Abstract
En fertilizar internamente animales, el fluido seminal se suele añadir a los espermatozoides, formando el semen o eyaculado. Además de esperma nutritiva y la activación de, los componentes en el líquido seminal también pueden influir en la fisiología femenina para aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma. Aunque muchos estudios han informado de tales efectos en las especies con sexos separados, pocos estudios han abordado este en animales hermafroditas simultáneamente. Este protocolo de vídeo presenta un método para estudiar los efectos de líquido seminal en gasterópodos, el uso de un caracol de agua dulce de forma simultánea hermafrodita, la gran caracol Lymnaea stagnalis estanque, como organismo modelo. Mientras se muestra el procedimiento utilizando extractos completos de la glándula de la próstata, los componentes individuales (es decir, proteínas, péptidos, y otros compuestos) de líquido seminal pueden ser probadas de la misma manera. Efectos de la recepción de los componentes del eyaculado en la puesta de huevos se pueden cuantificar en términos de frecuencia de la puesta de huevos yestimaciones más sutiles de comportamiento reproductivo femenino, como el número de huevos dentro de cada masa de huevos. Los resultados muestran que las proteínas del líquido seminal afectan el rendimiento reproductivo de la mujer en esta hermafrodita simultáneo, destacando su importancia para la selección sexual.
Introduction
Tras la transferencia, los espermatozoides son por lo general acompañada de líquido seminal producido por las glándulas accesorias masculinas. Mientras que algunos componentes del eyaculado juegan un papel en la activación de los espermatozoides nutritiva y 1, otros influyen en la fisiología femenina con el fin de aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma 2-4. Estos efectos son especialmente seleccionados para, a través de la selección sexual, cuando una especie es altamente promiscua y tiene el almacenamiento de esperma eficiente y la digestión de los espermatozoides. Bajo tales condiciones, los donantes de esperma compiten fuertemente para la fertilización de los huevos 5. Si bien existe abundante evidencia correlacional de la importancia de las sustancias líquido seminal para el éxito de la fertilización masculina, prueba directa es más raro y pocos estudios han profundizado en los detalles del cambio y / o sustancias que intervienen 6 fisiológica.
En especies con sexos separados (es decir, machos y hembras; Gonocorista) hay unos pocos modelos especi bien investigadoES cuando se trata de la composición del fluido seminal y sus efectos. Algunos ejemplos son la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster 6, el mosquito de la malaria, Anopheles gambiae 7, y el escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum 8. Tales estudios de fluidos seminales son mucho más raras cuando se trata de especies que son simultáneamente hermafrodita (es decir, los individuos son funcionalmente macho y hembra al mismo tiempo), a pesar de que este modo de reproducción es común en todo el reino animal 9. El ejemplo más notable hermafrodita de la transferencia de una sustancia de las glándulas accesorias es probablemente el rodaje de los llamados amorosos dardos en los caracoles de tierra de 2,10, cuando la sustancia se transfiere por el donante de esperma a través de inyección hipodérmica 11,12, es decir, no junto con los espermatozoides. Pero hay muchos hermafroditas simultáneos que transfieren productos de las glándulas accesorias masculinas junto con su esperma,tales como la especie modelo utilizado aquí, el gran estanque de caracol Lymnaea stagnalis. La investigación anterior ha demostrado ya que la recepción de líquido seminal influye en el rendimiento reproductivo femenino de esta especie 13-15, y varias de las proteínas del líquido seminal involucrados se han identificado 16,17.
El objetivo general de este protocolo, que es una extensión de los métodos reportados en Koene et al 16, es poner a prueba los efectos de las proteínas del líquido seminal sobre diversos parámetros de la puesta de huevos en los moluscos gasterópodos. Esto se logra mediante la disección de la glándula de la próstata (es decir, el macho de las glándulas accesorias producir el líquido seminal) de aislados sexual caracoles donantes de un cultivo de laboratorio normalizado. En segundo lugar, el esperma del donante se obtiene de las vesículas seminales y diferentes soluciones de tratamiento se hacen. Posteriormente, los caracoles de ensayo se anestesian y por vía intravaginal inyectadas con una solución de ensayo (por ejemplo,extracto de glándula de próstata solo, extracto de glándula de la próstata con el esperma, los espermatozoides solo, medio portador). Estos caracoles de prueba se siguen de cerca para los siguientes días o semanas, en condiciones normales, para grabar la puesta de huevos. Las masas de huevos se recogen, digitalmente escaneada para contar y medir varios parámetros, y luego poner en viales individuales para incubar. Después de dos semanas, las crías son contados y escaneados digitalmente. Todos los análisis, tanto de las masas de huevos y crías, son luego analizados utilizando un paquete de software de análisis de imágenes de libre disposición.
