Abstract
内部で動物を受精において、精液、通常一緒に射精精液または形成、精子に添加する。栄養および活性化に加えて、精子、精液中の成分はまた、精子ドナーの受精の成功を増強するために女性の生理機能に影響を与えることができる。多くの研究が別の男女との種ではこのような効果を報告しているが、いくつかの研究は、同時に雌雄同体の動物でこれに対処してきた。このビデオプロトコルは、モデル生物として同時に雌雄同体の淡水巻貝、大きな池カタツムリLymnaeaのモノアラガイを使用して、腹足類における精液の効果を研究するための方法を提示します。手順は、完全な前立腺抽出物を使用して示されているが、精液の個々の成分（ すなわち 、タンパク質、ペプチド、および他の化合物）は、同じ方法で試験することができる。産卵に射精コンポーネントの受領の影響は産卵の頻度の観点から定量化することができるとこのようなそれぞれの卵塊中の卵の数として、女性の生殖性能のより微妙な見積り。結果は、精液のタンパク質は、性選択のための重要性を強調し、この同時雌雄同体における女性の生殖出力に影響することを示している。
Introduction
転送時には、精子は通常、男性の付属腺で生成精液を伴う。いくつかの精液成分は栄養及び活性化精子1の役割を果たしているが、他の精子ドナー2-4の受精の成功を増加させるために、女性の生理機能に影響を与える。種が高度に無差別であり、効率的な精子の貯蔵および精子消化を有する場合、このような効果は特に、性的選択を介して、のために選択される。このような条件下では、精子ドナーは卵5の受精のために重く競う。男性の受精の成功のために精液の物質の重要性のための豊富な相関の証拠があるが、直接的な証拠はよりまれであり、いくつかの研究では、生理学的変化および/ または6の関与する物質の詳細に掘り下げています。
種では別々の男女（ すなわち 、男性と女性; gonochorists）といくつかのよく調査し、モデル仕様がありますESそれは精液成分とその効果に来る。例としては、ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエ6、マラリア蚊、 ハマダラカ 7、およびコクヌストモドキ、 コクヌスト 8が含まれています。それは生殖のこのモードは、動物界9を通じて共通しているにもかかわらず、（ すなわち 、個人が同時に機能的に男性と女性である）を同時に雌雄同体である種になるとこのような精液の研究は非常に稀です。付属腺物質の導入の最も顕著な雌雄同体の例は、おそらく物質は、皮下注射11,12、 すなわちを通じて精子ドナーによるもの移されるカタツムリ2,10、いわゆる愛-ダーツの撮影です精子と一緒に。しかし、彼らの精子と一緒に男性の付属腺の製品を転送する多くの同時雌雄同体が存在し、このような、ここで使用したモデル種とし て、大きな池がLymnaeaモノアラガイカタツムリ 。これまでの研究では、既に精液の受信は、この種の雌の生殖出力13〜15に影響し、複雑な精液タンパク質のいくつかは、16,17を特定されていることを実証した。
Koene ら 16で報告された方法を拡張したもので、このプロトコルの全体的な目標は、腹足類の軟体動物での産卵の様々なパラメータに精液タンパク質の効果をテストすることです。これは、標準化された実験室での培養物から性的隔離ドナーカタツムリの前立腺（精液を生産すなわち 、男性のアクセサリー腺）の解剖することによって達成される。第二に、ドナーの精子が精嚢から収集され、別の処理溶液が作られています。続いて、試験カタツムリを麻酔し、膣内、例えば、試験溶液（を注射し、一人で前立腺エキス、精子と前立腺エキス、単独の精子、単独のキャリア媒体）。これらのテストのカタツムリは、その後、産卵を記録するために、標準的な条件下で、週に次の日のために監視されています。卵塊をデジタルカウントし、様々なパラメータを測定するためにスキャンを集め、次いで孵化のために個々のバイアルに入れられる。約2週間後、孵化をカウントし、デジタル的に走査される。卵塊および孵化の両方のすべてのスキャンは、その後自由に利用可能な画像分析ソフトウェアパッケージを用いて分析する。
