Abstract
In concimazione internamente animali, liquido seminale è normalmente aggiunto agli spermatozoi, insieme formando lo sperma o liquido seminale. Oltre sperma nutriente ed attivando, i componenti del liquido seminale possono anche influenzare fisiologia femminile per aumentare fecondazione successo del donatore di sperma. Mentre molti studi hanno riportato tali effetti in specie con sessi separati, pochi studi hanno affrontato questo in animali contemporaneamente ermafroditi. Questo protocollo video presenta un metodo per studiare gli effetti di liquido seminale in gasteropodi, utilizzando una lumaca d'acqua dolce contemporaneamente ermafrodita, la grande lumaca stagno Lymnaea stagnalis, come organismo modello. Mentre la procedura è indicata con estratti completi prostata, singoli componenti (cioè, proteine, peptidi, ed altri composti) del liquido seminale possono essere testati nello stesso modo. Effetti della ricezione dei componenti eiaculare in deposizione delle uova possono essere quantificati in termini di frequenza di deposizione delle uova estime più sottili di prestazioni riproduttivo femminile come i numeri delle uova all'interno di ogni masse di uova. I risultati mostrano che le proteine del liquido seminale influenzano la capacità riproduttiva femminile in questo ermafrodita simultaneo, sottolineando la loro importanza per la selezione sessuale.
Introduction
Al momento del trasferimento, gli spermatozoi sono di solito accompagnata da liquido seminale prodotto dalle ghiandole accessorie maschili. Mentre alcuni componenti di eiaculato giocano ruoli in nutriente e attivando sperma 1, altri influenzano fisiologia femminile al fine di aumentare la fecondazione successo del donatore di sperma 2-4. Tali effetti sono particolarmente selezionati per, attraverso la selezione sessuale, quando una specie è altamente promiscua e ha efficiente conservazione dello sperma e sperma digestione. In tali condizioni, donatori di sperma competere pesantemente per la fecondazione delle uova 5. Mentre non vi sono abbondanti prove di correlazione per l'importanza delle sostanze del liquido seminale per il successo fecondazione maschile, la prova diretta è più raro e pochi studi hanno approfondito i dettagli della modifica e / o sostanze coinvolte 6 fisiologico.
In specie a sessi separati (cioè, maschi e femmine; gonochorists) ci sono alcuni modelli spe ben studiato,es quando si tratta di composizione liquido seminale e loro effetti. Gli esempi includono la mosca della frutta, Drosophila melanogaster 6, la zanzara della malaria, Anopheles gambiae 7, e la farina coleottero rosso, Tribolium castaneum 8. Tali studi liquido seminale sono molto più rari quando si tratta di specie che sono contemporaneamente ermafrodita (cioè, gli individui sono funzionalmente maschio e femmina allo stesso tempo), anche se questa modalità di riproduzione è comune in tutto il regno animale 9. L'esempio ermafrodita più notevole del trasferimento di una sostanza ghiandola accessorio è probabilmente la fucilazione dei cosiddetti love-dardi in lumache di terra 2,10, in cui la sostanza viene trasferito dal donatore di sperma tramite iniezione ipodermica 11,12, vale a dire, non insieme con gli spermatozoi. Ma ci sono molti ermafroditi simultanei che trasferiscono i prodotti delle ghiandole accessorie maschili insieme a loro sperma,come le specie modello usato qui, il grande stagno lumaca Lymnaea stagnalis. Precedenti ricerche hanno già dimostrato che la ricevuta del liquido seminale influenza la capacità riproduttiva femminile di questa specie 13-15, e molte delle proteine del liquido seminale coinvolte sono state identificate 16,17.
L'obiettivo generale di questo protocollo, che è un'estensione dei metodi riportati in Koene et al 16, è quello di testare gli effetti delle proteine del liquido seminale su vari parametri di deposizione delle uova nei molluschi gasteropodi. Ciò si ottiene mediante dissezione della ghiandola prostatica (cioè, la ghiandola accessorio maschile che produce il liquido seminale) di lumache donatori sessualmente isolato da una coltura di laboratorio standardizzato. In secondo luogo, lo sperma del donatore viene raccolto da vescicole seminali e le diverse soluzioni di trattamento sono fatti. Successivamente, lumache prova sono anestetizzati e intravaginale iniettati con una soluzione di prova (per esempio,prostata estratto di ghiandola sola, estratto di ghiandola prostatica con lo sperma, solo sperma, supporto informatico da solo). Queste lumache prova vengono poi monitorati per i seguenti giorni o settimane, in condizioni standard, per registrare la deposizione delle uova. Masse di uova sono raccolti, scansionato digitalmente per contare e misurare diversi parametri, e poi mettere in singoli flaconcini da cova. Dopo circa due settimane, i piccoli sono contati e la scansione digitale. Tutte le scansioni, di entrambe le masse di uova e larve, vengono poi analizzati utilizzando un pacchetto software di analisi dell'immagine liberamente disponibile.