Para este protocolo se utiliza la cepa de laboratorio de la gran caracol estanque, stagnalis Lymnaea, que se cría en la Universidad VU en Amsterdam. Esta especie sirve como un sistema modelo para investigar preguntas sobre selección y reproducción en hermafroditas sexual. Tamaño relativamente grande del animal hace que sea muy accesible experimentalmente. Además, ya que se utiliza como especie modelo en muchos bdisciplinas iológica que ya saben mucho sobre la biología básica de estos animales. Este método le ayudará a estudiar las preguntas acerca de los procesos de selección sexual que están mediadas a través de fluido seminal proteínas en general. Además, debido a que estos son hermafroditas simultáneos, es posible abordar si tales proteínas actúan en formas similares y / o diferentes como lo hacen en especies en las que los sexos están separados 16,17.
Protocol
1. Criadero
- Obtener ejemplares adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de un cultivo de laboratorio, como el de la Universidad VU.
- Mantener el agua baja en cobre a 20 ° C, tanto en la instalación de cría (molluscarium) y los tanques experimentales, que tienen el cambio de agua continuo.
- Ajuste el ciclo de luz / oscuridad de 12 h: 12 h.
- Para la cría, alimentar a los caracoles adultos sin pesticidas lechuga ad libitum, alimentar a los jóvenes menores de edad con TetraPhyll (comida de pescado) copos. Mantener caracoles en tanques separados de acuerdo a su edad, a partir de las masas de huevos que se colocan dentro de un plazo de 24 horas.
- Una vez que los caracoles son retirados de los tanques de cría que no se devuelven, para evitar los efectos de haber sido mantenido bajo condiciones ligeramente diferentes, así como para prevenir pseudoreplication.
2. Disección
- Aislar los caracoles durante 1 semana, y darles de comer a voluntad, para asegurar that tienen pleno esperma y almacena el líquido seminal.
- Preparar un microscopio estéreo, una placa de disección con los pins, pequeñas tijeras quirúrgicas, fórceps gruesos y finos, una jeringa de 10 ml llena con una solución de MgCl 2 50 mM, agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm) y algunas toallas de papel.
- La eutanasia a un caracol inyectando MgCl2 solución (generalmente 3 ml o más para los caracoles adultos con una longitud de concha de 31,6 ± 2,1 mm y el peso húmedo de 2.89 ± 0.55 g). Penetrar en el pie con la aguja de inyección en un ángulo de 45 ° y se inyecta mediante la aplicación de una suave presión de forma continua hasta que el caracol se relaja y se mantiene extendida (en segundos). Retire la aguja de inyección y comprobar si el caracol es sacrificado (por ejemplo, comprobar si el reflejo de retirada tentáculo está ausente).
- Retire con cuidado la cáscara siguiendo su curvatura por el uso de fórceps gruesas. A mitad de camino, quite suavemente el músculo columelar de la cáscara raspando con los fórceps. Gire suavemente tél caracol de su concha, siguiendo la dirección de enrollado de la concha.
- Coloque el caracol en la placa de disección y precisar la parte trasera del pie. Luego, coloque un alfiler a través de la cabeza y poner un poco de tensión en el caracol para facilitar la disección.
- Localizar el gonoporo femenina, que más tarde será un punto de referencia para la disección.
- El uso de las tijeras quirúrgicas y unas pinzas finas, hacer que la primera incisión, justo debajo del borde de la capa y cortar hacia el gonoporo hembra. Cuando una de las cuchillas de las tijeras es empujada bajo la pared del cuerpo, levántelo ligeramente para asegurarse de que sólo la pared del cuerpo, y ninguno de los órganos internos, se corta. Continuar el corte por encima de la gonoporo hacia la cabeza y cortar en línea recta.
- Localizar la glándula de la próstata (posterior) y las vesículas seminales (anterior). Diseccionar éstos con cuidado y mantenerlos en hielo. Utilice estos para hacer las soluciones de ensayo que contiene líquido y / o esperma seminal. Utilice fisiológica sal Lymnaeaine (5.83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6H 2 O, 42.69 mmol / l de NaCl, 37.53 mmol / L KCl) como un medio portador.
