השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון

Abstract

באופן פנימי דישון בעלי חיים, נוזל זרע הוא הוסיף בדרך כלל לתאי הזרע, יחד ויוצרים את הזרע או שפיכה. חוץ מזרע מזין והפעלה, הרכיבים בנוזל הזרע יכולים גם להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה הפריה של תורם הזרע. בעוד שמחקרים רבים דיווחו על תופעות כאלה במין עם מינים נפרדים, מעט מחקרים עסקו זה בבעלי החיים בו זמנית hermaphroditic. פרוטוקול וידאו זה מציג שיטה ללמוד השפעות של נוזל זרע בחלזונות, באמצעות חילזון בו זמנית hermaphroditic מים מתוקים, stagnalis Lymnaea חילזון הברכה הגדול, כמו אורגניזם מודל. בעוד ההליך מוצג באמצעות תמציות בלוטת ערמונית שלמות, רכיבים בודדים (כלומר, חלבונים, פפטידים, ותרכובות אחרות) של נוזל הזרע, ניתן לבדוק באותו אופן. השפעות של קבלת רכיבי שפיכה בנחת ביצה ניתן לכמת במונחים של תדירות של הטלת ביצים והערכות עדינות יותר של ביצועי רבייה נשיים כגון מספרי ביצה בתוך כל המוני ביצה. תוצאות מראות כי חלבוני נוזל זרע משפיעים על פלט רבייה נשי באנדרוגינוס בו זמנית זו, המדגיש את החשיבות שלהם לברירה מינית.

Introduction

עם ההעברה, תאי זרע הם בדרך כלל מלווים בנוזל זרע מיוצר על ידי בלוטות אבזר מין זכר. בעוד כמה רכיבי שפיכה לשחק תפקידים בזרע מזין והפעלת ^1, אחרים להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה של הפריה של תורם הזרע ^2-4. השפעות אלה נבחרו במיוחד עבור, דרך ברירה מינית, כאשר מינים הוא מופקרים ביותר ויש לו אחסון זרע יעיל ועיכול זרע. בתנאים אלה, תורמי זרע להתחרות בכבדות להפריה של ביצים ^5. אמנם יש ראיות בשפע מתאמים לחשיבות של חומרי נוזל זרע להצלחת הפריה ממין זכר, עדות ישירה היא יותר נדירה וכמה מחקרים התעמקו בפרטים של השינוי ו / או חומרים מעורבים ⁶ הפיסיולוגיים.

במינים עם מינים נפרדים (כלומר, זכרים ונקבות; gonochorists) יש speci מודל חקר היטב כמהes כשזה מגיע להרכב נוזל זרע ואת ההשפעות שלהם. דוגמאות כוללות את זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster ^6, יתושים המלריה, אנופלס ⁷ gambiae, וחיפושית הקמח האדומה, castaneum Tribolium ^8. מחקרי נוזל זרע כאלה הם נדירים הרבה יותר כשמדובר במינים שהם בו זמנית hermaphroditic (כלומר, אנשים הם מבחינה פונקציונלית זכר ונקבה באותו הזמן), למרות שהמצב של רבייה זו הוא נפוץ בכל רחבי הממלכה ⁹ בעלי החיים. דוגמא hermaphroditic הבולטת ביותר של העברת חומר בלוטת אבזר היא כנראה הירי של מה שנקרא אהבה בחצי שבלולי היבשה ^2,10, שבו החומר מועבר על ידי תורם הזרע באמצעות הזרקת מזרק ^11,12, כלומר, לא יחד עם תאי הזרע. אבל יש הרבה הרמפרודיטים בו זמנית, כי העברת מוצרי בלוטת אבזר גבריים יחד עם הזרע שלהם,כגון מיני המודל משמשים כאן, הברכה הגדולה חילזון Lymnaea stagnalis. המחקרים קודמים כבר הוכיחו כי קבלת נוזל הזרע משפיעה על תפוקת הרבייה הנשית של מין זה ^13-15, וכמה מחלבוני נוזל זרע המעורבים זוהו ^16,17.