このプロトコルの大きな池のカタツムリの実験室株、Lymnaeaのモノアラガイは 、アムステルダムのVU大学で飼育されている、使 用されています。この種は雌雄同体における性選択と再生に関する質問を調査するためのモデルシステムとして機能します。動物の比較的大きなサイズは、実験的に非常にアクセスできるようになります。また、それは多くの（b）にモデル種として使用されるためiological分野は我々はすでに、これらの動物の基礎生物学について多くのことを知っている。この方法は、一般的には精液タンパク質を介して媒介される性選択のプロセスについての質問を勉強するのに役立ちます。これらは同時雌雄同体であるのでさらに、それは両性16,17が分離されている種においてそうであるように、そのようなタンパク質は、類似及び/又は異なる方法で作用するかどうかを検討することができる。
Protocol
1。飼育施設
- VU大学の1のような実験室での培養からLymnaeaモノアラガイ （L.）の大人の標本を入手します。
- 連続水交換を持って飼育施設（molluscarium）と実験タンク、両方で20℃の低銅水を維持する。
- 12時間：12時間で明/暗サイクルを設定します。
- 繁殖のために、大人のカタツムリの無農薬レタスを自由に餌TetraPhyll（魚料理）フレーク若い少年を養う。 24時間の時間枠内に配置されている卵塊から始めて、自分の年齢に応じて別々のタンクでカタツムリを維持する。
- カタツムリ一旦僅かに異なる条件下ならびにpseudoreplicationを防止するために維持された効果を回避するために、それらが返されていない飼育槽から除去される。
2。解剖
- 1週間カタツムリを分離し、THAを確保するために、 随意に彼らを養うTは、彼らは完全な精子と精液店舗を持っている。
- 実体顕微鏡、ピンと解剖プレート、小さな外科はさみ、粗調整と微鉗子、50のMgCl 2溶液、注射針（0.3ミリメートルX 13ミ リメートル）といくつかのペーパータオルで満たされた10ミリリットルの注射器を準備します。
- 塩化マグネシウム溶液（31.6±2.1ミリメートルと2.89±0.55グラムの湿重量の殻長と大人のかたつむりのため、一般的に3ミリリットル以上）を注入することにより、カタツムリを安楽死させる。 45°の角度で注射針で足を貫通し、カタツムリが弛緩し、（数秒以内）拡張残るまで穏やかに連続的に圧力を加えて注入する。注射針を取り外し、カタツムリは、（例えば、触手引っ込め反射が存在しないかどうかをチェックすることによって）安楽死されているかどうかを確認してください。
- 慎重に粗い鉗子を使用してその曲率以下のシェルを削除します。途中、静かにピンセットでこすることによって、シェルから殻軸筋を切り離す。優しくTをねじる彼は殻の巻き方向、以下、その殻をカタツムリ。
- 解剖板にカタツムリを置き、足の後端を突き止める。その後、ヘッドを通してピンを配置し、解剖を容易にするために、カタツムリ上のいくつかの緊張を置く。
- 後で解剖のための基準点となる女性の生殖口を、ローカライズ。
- 外科はさみや細かい鉗子を使用して、ちょうどマントルの縁の下に、最初の切開を行い、女性の生殖口に向かってカット。はさみ」ブレードの1つは、体壁の下に押された場合、唯一の体壁、および内部器官のいずれもが、切断されることを保証するためにわずかに持ち上げ。頭の方に生殖口の上に切断し続けると直線にカット。
- 前立腺（後方）と精嚢（前方に）ローカライズ。慎重にこれらのを解剖し、氷の上に保管してください。精液および/または精子を含有する試験溶液を作製するために、これらを使用しています。生理的Lymnaea SALを使用INEキャリア媒体として（5.83ミリモル/ LのCaCl 2·2H 2 O、3.76ミリモル/ Lの塩化マグネシウム·6H 2 O、42.69ミリモル/ LのNaCl、37.53ミリモル/ lのKCl）。
- 前立腺の内腔だけでなく、精嚢からの精子に存在する精液を収集します。その後、静かにその内容を表現し、鉗子で臓器組織を除去することにより、別々のバイアル内の生理食塩水の両方を一時停止。氷の上に保持し、同じ日に使用しています。その後、別の治療ソリューションを作成するためにこれらの懸濁液を混ぜる。