- Recoger el líquido seminal que está presente en el lumen de la glándula de la próstata, así como el esperma de las vesículas seminales. Posteriormente, suspender tanto en solución salina en viales separados, expresando con cuidado su contenido y eliminar el tejido de los órganos con una pinza. Mantener en hielo y utilizar el mismo día. Más tarde, mezclar estas suspensiones para crear las diferentes soluciones de tratamiento.
3. Intravaginal Inyección
- Antes de comenzar el procedimiento de inyección intravaginal, preparar una cáscara de molde de silicio (hecho para adaptarse a la punta de la cáscara), 1 jeringas mm, 10-12 cm de tubo de silicio con un diámetro de 1 mm, romos agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm ), fórceps secundarios y la misma jeringa de 10 ml llena con una solución de 50 mM de MgCl 2 provista de una aguja de inyección agudo.
- Se recoge el esperma, es necesario agregar al líquido seminal (o fluido seminal proteínas individuales) en algunos tratamientos; una dosis biológicamente relevante es igual a 1/3 de una glándula de la próstata y vesícula seminal por inyección.
NOTA: En la sección de resultados representativos (Figura 1) se muestran los resultados de un experimento con tres tratamientos diferentes: Control (medio de soporte, es decir, la solución salina), Ovipostatin (una de las proteínas del líquido seminal identificados) solo y Ovipostatin acompañado con el esperma. Además, para estimar la dosis biológicamente relevante en otras especies, determinar la diferencia en el peso de la glándula prostática de los individuos que se han apareado y las personas que quedaron aisladas sexual-16 recientemente. - Preparar jeringas de 1 ml para cada una de las soluciones de ensayo preparadas. Llene cada jeringa con una solución y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el interior.
- Coloque una aguja de inyección romo en cada jeringa.
- Para utilizar la inyección de un 1tubo de silicona diámetro mm con una longitud mínima de 10 cm.
- Deslice con cuidado el tubo de silicona sobre la aguja de inyección, teniendo cuidado de no perforar el tubo, y quitar el aire del tubo aplicando suavemente la presión sobre la jeringa.
- Anestesiar un caracol, siguiendo el mismo protocolo que en el punto 2.3. Esta vez asegúrese de no inyectar más de 2 a 3 ml de 50 mM MgCl 2.
- Coloque el caracol en el molde de la cáscara para mantenerlo en una posición estable.
- Localice el gonoporo femenina, que es claramente visible como una mancha blanca en el lado derecho del animal, anterior al tentáculo derecho y gonoporo masculino (esta ubicación también se aplica a otras especies de caracoles de agua dulce). Asegúrese de tener acceso sin obstáculos.
- Utilice una pinza para sujetar el extremo del tubo de silicona y suavemente inserto de aproximadamente 2-4 mm del tubo de silicio en el gonoporo hembra.
- Con cuidado aplique presión a la jeringa e inyectar 0,03 ml de la solución de ensayo. Espere medio minutoUte para permitir que la presión en el tubo que se extienda en el tracto femenino antes de retirar el tubo.
- Devuelva el caracol tratado a su contenedor de aislamiento, donde puede ser monitoreado, y permitir que se recupere de la sedación en el tanque experimental.
4. Bioensayo
- Etiquetar cada caracol para la identificación y medir su longitud de concha. Este último es un buen indicador del tamaño, que es relevante al tiempo de cuantificar el rendimiento reproductivo.
- Mantenga cada caracol aislado en un recipiente 460 ml que está perforada para permitir el intercambio de agua dentro del tanque experimental. Es importante colocar todos los contenedores en la orientación correcta, con las perforaciones en la dirección del flujo de agua, para permitir el intercambio de agua eficiente.
- Durante el bioensayo, caracoles alimentar regularmente con una cantidad estandarizada de lechuga. Utilice un golpeador de metal redondo para cortar lechuga. En este protocolo se utilizan discos de lechuga de 19,6 cm 2, que se aproxima a la de unmontaje que como máximo se puede comer en un día.
- Reunir una masa de huevos usando el lado plano de una espátula y raspar la masa de huevos de la pared del recipiente. Use el lado cuchara para recoger la masa de huevos.