המטרה הכללית של פרוטוקול זה, שהוא שלוחה של השיטות שדווחו בKoene אח' ^16, היא לבדוק את ההשפעות של חלבוני נוזל זרע על פרמטרים שונים של הטלת ביצים ברכיכות חלזון. המטרה זו מושגת על ידי נתיחה של בלוטת הערמונית (כלומר, בלוטת האבזר הגברית ייצור נוזל הזרע) של חלזונות תורם מבודדים מבחינה מינית מתרבות מעבדה סטנדרטית. שנית, הזרע של התורם נאסף משלפוחית ​​הזרע ופתרונות טיפול שונים עשויים. בהמשך לכך, חלזונות מבחן הם מורדמים וintravaginally הוזרקו פתרון מבחן (לדוגמא,תמצית בלוטת ערמונית לבד, תמצית בלוטת ערמונית עם זרע, זרע לבד, בינוני נושאת לבדה). אז חלזונות מבחן אלה במעקב במשך הימים הבאים לשבועות, בתנאים סטנדרטיים, להקליט הטלת ביצים. המוני ביצה נאספים, באופן דיגיטלי שנסרקו לספירה ומדידת פרמטרים שונים, ולאחר מכן לשים בצלוחיות אישיות לבקיעה. לאחר כשבועיים, הגוזלים נספרים ונסרקו באופן דיגיטלי. כל הסריקות, שבשני המוני ביצה וגוזלים, לאחר מכן נותחו באמצעות חבילת תוכנת ניתוח תמונה באופן חופשי, זמינה.

לפרוטוקול זה משמש זן המעבדה של החילזון הגדול בריכה, stagnalis Lymnaea,, שהוא גידל באוניברסיטת VU באמסטרדם. מין זה משמש כמערכת מודל לחקר שאלות על בחירה ורבייה בהרמפרודיטים מיניות. הגודל הגדול יחסית של בעלי החיים עושה את זה באופן ניסיוני מאוד נגיש. בנוסף לכך, משום שהוא משמש כמיני מודל ברבים בדיסציפלינות iological אנחנו כבר יודעים הרבה על הביולוגיה הבסיסית של בעלי חיים אלה. שיטה זו תעזור לשאלות מחקר על תהליכים של ברירה מינית שמתווכים באמצעות חלבוני נוזל זרע באופן כללי. בנוסף, מכיוון שמדובר בהרמפרודיטים בו זמנית, זה אפשרי כדי לטפל באם חלבונים כגון לפעול בדרכים דומות ו / או שונות כפי שהם עושים במינים שבם המינים מופרדים ^16,17.

Protocol

1. מתקן רבייה

1. להשיג דגימות בוגרות של stagnalis Lymnaea (ל) מתרבות מעבדה כמו זו באוניברסיטת VU.
2. לשמור על המים נמוך נחושת ב20 מעלות צלזיוס בשני מתקן הרבייה (molluscarium) וטנקים ניסיוניים, שבו יש תחלופת מים רציפות.
3. הגדר את מחזור האור / חושך בשעות 12: שעות 12.
4. לרבייה, להאכיל כרצונך מודעת חסה נקיה מחומרי הדברת חלזונות הבוגרים, להאכיל את בני הנוער הצעירים עם TetraPhyll פתיתים (מזון לדגים). שמור על חלזונות במיכלים נפרדים על פי גילם, החל מהמוני ביצה שמונחים בתוך מסגרת זמן 24 שעות.
5. ברגע שחלזונות יוסרו מן טנקי הרבייה הם לא חזרו, כדי למנוע תופעות של שנשמר בתנאים מעט שונים, כמו גם כדי למנוע pseudoreplication.