Per questo protocollo viene utilizzato il ceppo di laboratorio del grande lumaca stagno, stagnalis Lymnaea, che viene allevato presso VU University di Amsterdam. Questa specie serve come sistema modello per studiare le domande relative a selezione sessuale e la riproduzione in ermafroditi. Dimensioni relativamente grandi dell'animale rende sperimentalmente molto accessibile. Inoltre, perché viene utilizzato come specie modello in molti bdiscipline iological abbiamo già conoscono molto circa la biologia di base di questi animali. Questo metodo permetterà di studiare le domande relative a processi di selezione sessuale che sono mediati attraverso le proteine del liquido seminale in generale. Inoltre, perché questi sono ermafroditi simultanei, è possibile indirizzare se tali proteine agiscono in modi simili e / o diversi come fanno in specie in cui i sessi sono separati 16,17.
Protocol
1. Breeding Struttura
- Ottenere esemplari adulti di Lymnaea stagnalis (L.) da una coltura di laboratorio come quello di VU University.
- Mantenere l'acqua basso contenuto di rame a 20 ° C sia la funzione di allevamento (molluscarium) e vasche sperimentali, che hanno cambio continuo di acqua.
- Impostare il ciclo luce / buio di 12 ore: 12 ore.
- Per l'allevamento, alimentare il lumache adulte senza pesticidi lattuga ad libitum, nutrire i giovani giovani con TetraPhyll (cibo per pesci) fiocchi. Mantenere lumache in serbatoi separati in base alla loro età, a partire da masse di uova che sono previste entro un lasso di tempo di 24 ore.
- Una volta che le lumache vengono rimossi dalle vasche di allevamento non sono restituiti, al fine di evitare effetti di essere stati tenuti in condizioni leggermente diverse, nonché per evitare pseudoreplication.
2. Dissezione
- Isolare le lumache per 1 settimana, e di dar loro da mangiare ad libitum, per garantire that hanno il pieno sperma e negozi di liquido seminale.
- Preparare un microscopio stereo, un piatto dissezione con perni, piccole forbici chirurgiche, pinze grossolane e fini, una siringa da 10 ml riempita con una soluzione di MgCl 2 a 50 mm, aghi da iniezione (0,3 mm x 13 mm) ed alcuni tovaglioli di carta.
- Euthanize una lumaca iniettando MgCl 2 soluzione (generalmente 3 ml o più per le lumache adulti con una lunghezza guscio di 31,6 ± 2,1 mm e peso umido di 2,89 ± 0,55 g). Penetrare il piede con l'ago di iniezione ad un angolo di 45 ° e iniettare applicando delicatamente pressione continuamente fino a quando la lumaca si rilassa e rimane estesa (in pochi secondi). Rimuovere l'ago per l'iniezione e verificare se la lumaca è eutanasia (per esempio, verificando se il riflesso di ritiro tentacolo è assente).
- Rimuovere con attenzione il guscio dopo la sua curvatura mediante pinze grossolani. A metà strada, delicatamente staccare il muscolo columellare dalla shell raschiando con le pinze. Ruotare delicatamente tegli lumaca fuori dal suo guscio, seguendo la direzione di avvolgimento della conchiglia.
- Posizionare la lumaca sul piatto dissezione e fissare l'estremità posteriore del piede. Poi, posto un perno attraverso la testa e mettere qualche tensione sulla lumaca per facilitare la dissezione.
- Localizzare il gonopore femminile, che sarà in seguito un punto di riferimento per la dissezione.
- Utilizzando le forbici chirurgiche e pinza sottile, fare la prima incisione, appena sotto il bordo del mantello e tagliare verso il gonopore femmina. Quando una delle lame delle forbici viene spinto sotto la parete del corpo, sollevarlo leggermente per assicurare che solo la parete del corpo, e nessuno degli organi interni, viene tagliato. Continuare a tagliare sopra la gonopore verso la testa e tagliare in linea retta.
- Localizzare la prostata (posteriore) e delle vescicole seminali (anteriori). Sezionare questi fuori con attenzione e tenerli su ghiaccio. Utilizzare questi per rendere le soluzioni di prova contenenti liquido seminale e / o sperma. Utilizzare fisiologico Lymnaea saline (5,83 mmol / L CaCl 2 · 2H 2 O, 3.76 mmol / L MgCl 2 · 6H 2 O, 42.69 mmol / L di NaCl, 37.53 mmol / L KCl) come mezzo di supporto.