NOTA: masas de huevos opacos que acaban de ser establecidas no se pueden utilizar para el escaneado (que se vuelven transparentes dentro de unas pocas horas después de la construcción). Para la especie modelo en este protocolo, stagnalis Lymnaea, compruebe si hay masas de huevos todos los días, ya que producen 2-3 masas de huevos por semana. Esto puede diferir en otras especies. - Escanear las masas de huevos recogidos de forma digital, utilizando una (laptop) de ordenador que contiene el controlador del escáner, un escáner de cama plana, una escala milimétrica estándar, una espátula, la transferencia de placas y baldosas de vidrio.
- Coloque cada masa de huevos en las placas de transferencia y repetir hasta que los platos están llenos. Posteriormente, haga presión sobre las masas de huevos en seco en la toalla de papel y transferirlos a los azulejos de cristal en el mismo orden que en las placas de transferencia.
- Gire cada azulejo boca abajo (lamasas de huevos se adhieren a las baldosas de vidrio) y se coloca cuidadosamente en el escáner de superficie plana, justo debajo de la escala milimétrica. Aplique un poco de presión para aplanar las masas de huevos, que se distribuyen los huevos de manera uniforme para todos ellos son visibles dentro del mismo plano de enfoque. Colocar los azulejos con una cantidad estandarizada de cinta alrededor de dos bordes para asegurar que todos los huevos se aplanan por igual.
- Ajuste la configuración del escáner. Es importante ajustar la resolución al máximo, hacer una exploración preliminar, recortar el área de trabajo, y ajustar el brillo y el contraste. Escanear las masas de huevos.
- Coloque cada masa de huevos en su propia etiqueta del vial de vidrio de 20 ml para un mayor desarrollo y eclosión.
- Actualizar el agua en la eclosión viales cada dos días para mantenerlo adecuadamente oxigenado. Para ello, de acuerdo a los números de neonatos y el tamaño en el orden siguiente: decantación / vertiendo (sin crías), desbordando (inicio de la eclosión), y extraer el agua con una pipeta (muchas crías).
- Instale el software de análisis de imágenes ImageJ libre disposición (NIH, EE.UU.) y el plugin contador de células.
- ImageJ abierto, así como un programa de hoja de cálculo para transferir los datos. A continuación, abra una imagen escaneada de masas de huevos en ImageJ.
- Ajuste la escala con la función de zoom para desplazarse a la escala milimétrica. Acercar y ajustar la ventana de 1 mm para llenar la pantalla. Dibuja una línea con la herramienta de línea entre las dos líneas que indican 1 mm. Vaya a analizar, y Set escala. En el menú emergente de la opción de longitud medida se hace visible, ajuste la distancia conocido a 1 y unidad de longitud de mm. Marque la casilla Global, y cerrar la ventana.
- Establecer las medidas preferidas (largo, ancho, circunferencia) navegando a analizar, y establecer medidas, seleccionando Área y diámetro de Feret (largo y ancho). Haga clic en Aceptar para confirmar y continuar con el análisis de la imagen.
- Para medir los huevos, la zoOM en en un huevo de la primera masa de huevo que debe ser medido. Se recomienda utilizar un zoom de 800%. Entonces, usando la herramienta elíptica dibujar un óvalo exactamente alrededor del huevo, pulse Ctrl + D para dibujar la circunferencia sobre la imagen (para evitar que la medición del mismo huevo dos veces). A continuación, pulse Ctrl + M para registrar la medida de las propiedades de la ovalada (largo, ancho, circunferencia); una pantalla emergente se abre mostrando las mediciones.
NOTA: El uso de la herramienta elíptica para medir los huevos no se aplica a todas las especies. Para las especies con huevos en forma no uniforme, utilice las selecciones a mano alzada en su lugar. - Mida tantos huevos como sea necesario y guarde las medidas. Hoja de cálculo xls. Opcionalmente, copiar los datos directamente en una hoja de cálculo.
- Posteriormente contar los huevos dentro de una masa de huevos, mediante el uso de la ventana del contador y poner las cuentas manualmente en la hoja de trabajo.
- Por otra parte, contar los huevos individuales por masa de huevos con la ayuda de la célula contra plug-in. Para ello, vaya a los plug-ins,a continuación, analizar y seleccionar Contador de células. La ventana del contador de células aparecerá, marque la casilla 'Guardar original "caja y pulsa' inicializar '. Aparecerá una nueva ventana del contador, seleccione la herramienta en forma de cruz de la barra de herramientas y seleccione un tipo de contador en el menú de contador de células. Cuente los huevos individuales haciendo clic sobre los huevos individuales en la ventana Contador de células. Observe el recuento total de al lado del tipo de contador en el menú de contador de células. Copia este número manualmente a una hoja de cálculo o de obtener los resultados pulsando Resultados.