2. Dissection

1. לבודד את החלזונות במשך שבוע 1, ולהאכיל אותם כרצונך מודעה, על מנת להבטיח thaלא צריכים שהם זרע מלא וחנויות נוזל זרע.
2. הכן מיקרוסקופ סטריאו, צלחת לנתיחה עם סיכות, מספריים כירורגיות קטנים, מלקחיים גסים ועדינים, מזרק מיליליטר 10 מלאים עם פתרון 50 מ"מ MgCl _2, מחטי הזרקה (0.3 מ"מ x 13 מ"מ) וכמה מגבות נייר.
3. להרדים חילזון על ידי הזרקת MgCl ₂ פתרון (בדרך כלל 3 מיליליטר או יותר לחלזונות בוגרים באורך קונכייה של 31.6 ± 2.1 מ"מ ומשקל רטוב של 2.89 ± 0.55 ז). לחדור את הרגל עם מחט הזריקה בזווית של ° 45 ולהזריק בעדינות על ידי הפעלת לחץ ברציפות עד החילזון מרגיע ונשאר מורחב (תוך שניות). הסר את מחט הזריקה ולבדוק אם החילזון הוא מורדמים (לדוגמא, על ידי בדיקה האם רפלקס נסיגת זרוע חסר).
4. מוציא בזהירות את הקליפה הבאה העקמומיות שלה על ידי שימוש במלקחיים גסים. באמצע הדרך, בעדינות לנתק את השרירים columellar מהמעטפת על ידי גירוד עם המלקחיים. בעדינות לא לעקםהוא החילזון מתוך הקונכייה שלו, הבא לכיוון המתפתל של הפגז.
5. מניחים את השבלול על הצלחת לנתיחה ולהצמיד את הקצה האחורי של כף הרגל. ואז, במקום סיכה דרך הראש ולשים קצת מתח על החילזון כדי להקל על נתיחה.
6. בתרגום הנשי gonopore, אשר מאוחר יותר על להיות נקודת התייחסות לנתיחה.
7. באמצעות המספריים כירורגיות ומלקחיים בסדר, להפיק את החתך הראשון, בדיוק מתחת לקצה של המעטפת ולחתוך לכיוון הנשי gonopore. כאשר אחד מהלהבים 'המספריים נדחף מתחת לקיר הגוף, להרים אותו מעט כדי להבטיח שרק קיר הגוף, ואף אחד מהאיברים הפנימיים, הוא לחתוך. המשך חיתוך מעל gonopore לכיוון הראש ולחתוך בקו ישר.
8. למקם את בלוטת הערמונית (אחורי) ושלפוחית ​​זרע (קדמית). לנתח אלה בזהירות ולשמור אותם על קרח. השתמש בם כדי להפוך את פתרונות בדיקה המכילים נוזל ו / או זרע זרע. השתמש סאל Lymnaea הפיזיולוגיine (5.83 מילימול / ליטר CaCl ₂ · 2H ₂ O, 3.76 מילימול / ליטר MgCl ₂ · 6 שעות ₂ O, 42.69 מילימול / ליטר NaCl, 37.53 מילימול / ליטר KCl) כמדיום מוביל.
9. לאסוף את נוזל הזרע שנמצא בלומן של בלוטת הערמונית, כמו גם את הזרע משלפוחית ​​הזרע. בהמשך לכך, להשעות את שניהם במלח בבקבוקונים נפרדים בעדינות על ידי המבטא את תוכנם והסרת רקמות האיבר עם מלקחיים. שמור על קרח ולהשתמש באותו היום. מאוחר יותר, לערבב השעיות אלה כדי ליצור פתרונות טיפול השונים.

3. הזרקת intravaginal

1. לפני שמתחיל הליך ההזרקה intravaginal, להכין פגז-תבנית סיליקון (עשה כדי להתאים את קצה הקליפה), מזרקים 1 מ"מ, 10-12 צינורות סיליקון סנטימטר בקוטר של 1 מ"מ, הקהו מחטי הזרקה (0.3 מ"מ x 13 מ"מ ), מלקחיים גסים ואותו מזרק מיליליטר 10 מלא מצוידים במחט הזרקה חדה פתרון ₂ מ"מ MgCl 50.
2. לאסוף את הזרע, צריך להוסיף לנוזל הזרע (או חלבוני נוזל זרע בודדים) בכמה טיפולים; מינון רלוונטי מבחינה ביולוגית שווה 1/3 של בלוטת ערמונית ושלפוחית ​​זרע לכל זריקה.
   הערה: בסעיף תוצאות הנציג (איור 1) התוצאות של ניסוי עם שלושה טיפולים שונים מוצגות: בקרה (מדיום מוביל, כלומר, מי מלח), Ovipostatin (אחד מחלבוני נוזל זרע המזוהים) לבד וOvipostatin מלוות עם זרע. בנוסף, כדי להעריך את המינון הרלוונטי מבחינה ביולוגית במינים אחרים, לקבוע את ההבדל במשקל של בלוטת הערמונית של אנשים שהזדווגו ואנשים שנותרו מבודד מבחינה מינית ¹⁶ לאחרונה.
3. הכן 1 מיליליטר מזרקים עבור כל אחד מפתרונות הבדיקה מוכנים. ממלא כל מזרק עם פתרון אחד ולהבטיח כי אין בועות אוויר בתוכו.
4. תתאים מחט זריקה קהה בכל מזרק.
5. להזרקה להשתמש 1צינור בקוטר מ"מ סיליקון באורך מינימאלי של 10 סנטימטר.
6. מחליק בזהירות את צינור סיליקון מעל מחט הזריקה, כדי לוודא שלא לנקב את הצינור, ולהסיר את האוויר מהצינור בעדינות על ידי יישום הלחץ על המזרק.
7. לטשטש חילזון על ידי ביצוע אותו הפרוטוקול כמו בנקודה 2.3. הפעם לוודא שלא להזרים יותר מ 2-3 מיליליטר של 50 מ"מ MgCl _2.
8. הנח את החילזון בקליפת עובש כדי לשמור אותו במצב יציב.
9. לאתר את נקבת gonopore, שנראה בבירור כנקודה לבנה בצד ימין של בעל חיים, קדמי לזרוע ימין וgonopore זכר (מיקום זה חל גם על מינים אחרים של חלזונות מים מתוקים). לוודא שיש גישה בלא הפרעה.
10. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את קצה צינורית סיליקון ועדינות להכניס כ 2-4 מ"מ של צינור סיליקון לתוך נקבת gonopore.
11. בזהירות להחיל לחץ למזרק ולהזריק 0.03 מיליליטר של פתרון המבחן. חכה חצי דק 'אוטה כדי לאפשר את הלחץ בצינור כדי להפיץ לנקבת דרכי לפני הסרת הצינור.
12. להחזיר את החילזון שטופל למכל הבידוד שלה, שבו ניתן לנטר אותו, ולאפשר לו להתאושש מהרדמה בטנק הניסיוני.