- Raccogliere il liquido seminale che è presente nel lume della prostata così come lo sperma dalle vescicole seminali. Successivamente, sospendere sia in soluzione salina in flaconcini separati esprimendo delicatamente il contenuto ed eliminare il tessuto organo con una pinza. Tenere su ghiaccio e utilizzare lo stesso giorno. Successivamente, mescolare queste sospensioni per creare diverse soluzioni di trattamento.
3. Intravaginale Injection
- Prima di avviare la procedura di iniezione intravaginale, preparare una silicio shell-stampo (per adattarsi alla punta del guscio) 1 mm siringhe, tubi 10-12 cm di silicio con un diametro di 1 mm, smussati aghi per iniezione (0,3 millimetri x 13 mm ), pinze grossolane e la stessa siringa da 10 ml riempita con una soluzione di 50 mM MgCl 2 con ago di iniezione tagliente.
- Raccogliere lo sperma, necessaria per aggiungere al liquido seminale (o singole proteine del liquido seminale) in alcuni trattamenti; una dose biologicamente rilevante pari a 1/3 di una ghiandola prostatica e vescicole seminali per iniezione.
NOTA: Nella sezione risultati rappresentante (Figura 1) sono riportati i risultati di un esperimento con tre diversi trattamenti: Controllo (medio carrier, cioè, salina), Ovipostatin (una delle proteine del liquido seminale identificate) solo e Ovipostatin accompagnato con lo sperma. Inoltre, per stimare la dose biologicamente rilevante in altre specie, determinare la differenza di peso della prostata di individui che hanno recentemente accoppiati e individui che sono rimasti sessualmente isolato 16. - Preparare 1 ml siringhe per ciascuna delle soluzioni di prova preparate. Riempire ogni siringa con una soluzione e garantire che non vi siano bolle d'aria all'interno.
- Montare un ago per iniezione smussata su ogni siringa.
- Per l'iniezione utilizzare un 1mm tubo di silicone di diametro con una lunghezza minima di 10 cm.
- Far scorrere delicatamente il tubo di silicone sopra l'ago di iniezione, facendo attenzione a non forare il tubo, e rimuovere l'aria dal tubo applicando delicatamente la pressione sulla siringa.
- Anestetizzare una lumaca seguendo lo stesso protocollo di cui al punto 2.3. Questa volta, assicuratevi di non iniettare più di 2-3 ml di 50 mM MgCl 2.
- Posare la lumaca nel guscio stampo per mantenerlo in una posizione stabile.
- Individuare il gonopore femmina, che è chiaramente visibile come una macchia bianca sul lato destro dell'animale, anteriore al tentacolo destra e gonopore maschio (descrizione vale anche per altre specie di lumache d'acqua dolce). Assicurarsi di avere libero accesso.
- Utilizzare una pinza per tenere l'estremità del tubo di silicone e inserirla delicatamente circa 2-4 mm del tubo di silicone nella gonopore femmina.
- Applicare con attenzione la pressione alla siringa e iniettare 0,03 ml della soluzione campione. Attendere mezzo minute per consentire la pressione nel tubo di diffondere nel tratto femmina prima di rimuovere il tubo.
- Riportare la lumaca trattata per il suo contenitore isolamento, dove può essere monitorato, e permettono di recuperare dalla sedazione nel serbatoio sperimentale.
4. Bioassay
- Etichettare ogni lumaca per l'identificazione e misurare la lunghezza della shell. Quest'ultimo è un buon indicatore delle dimensioni, che è rilevante nella quantificazione capacità riproduttiva.
- Mantenere ogni lumaca isolato in un contenitore 460 ml che è forata per consentire uno scambio di acqua all'interno del serbatoio sperimentale. È importante posizionare tutti i contenitori e nella direzione corretta, con le perforazioni nella direzione del flusso d'acqua, per consentire lo scambio di acqua efficiente.
- Durante il saggio biologico, alimentare lumache regolarmente con una quantità standardizzata di lattuga. Utilizzare un round, perforatore in metallo per tagliare la lattuga. In questo protocollo vengono utilizzati dischi lattuga di 19,6 centimetri 2, che approssima l'unamount che al massimo possono mangiare in un giorno.
- Raccogliere una massa uovo con la parte piatta di una spatola e raschiare la massa uovo dalla parete del contenitore. Utilizzare il lato cucchiaio per raccogliere la massa di uova.
