sperma. N = 15 voor elke behandeling; zie Koene et al.. 2010 gegevens en statistieken. Herdruk met toestemming van Koene et al. 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
De gepresenteerde protocol laat zien hoe zaadvloeistof en hoe dit te testen in een biologisch zinvolle manier te verzamelen. Hoewel deze procedure hier weergegeven met de prostaat extract, kan het effect van een gezuiverd zaadvloeistof eiwit worden getest volgens dezelfde procedure. Uiteraard, in dergelijke tests is het altijd belangrijk om de juiste controles (sham behandelingen) om te garanderen dat de procedure en / of de vervoerder medium hebben geen invloed op de parameters in vragen 14,16. Met deze methode is reeds aangetoond dat er een zaadvloeistof eiwit, namelijk Ovipostatin, dat een vermindering van eierleggende 14,16 bemiddelt. Dit eiwit, geproduceerd in de prostaat en Overdracht paring met de spermatozoa, is de eerste volledig gekarakteriseerde zaadvloeistof component in simultaan hermafrodiet en heeft tot nu toe geen gelijkenis met bekende eiwitten tonen.
De bevinding dat Ovipostatin vermindert ei massaproductie in de ontvanger bevestigt eerdere werk aangeeft dat stoffen in het sperma ei kunnen beïnvloeden leggen 13-15. Door de overdracht van biologisch relevante bedragen (zie 3.2 16), kan men overtuigend aan te tonen dat het een rudimentaire vloeistof eiwit, en niet de aanwezigheid van spermatozoa zelf, dat de waargenomen daling van de eileg (figuur 1) komt tussenbeide. Gezien het feit dat herhaalde ontvangst van zaadvocht via natuurlijke paringen verhoogt de investering per ei 15, wordt het nu zeer relevant voor andere parameters van de eileg kwantificeren. Het gepresenteerde protocol worden nu de vereiste methoden om dit te doen. Hoewel geen effect werd gevonden Ovipostatin op ontluiking succes van de genoemde door de ontvanger 16 eieren, kunnen er andere zaadvloeistof eiwitten die met dit eiwit handelen in concert. Vandaar, parameters die moeten worden gekwantificeerd in deze context - naast leggen frequentie en ei nummers - onder andere ei grootte, hatching tijd, hatchling ontwikkeling en hatchling grootte. Bovendien is het mogelijk om te kijken naar effecten op andere processen dan vrouwelijke leg, zoals sperma opslag en gebruik, alsmede de verdeling van reproductieve middelen naar de vrouwelijke en mannelijke functie 14,17. Het is duidelijk dat de gepresenteerde methode is instrumenteel in het aanpakken van deze follow-vraagstukken, zowel in Lymnaea stagnalis en in andere zoet water slakken.
Kortom, experimenten met dit protocol blijkt dat zaadvocht eiwitten overgebracht invloed op de vrouwelijke reproductieve prestaties van de ontvanger in deze simultaan hermafrodieten. Gezien het feit dat weinig studies dit hebben aangepakt, is het waarschijnlijk veel vaker voor bij intern bevruchten hermafrodieten dan momenteel wordt weerspiegeld in de wetenschappelijke literatuur. Zeker als men zich realiseert dat de pre-copulatory partnerkeuze en sperma concurrentie is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in deze hermafrodieten 14, dat highlights het potentieel van zulke mannelijke accessoire klier eiwitten om seksueel worden geselecteerd in dit systeem. Tot slot, dit onderzoek helpt om het ontwikkelen van begrip dat zaadvocht eiwitten zijn van even groot belang voor gelijktijdige hermafrodieten als ze zijn voor de gescheiden-gesekst soorten ondersteunen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken MR Helmus voor de voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg en C. Levesque voor technische ondersteuning. Dit onderzoek wordt financieel ondersteund door Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), de Koninklijke Nederland Akademie van Wetenschappen (KNAW) en de Japan Student Services Organization (JASSO). Deze publicatie werd ondersteund door een Open Access-subsidie van NWO om JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen. , Springer-Verlag. (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. Sexual Conflict. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , Elsevier. (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