3。膣内注入
- 膣内注入手順を開始する前に、（シェルの先端部に合うように作ら）シリコンシェルモールドを作製し、1mmのシリンジ、1mmの直径10〜12センチメートルのシリコンチューブ、鈍化注射針（0.4ミリメートル×13ミリメートル）、粗い鉗子、鋭い注射針を備えた50のMgCl 2溶液で満たされた同一の10mlシリンジ。
- いくつかの治療で精液（または個々の精液タンパク質）に追加するために必要な精子を集める;生物学的に適切な用量は、前立腺と精嚢注射当たりの1/3に相当します。
注：代表的な結果のセクション（ 図1）3つの異なる治療法を用いた実験の結果を示す：コントロール（キャリア媒体、 すなわち 、生理食塩水）、Ovipostatin（特定され精液タンパク質の1）単独およびOvipostatin精子を伴う。また、近年交配した個体との性的-16を単離したままであった個体の前立腺の重量差を決定し、他の種での生物学的に適切な用量を推定する。 - 調製した試験溶液のそれぞれのために1ミリリットル注射器を準備します。 1液で各シリンジを記入し、内部に気泡がないことを確認してください。
- 各シリンジに鈍化注射針を取り付けます。
- 注射用110cmの最小長さを有する直径のシリコンチューブ。
- 慎重にチューブに穴を開けないように確認しながら、注射針を介してシリコンチューブをスライドさせ、ゆっくり注射器に圧力を適用することにより、チューブから空気を除去する。
- ポイント2.3と同じプロトコルに従うことによって、カタツムリを麻酔し。今回は50のMgCl 2を超える2〜3ミリリットルを注入しないようにしてください。
- 安定した位置を保存しておいて、シェルモールドにカタツムリを置く。
- （この場所はまた、淡水巻貝の他の種に適用されます）はっきり右触手と男性の生殖口に対する動物、前方の右側の白い点として見えている女性の生殖口を探します。遮るもののないアクセス権を持っていることを確認してください。
- シリコンチューブの端を持ち、ゆっくりと女性の生殖口にシリコンチューブの約2〜4ミリ挿入するために鉗子を使用してください。
- 慎重に注射器に圧力を印加し、試験溶液0.03ミリリットル注入する。半分分待ちチューブ内の圧力がチューブを取り外す前に、女性の管内に広がることを可能にするUTE。
- それが監視することができ、その隔離容器に扱わカタツムリを返し、それが実験槽内に鎮静からの回復を可能にする。
4。バイオアッセイ
- 識別のためにそれぞれのカタツムリにラベルを付け、その殻の長さを測定します。後者は生殖出力を定量化する際に関係する大きさの良好な指標である。
- 実験水槽内の水の交換を可能にするために穿孔されている460ミリリットルの容器に隔離各カタツムリを保管してください。これは、効率的な水の交換を可能にするために、水の流れの方向に穿孔して、正しい方向にあるすべてのコンテナを配置することが重要である。
- バイオアッセイの間に、レタスの標準化された量と定期的にカタツムリを養う。レタスをカットするラウンド、金属パンチャーを使用してください。このプロトコル19.6 cm 2のレタスディスクは、αを近似する、使 用されている彼らは最大限1日に食べることができますマウント。
- ヘラの平らな面を使用して卵塊を収集し、容器壁からの卵の塊をこすり。卵の塊を収集するためにスプーン側を使用してください。
注：ちょうど敷設された不透明な卵塊がスキャンに使用することはできません（これらは敷設後数時間以内に透明になる）。彼らは週に2〜3卵塊を生成するので、このプロトコルでのモデルの場合も、Lymnaeaはモノアラガイ 、毎日卵塊を確認してください。これは他の種で異なる場合があります。 - スキャナドライバを含む（ラップトップ）コンピュータ、フラットベッドスキャナ、標準ミリメートルスケール、ヘラ、皿やガラスのタイルを転送を使用して、デジタル的に収集された卵塊をスキャンします。
- 転送プレートに各卵の塊を置き、プレートがいっぱいになるまで繰り返します。その後、ペーパータオル上乾燥卵塊を軽くして転送するプレート上と同じ順序でガラスのタイルの上に転送します。