4. מבדק

1. כל תווית חילזון לזיהוי ומדידת אורך שריונו. האחרון הוא אינדיקטור טוב לגודל, שהוא רלוונטי כאשר כימות תפוקת רבייה.
2. שמור על כל חילזון מבודד במכל מיליליטר 460 כי הוא מחורר כדי לאפשר תחלופת מים בתוך מיכל הניסיוני. חשוב למקם את כל המכולות בכיוון הנכון, עם הנקבים בכיוון זרימת המים, כדי לאפשר תחלופת מים יעילים.
3. במהלך המבדק, להאכיל את החלזונות באופן קבוע עם כמות סטנדרטית של חסה. השתמש אגרופן עגול, מתכת לחתוך חסה. בפרוטוקול זה דיסקי חסה של 19.6 סנטימטר ² משמשים, המדמה אתהר הם יכולים מקסימאלי לאכול ביום אחד.
4. איסוף המוני ביצה בצד החלק של מרית ולגרד את מסת הביצה מהקיר מיכל. השתמש בצד הכף לאיסוף המוני הביצה.
   הערה: המוני ביצה אטומים שזה עתה הניח לא יכולים לשמש לסריקה (שהם הופכים שקופים בתוך כמה שעות לאחר הנחה). למיני מודל בפרוטוקול זה, stagnalis Lymnaea, לבדוק להמוני ביצה בכל יום, שכן הם מייצרים 2-3 המוני ביצה בשבוע. זה יכול להיות שונה במינים אחרים.
5. סרוק את המוני ביצה שנאספו באופן דיגיטלי, באמצעות מחשב (מחשב נייד) המכיל את מנהל ההתקן של הסורק, סורק למיטה שטוח, בקנה מידה מילימטר סטנדרטי, מרית, העברת צלחות ואריחי זכוכית.
6. מניחים כל מסת ביצה על צלחות העברה וחזור עד לצלחות מלאות. לאחר מכן, מורחים את המוני ביצה יבשים על מגבת נייר ולהעביר אותם על גבי אריחי הזכוכית באותו סדר כמו בצלחות העברה.
7. הפעל כל אריח במהופך (המוני ביצה ידבקו אריחי הזכוכית) והניחו אותו בזהירות ובסורק, ממש מתחת לקנה מידת המילימטר. להחיל קצת בלחץ כדי לשטח את המוני ביצה, שתפיץ את הביצים באופן שווה, כך שהם כולם נראים לעין באותו מישור הפוקוס. התאם את האריחים עם כמות סטנדרטית של קלטת סביב שני קצוות כדי להבטיח שכל הביצים שטוחות באותה מידה.
8. התאם את ההגדרות של הסורק. חשוב להתאים את הרזולוציה למקסימום שלה, לבצע סריקה מקדימה, לחתוך את אזור העבודה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות. סרוק את המוני ביצה.
9. מניחים כל מסת ביצה בבקבוקון שלו שכותרתו 20 מיליליטר הזכוכית להמשך פיתוח ובקיעה.
10. רענן המים בבקיעת בקבוקונים בכל יום אחר כדי לשמור אותו מחומצן כראוי. לעשות את זה על פי מספרי גוזל וגודל לפי הסדר הבא: decanting / לשפוך את (אין גוזלים), עולה על גדותיו (תחילת בקיעה), וחילוץ מתוך המים עם טפטפת (גוזלים רבים).