- Cuente múltiples masas de huevos dentro de un evento de conteo añadiendo tipos de contador, si es necesario.
Representative Results
La Figura 1 muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal de cualquiera de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin, o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al 16 para obtener más información y estadísticas (Fuente: Figura 3 de Koene et al 2010, PLoS ONE.)..
Figura 1. Efecto de Ovipostatin en la producción masiva de huevos de Lymnaea stagnalis. El gráfico muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal ya sea de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al. 2010 Detalles y estadísticas. Reimpresión con permiso de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
El protocolo presentado muestra cómo recolectar líquido seminal y la forma de probar esto en una forma biológicamente significativa. Aunque este procedimiento aquí se muestra usando el extracto de glándula de la próstata, el efecto de una sola proteína de fluido seminal purificado también se puede probar siguiendo el mismo procedimiento. Obviamente, en este tipo de pruebas, siempre es crucial incluir controles adecuados (tratamientos simulados) para garantizar que el procedimiento y / o el medio portador no afectan los parámetros en preguntas 14,16. Utilizando este método, ya se ha demostrado que existe una única proteína fluido seminal, a saber Ovipostatin, que media una reducción en la puesta de huevos 14,16. Esta proteína, producida en la glándula de la próstata y se transfiere durante el apareamiento junto con los espermatozoides, representa el primer componente líquido seminal caracterizaron completamente en un hermafrodita simultáneo y no, hasta ahora, no muestra ninguna similitud con las proteínas conocidas.
El hallazgo de que Ovipostaestaño reduce la producción de masa de huevo en el recipiente corrobora trabajos anteriores que indica que las sustancias en el semen pueden influir en la puesta de huevos 13-15. Mediante la transferencia de cantidades biológicamente relevantes (ver 3.2 16), uno puede demostrar de manera convincente que es una proteína de líquido seminal, y no la presencia de espermatozoides a sí mismos, que media la reducción observada en la puesta de huevos (Figura 1). Teniendo en cuenta que la recepción repetida del líquido seminal a través de apareamientos naturales aumenta la inversión por huevo 15, ahora se vuelve altamente relevante para cuantificar otros parámetros de la puesta de huevos. El protocolo presentado ahora proporciona los métodos necesarios para hacerlo. Aunque no se encontró efecto de Ovipostatin en el éxito de los huevos puestos por el receptor 16 de la eclosión, puede haber otras proteínas de fluidos seminales que actúan en concierto con esta proteína. Por lo tanto, los parámetros que deben ser cuantificados en este contexto - al lado por el que se números de la frecuencia y de los huevos - incluyen el tamaño del huevo, hatctiempo Hing, el desarrollo de crías y el tamaño de crías. Además, es posible observar los efectos sobre otros procesos femeninos que la puesta de huevos, como el almacenamiento y el uso de esperma, así como la asignación de recursos hacia la función reproductiva femenina y masculina 14,17. Es evidente que el método presentado es un instrumento para hacer frente a estas cuestiones de seguimiento, tanto en Lymnaea stagnalis y en otros caracoles de agua dulce.
En resumen, los experimentos con este espectáculo protocolo que transfieren fluido seminal proteínas afectan el desempeño reproductivo de la mujer del destinatario en estos hermafroditas simultáneos. Dado que pocos estudios han abordado este, es probable que sea mucho más común en la fertilización internamente hermafroditas que se refleja en la actualidad en la literatura científica. Especialmente cuando uno se da cuenta de que la elección de pareja pre-copulador y la competencia espermática se ha demostrado que desempeñan un papel importante en estos hermafroditas 14, que importanTS el potencial de tales proteínas de las glándulas accesorias masculinas a ser seleccionado sexualmente en este sistema. Por último, esta investigación ayuda a apoyar la noción de que el desarrollo de las proteínas del líquido seminal son de igual importancia para los hermafroditas simultáneos, ya que son para las especies separadas sexuado.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a MR Helmus para la voz en off, CM Popelier, S. y C. Ypenburg Levesque para la asistencia técnica. Esta investigación es financiada por la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), la Real Academia Holandesa de Artes y Ciencias (KNAW) y la Organización de Servicios Estudiantiles Japón (JASSO). Esta publicación fue apoyada por una beca de acceso abierto de la NWO a JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
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