- （逆さまに各タイルを回し卵塊は、ガラスタイルに固執）、慎重にちょうどミリメートルスケールの下に、フラットベッドスキャナの上に置きます。それらはすべて同じ焦点面内に表示されるように均等に卵を配布する、これ卵塊を平らにするために、圧力のビットを適用します。すべての卵が均等に平坦化されていることを保証するために、二つのエッジの周りにテープの標準化された量のタイルにフィット。
- スキャナの設定を調整します。それは、その最大の解像度を調整プレビュースキャンを行い、作業領域をトリミングして、明るさとコントラストを調整することが重要である。卵塊をスキャンします。
- さらなる発展のために、独自のラベル20ミリリットルのガラスバイアル内の各卵の塊を置き、孵化。
- 適切に酸素化されたそれを維持するために一日おきにバイアルを孵化の水をリフレッシュ。次の順序で雛数とサイズに応じて次の操作を行います。（NO孵化）を注ぎ出していません/デカンティング（孵化の開始）をオーバーフローすると、ピペット（多くの孵化）と水を抽出する。
- 自由に利用できる画像解析ソフトImageJを（NIH、USA）およびセルカウンタプラグインをインストールする。
- オープンImageJのと同様にデータを転送するスプレッドシートプログラム。その後、ImageJの中で卵塊のスキャンされた画像を開きます。
- ミリメートルスケールに移動し、ズームツールを使用してスケールを設定します。ズームインすると、画面を埋めるために1ミリメートルのためのウィンドウを調整します。 1ミリメートルを示す2つの線の間のラインツールを使用して線を描画します。分析に移動し、スケールを設定します。ポップアップメニューで測定された長さのオプションが1に既知の距離を調整し、長さの単位mmで、目に見えるようになる。ボックスグローバルをチェックして、ウィンドウを閉じます。
- 分析に移動して優先測定（長さ、幅、円周）を設定し、面積やフェレ径（長さと幅）を選択することによって測定を設定します。確認し、解析する画像を続行するには、[OK]をクリックします。
- 卵を測定するには、ZO測定する必要がある最初の卵塊の卵に中OM。 800％のズームをお勧めします。次に、楕円ツールは（2回、同じ卵を測定防止するために）画像上で円周を描くように正確に卵を押して、Ctrl + Dを中心に楕円形を描く使用。そして、楕円形（長さ、幅、円周）の特性の測定値を記録するために、Ctrl + Mを押してください。ポップアップ画面には、測定値を表示する表示されます。
注：卵を測定するための楕円形のツールを使用すると、すべての種には適用されません。不均一形の卵種のため、代わりにフリーハンド選択を使用しています。 - 必要な数の卵を測定してから。XLSワークシートなどの施策を保存します。必要に応じて、ワークシートにデータを直接コピーします。
- その後、カウンタウィンドウを使用して、卵の塊内の卵をカウントし、ワークシートに手動でカウントを置く。
- あるいは、細胞カウンター·プラグインの助けを借りて卵質量当たりの個々の卵を数える。このために、プラグインに移動しますその後、細胞計数を分析し、選択します。セルカウンタウィンドウがポップアップ表示されます「初期化」ボックスとプレスのオリジナルを保持」にチェックマークを付けます。新しいカウンタウィンドウがツールバーの十字線ツールを選択し、セルカウンタメニューのカウンターの種類を選択し、表示されます。セルカウンタウィンドウに個々の卵をクリックすることで、個々の卵を数える。セルカウンタメニューのカウンタータイプの横の合計数を観察します。スプレッドシートに手動でこの番号をコピーしたり、結果を押して、結果を得る。
- 必要であれば、カウンター·タイプを追加することにより、1カウントイベント内で複数の卵塊を数えます。
Representative Results
図1は、対照物質（生理食塩水）のいずれかの膣内注入後に卵を産む動物の割合を示し、Ovipostatin、またはOvipostatinは精子を伴う。 Nはそれぞれの治療のために= 15; 。の詳細および統計用Koene ら 16を参照してください（出典：Koeneら 2010、PLoSの一つから図3）。