NOTA: masse di uova opachi che sono appena stati stabiliti non possono essere utilizzati per la scansione (che diventano trasparenti entro poche ore dopo la posa). Per le specie modello in questo protocollo, stagnalis Lymnaea, verificare la presenza di masse di uova ogni giorno, dal momento che producono 2-3 masse di uova a settimana. Questo può differire in altre specie. - Eseguire la scansione delle masse di uova raccolte in digitale, utilizzando un (laptop) computer che contiene il driver dello scanner, uno scanner a letto piano, una scala millimetrica standard, una spatola, trasferire piatti e piastrelle in vetro.
- Collocare ogni massa uovo sulle piastre di trasferimento e ripetere fino a quando le piastre sono pieni. Successivamente, tamponare le masse uovo secco su carta assorbente e trasferirli sulle piastrelle di vetro nello stesso ordine come sulle piastre di trasferimento.
- Girare ogni piastrella a testa in giù (ilmasse di uova si attaccano alla piastrella di vetro) e posizionare con cura sullo scanner piano, proprio sotto la scala millimetrica. Applicare un po 'di pressione per appiattire le masse d'uovo, che distribuirà le uova in modo uniforme in modo che siano tutte visibili all'interno dello stesso piano di messa a fuoco. Montare le piastrelle con una quantità standardizzata di nastro intorno due bordi per assicurare che tutte le uova sono appiattite altrettanto.
- Regolare le impostazioni dello scanner. E 'importante regolare la risoluzione al massimo, fare una scansione di anteprima, ritagliare l'area di lavoro, e regolare la luminosità e il contrasto. Scansione le masse di uova.
- Collocare ogni massa uovo nel suo marcato flaconcino di vetro da 20 ml per un ulteriore sviluppo e la schiusa.
- Aggiornare l'acqua in cova fiale ogni altro giorno per mantenere correttamente ossigenato. Fate questo in base al numero hatchling e dimensioni nell'ordine seguente: decantazione / travaso (senza larve), traboccante (inizio della schiusa), ed estraendo l'acqua con una pipetta (molti neonati).
- Installare il software di analisi delle immagini ImageJ liberamente disponibili (NIH, USA) e il plugin contatore cella.
- Aprire ImageJ nonché un programma di foglio per trasferire i dati. Poi aprire un'immagine digitalizzata di masse di uova in ImageJ.
- Impostare la scala utilizzando lo strumento zoom per passare alla scala millimetrica. Zoom in e regolare la finestra per 1 mm a riempire lo schermo. Tracciare una linea utilizzando lo strumento linea tra le due linee che indicano 1 mm. Passare per analizzare e impostare la scala. Nel menu a comparsa l'opzione di lunghezza misurata diventa visibile, regolare la distanza Noto a 1 e unità di lunghezza fino a mm. Selezionare la casella globale, e chiudere la finestra.
- Impostare le misure preferiti (lunghezza, larghezza, circonferenza) navigando per analizzare e impostare misure di Area e di Feret Diametro (lunghezza e larghezza) selezionando. Fare clic su OK per confermare e continuare con analizza l'immagine.
- Per misurare le uova, ZOom in su un uovo della prima massa uovo che deve essere misurato. Si raccomanda un ingrandimento del 800%. Quindi, utilizzando lo strumento ellittica disegnare un ovale esattamente intorno all'uovo, premere Ctrl + D per disegnare la circonferenza sull'immagine (per evitare che misura due volte lo stesso uovo). Quindi premere ctrl + M per registrare la misura delle proprietà del ovale (lunghezza, larghezza, circonferenza); una finestra pop-up si apre la visualizzazione delle misurazioni.
NOTA: L'utilizzo dello strumento ellittica per misurare le uova non si applica a tutte le specie. Per le specie con le uova a forma di non-uniforme, utilizzare invece le selezioni a mano libera. - Misurare quante più uova necessarie e quindi salvare le misure. Foglio xls. Facoltativamente, copiare i dati direttamente in un foglio di lavoro.
- Successivamente contare le uova all'interno di una massa d'uovo, utilizzando la finestra del contatore e mettere i conti manualmente nel foglio di lavoro.
- In alternativa, contare le singole uova per massa uovo con l'aiuto della cella contatore plug-in. Per questo, passare a plug-in,poi, analizzare e selezionare Contatore di cellule. La finestra del contatore di cellule pop-up, controllare il 'keep originale' box e premere 'inizializzazione'. Viene visualizzata una nuova finestra del contatore, selezionare lo strumento mirino dalla barra degli strumenti e selezionare un tipo di contatore nel menu contatore cella. Contare le singole uova, cliccando sulle singole uova nella finestra del contatore cella. Osservare il conteggio totale accanto al tipo di contatore nel menu contatore cella. Copiare questo numero manualmente un foglio di calcolo o di ottenere i risultati premendo Risultati.