<כיתת p = "jove_title"> 5. מדידה וספירה ביצים

1. התקן את ImageJ באופן חופשי, זמין תוכנת ניתוח תמונה (NIH, ארה"ב) ותוסף דלפק תא.
2. ImageJ הפתוח, כמו גם תכנית גיליון אלקטרוני כדי להעביר את הנתונים ל. ואז לפתוח תמונה סרוקה של המוני ביצה בImageJ.
3. הגדר את קנה המידה על ידי שימוש בכלי הזום כדי לנווט לקנה מידת המילימטר. קרב ולהתאים את החלון ל1 מ"מ כדי למלא את המסך. לצייר קו באמצעות כלי השורה בין שני הקווים המצביעים על 1 מ"מ. נווט לניתוח, וקבע בקנה מידה. בתפריט המוקפץ אפשרות האורך המדודה הופכת לגלויה, להתאים את המרחק ידוע 1 ויחידת האורך למ"מ. סמן את התיבה הגלובלית, ולסגור את החלון.
4. הגדר את המדידות המועדפות (אורך, רוחב, היקף) על ידי ניווט לניתוח, וקבע מדידות על ידי בחירת אזור והקוטר של Feret (אורך ורוחב). לחץ על אישור כדי לאשר ולהמשיך עם דמותו מנתח.
5. כדי למדוד את הביצים, zoאום בביצה של מסת הביצה הראשונה שצריכה להיות מדודים. הזום של 800% מומלץ. לאחר מכן, באמצעות הכלי הסגלגל לצייר אליפסה בדיוק סביב הביצה, לחץ על CTRL + D כדי לצייר את ההיקף על התמונה (כדי למנוע מדידה אותה הביצה פעמיים). לאחר מכן לחץ על Ctrl + M כדי להקליט את המדד למאפיינים של סגלגל (אורך, רוחב, היקף); מסך מוקפץ נפתח בו מוצגות המדידות.
   הערה: השימוש בכלי אליפטי למדוד ביצים אינו חל על כל המינים. עבור מינים עם ביצים בצורה לא אחיד, השתמש בבחירות חופשי במקום.
6. למדוד כמו ביצים רבות במידת צורך ולאחר מכן שמור את האמצעים כ. גיליון xls. לחלופין, להעתיק את הנתונים ישירות לתוך גיליון עבודה.
7. בהמשך לכך לספור את הביצים בתוך מסת ביצים, על ידי שימוש בחלון הדלפק ולשים את הספירה באופן ידני לגיליון העבודה.
8. לחלופין, לספור את הביצים בודדות למסת ביצה בעזרת דלפק התוספת התא. לשם כך, לנווט לתוספות,לאחר מכן, לנתח ובחר דלפק תא. חלון דלפק התא יופיע, סמנו את "לשמור על מקורית" תיבה ולחץ על 'אתחול'. חלון דלפק חדש מופיע, בחר בכלי הכוונת מסרגל הכלים ולבחור סוג דלפק בתפריט דלפק תא. לספור את הביצים על ידי לחיצה על הביצים בודדות בחלון דלפק תא. שים לב למספר הכולל ליד סוג הדלפק בתפריט דלפק תא. העתק מספר זה באופן ידני לגיליון אלקטרוני או לקבל את התוצאות על ידי לחיצה על תוצאות.
9. רוזן המוני ביצה מרובים בתוך אירוע נספר אחד על ידי הוספת סוגי דלפק, במידת צורך.

Representative Results

איור 1 מציג את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene אח' ¹⁶ לפרטים ונתונים סטטיסטיים (מקור: איור 3 מKoene אח' 2010, PLoS ONE.)..