図1。Lymnaeaモノアラガイの卵大量生産に対するOvipostatinの影響グラフは対照物質（生理食塩水）のいずれかの膣内注入後に卵を産む動物の割合を示し、Ovipostatin、またはOvipostatinは精子を伴う。 Nはそれぞれの治療のために= 15; Koene ら 2010の詳細および統計を参照してください。 Koene らの許可を得て転載2010 PLoSのONE 5：E10117。
Discussion
提示されたプロトコルは、精液、どのように生物学的に意味のある方法でこれをテストするにはを収集する方法を示しています。ここでこの手順は、前立腺腺抽出物を用いて示されているが、単一の精製された精液タンパク質の効果も同じ手順に従って試験することができる。明らかに、このような試験では、処置および/ または担体媒体に質問14,16のパラメータに影響を及ぼさないことを保証するために適切なコントロール（偽処置）を含むことが常に重要である。この方法を用いて、既に14,16産卵の低下を媒介する単一の精液蛋白質、すなわちOvipostatinが存在することが示されている。前立腺で産生され、精子と一緒に交配中に転送このタンパク質は、同時雌雄同体で初めて完全に特性精液の成分を表しており、これまで、既知のタンパク質への類似性を示さない。
発見Oviposta錫は、レシピエントにおける卵の大量生産は、精液中の物質は、13〜15産卵に影響を与える可能性があることを示す初期の研究を裏付けて減少します。生物学的に適切な量（3.2 16を参照）を転送することによって、人は説得力のある（ 図1）産卵の観察された減少を媒介すること、精子の存在自体のそれは精液タンパク質であることを証明している、とすることはできません。自然交配を経由して精液を繰り返し受信が卵15あたりの投資を増加させることを考えると、それは今、産卵の他のパラメータを定量化するために、関連性の高いとなります。提示されたプロトコルは、ここで実行するために必要なメソッドを提供します。何の効果が受信者16によって産卵孵化成功にOvipostatinの認められなかったが、このタンパク質と協調して作用する他の精液のタンパク質があるかもしれません。したがって、この文脈で定量化が必要なパラメータ - 次の周波数と卵数を敷設するには、 - 卵サイズ、HATCを含む興時間、孵化開発や雛サイズ。また、このような精子の貯蔵と使用だけでなく、女性と男性機能14,17に向けた生殖リソースの割り当てなど産卵以外の女性プロセスへの影響を調べることが可能である。明らかに、提示された方法は、Lymnaeaモノアラガイで、その他の淡水巻貝の両方で、これらのフォローアップの問題に対処する上で役立つ。
要するに、精液タンパク質を転送し、このプロトコルのショーを用いた実験では、これらの同時雌雄同体で受信者の女性の生殖能力に影響を与える。いくつかの研究は、これに対処してきたことを考えると、それは、現在、科学文献に反映されるよりも、内部的に雌雄同体を受精においてはるかに一般的である可能性が高い。一方、プリ交尾配偶者選択と精子競争がこれら雌雄同体14において重要な役割を果たすことが示されていることを認識している場合は特にhighlightsは、例えば雄付属腺タンパク質の電位が性的に、このシステムで選択される。最後に、本研究では、彼らは別々の、性欲の種のためのもののように精液タンパク質が同時雌雄同体のために等しく重要であることを開発するという概念をサポートするのに役立ちます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は技術支援のためのボイスオーバー用のMR Helmus、CM Popelier、S. YpenburgとC.レベスクに感謝します。この研究は、財政的に科学研究費オランダ機構（NWO）、芸術科学オランダ王立アカデミー（KNAW）、日本学生支援機構（JASSO）でサポートされています。本書はJMKにNWOのオープンアクセスの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
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