- Contare multipli masse di uova entro un evento conteggio aggiungendo tipi di contatore, se necessario.
Representative Results
La figura 1 mostra la percentuale di animali che pongono uova dopo l'iniezione intravaginale di una sostanza di controllo (soluzione salina), Ovipostatin, o Ovipostatin accompagnati con sperma. N = 15 per ogni trattamento; vedi Koene et al 16 per i dettagli e le statistiche (Fonte: Figura 3 da Koene et al 2010, PLoS ONE.)..
Figura 1. Effetto della Ovipostatin sulla produzione di massa di uova di Lymnaea stagnalis. Il grafico mostra la percentuale di animali che pongono uova dopo l'iniezione intravaginale di una sostanza di controllo (soluzione salina), Ovipostatin, o Ovipostatin accompagnati con sperma. N = 15 per ogni trattamento; vedi Koene et al. 2010 dettagli e statistiche. Ristampa con il permesso di Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Il protocollo presentato mostra come raccogliere liquido seminale e come testare questa in modo biologicamente significativo. Anche se questa procedura viene qui indicata usando l'estratto prostata, l'effetto di una singola proteina liquido seminale purificato può anche essere testato secondo la stessa procedura. Ovviamente, in tali test è sempre fondamentale per comprendere adeguati controlli (trattamenti sham) per garantire che la procedura e / o supporto informatico non influenzano i parametri in questioni 14,16. Usando questo metodo, è già stato dimostrato che vi è una singola proteina liquido seminale, cioè Ovipostatin, che media una riduzione ovaiole 14,16. Questa proteina, prodotta nella prostata e trasferiti durante l'accoppiamento con gli spermatozoi, rappresenta il primo componente liquido seminale caratterizzata completamente in un ermafrodita simultaneo e che, finora, non mostra alcuna somiglianza con proteine note.
La constatazione che Ovipostatin riduce la produzione di massa di uova nel ricevente corrobora lavoro precedente indica che le sostanze nel liquido seminale possono influenzare la deposizione delle uova 13-15. Trasferendo biologicamente importi rilevanti (vedi punto 3.2 16), si può dimostrare in modo convincente che si tratta di una proteina liquido seminale, e non la presenza di spermatozoi stessi, che media la riduzione osservata nella deposizione delle uova (Figura 1). Dato che ripetuta ricevimento del liquido seminale tramite accoppiamenti naturali aumenta l'investimento per ogni uovo 15, diventa oggi molto rilevanti per quantificare altri parametri di deposizione delle uova. Il protocollo presentato ora fornisce i metodi necessari per farlo. Sebbene nessun effetto è stato trovato di Ovipostatin sulla schiusa successo delle uova deposte dal beneficiario 16, vi possono essere altre proteine del liquido seminale che agiscono in concerto con questa proteina. Quindi, i parametri che devono essere quantificati in questo contesto - accanto alla posa numeri di frequenza e delle uova - includono la dimensione uovo, hatctempo Hing, sviluppo schiusa e le dimensioni schiusa. Inoltre, è possibile osservare effetti su altri processi di sesso femminile che la deposizione delle uova, come conservazione dello sperma e utilizzo, nonché l'allocazione delle risorse verso la funzione riproduttiva femminile e maschile 14,17. Chiaramente, il metodo presentato è fondamentale per affrontare questi problemi followup, sia in Lymnaea stagnalis e in altre lumache d'acqua dolce.
In sintesi, esperimenti usando questo spettacolo protocollo trasferiti proteine del liquido seminale influiscono sulle prestazioni riproduttivo femminile del destinatario in questi ermafroditi simultanei. Dato che pochi studi hanno affrontato questo, è probabile che sia molto più comune nella fertilizzazione internamente ermafroditi rispetto a quello attualmente in base alla letteratura scientifica. Soprattutto quando ci si rende conto che la scelta compagno pre-copula e competizione spermatica hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante in questi ermafroditi 14, che highlights il potenziale di tali proteine ghiandole accessorie maschili da selezionare sessualmente in questo sistema. Infine, questa ricerca aiuta a sostenere l'idea di sviluppo che le proteine del liquido seminale sono di pari importanza per ermafroditi simultanei come lo sono per specie separate-sessuato.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo MR Helmus per la voce-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque per l'assistenza tecnica. Questa ricerca è finanziata dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), la Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) e la Japan Student Services Organization (Jasso). Questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione Open Access di NWO a JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
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