איור 1. השפעת Ovipostatin בייצור המוני ביצה של Lymnaea stagnalis. הגרף מראה את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene et al. פרטים 2010 ונתונים סטטיסטיים. להדפיס מחדש באישור Koene אח' 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Discussion

הפרוטוקול המובא מראה כיצד לאסוף נוזל זרע ואיך לבדוק את זה בצורה משמעותית מבחינה ביולוגית. למרות שהליך זה כאן מוצג באמצעות תמצית בלוטת הערמונית, ההשפעה של חלבון נוזל זרע מטוהר יחיד יכולה להיות גם נבדקה באותו האופן. כמובן, בבדיקות כגון זה תמיד חיוני לכלול בקרות נאותות (טיפולי דמה) כדי להבטיח שההליך ו / או בינוני הספק אינו משפיע על הפרמטרים בשאלות ^14,16. באמצעות שיטה זו, שהיא כבר הראתה כי קיימת חלבון יחיד נוזל זרע, כלומר Ovipostatin, שמתווך בירידה בהטלת ביצים ^14,16. חלבון זה, המיוצר בבלוטת הערמונית והועבר במהלך הזדווגות יחד עם תאי הזרע, מייצג את המרכיב הראשון המאופיין במלואו נוזל הזרע באנדרוגינוס בו זמנית ואין, עד כה, לא הראה שום דמיון לחלבונים ידועים.

הממצא שOvipostaפח מפחית ייצור המוני ביצה בנמען מאשש עבודה קודמת מצביע על כך שחומרים בזרע עשויים להשפיע על הטלת ביצי ^13-15. על ידי העברת סכומים רלוונטיים מבחינה ביולוגית (ראה 3.2 ^16), אפשר באופן משכנע להוכיח כי מדובר בחלבון נוזל זרע, ולא הנוכחות של תאי זרע עצמם, שמתווך את הירידה שנצפתה בהטלת ביצים (איור 1). בהתחשב בכך שקבלה חוזרת של נוזל זרע דרך הזדווגויות טבעיות מגדילה את ההשקעה לביצה ^15, עכשיו זה הופך להיות רלוונטי מאוד לכמת פרמטרים אחרים של הטלת ביצים. הפרוטוקול הציג החברה מספק את השיטות הדרושות כדי לעשות זאת. למרות שלא נמצאה השפעה של Ovipostatin על בקיעת הצלחה של הביצים שהונחו על ידי הנמען ^16, ייתכנו חלבוני נוזל זרע אחרים שיפעלו בתיאום עם חלבון זה. לפיכך, פרמטרים שצריכים לכמת בהקשר זה - בסמוך לנחת מספרי תדירות וביצה - כוללים גודל ביצה, hatcזמן הינג, פיתוח גוזל וגודל גוזל. בנוסף, אפשר להסתכל על השפעות על תהליכים אחרים נשיים מאשר הנחת ביצה, כגון אחסון זרע ושימוש, כמו גם הקצאת משאבי רבייה כלפי התפקוד הנשי וגברי ^14,17. ברור שהשיטה שהוצגה היא סייע בטיפול בנושאי מעקב אלה, הן בLymnaea stagnalis ובחלזונות מים מתוקים אחרים.

לסיכום, ניסויים באמצעות הצגת פרוטוקול זה שהעביר את חלבוני נוזל זרע משפיעים על ביצועי רבייה הנשיים של הנמען בהרמפרודיטים בו זמנית אלה. בהתחשב בכך שמספר מחקרים התייחסו הזה, זה עשוי להיות הרבה יותר נפוץ באופן פנימי דישון הרמפרודיטים מאשר כיום משתקף בספרות המדעית. במיוחד כאשר אחד מבין שבחירת בן זוג לפני הזדווגות ותחרות הזרע הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהרמפרודיטים אלה ^14, שhighlights הפוטנציאל של חלבוני בלוטת אבזר גבריים כגון להיבחר מיני במערכת זו. לבסוף, מחקר זה מסייע לתמיכה ברעיון הפיתוח שחלבוני נוזל זרע הם בעלי חשיבות שווה להרמפרודיטים בו זמנית כפי שהם למיני דחף מיניים נפרדים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish food flakes	TetraPhyll
Stereo microscope
Small surgical scissors	WPI
Coarse and fine forceps	WPI
10 ml syringe
Injection needles (0.3 mm x 13 mm)
50 mM MgCl2
5.83 mmol/L CaCl2·2H2O
3.76 mmol/L MgCl2·6H2O
42.69 mmol/L NaCl
37.53 mmol/L KCl
Two component Silicon	Sylgard
1 mm syringes
Silicon tubing (diameter 1 mm)
Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)
Tubes	Eppendorff
460 ml perforated containers
Metal leaf puncher (19.6 cm2)
Spatula/spoon
(Laptop) computer
Flatbed scanner
Millimeter scale
Transferring plates
Glass tiles
20 ml glass vials