Abstract
I internt gjødsling dyr, er sædvæsken vanligvis lagt til sædceller, sammen danner de sæd eller ejakulere. Foruten nærende og aktivere sperm, kan komponentene i sædvæsken også påvirke kvinners fysiologi kunne utfylle befruktning suksess av sæddonor. Mens mange studier har rapportert slike effekter i arter med separate kjønnene, har få studier adressert dette i samtidig tvekjønnet dyr. Denne videoen protokollen presenterer en metode for å studere effekter av sædvæsken i snegler, ved hjelp av en samtidig tvekjønnet ferskvannssnegl, den store dammen sneglen Lymnaea stagn, som modellorganisme. Mens fremgangsmåten er vist ved hjelp av komp prostata ekstrakter, kan hver av komponentene (det vil si, proteiner, peptider og andre forbindelser) fra den forutgående væske bli testet på samme måte. Effekter av mottak av ejakulere komponenter på egglegging kan kvantifiseres i form av frekvens for egglegging ogmer subtile estimater av kvinnelige reproduksjonsevne slik som egg tall innenfor hvert egg massene. Resultatene viser at sædvæsken proteiner påvirker kvinnelige reproduktive utgang i dette samtidig hermafroditt, fremhever deres betydning for seksuell seleksjon.
Introduction
Ved overføring, er sædceller som regel ledsaget av sædvæsken produseres av mannlige tilbehør kjertler. Mens noen ejakulere komponenter spiller roller i nærende og aktivere sperm 1, andre påvirke kvinners fysiologi for å øke befruktning suksess for sæddonor 2-4. Slike effekter er spesielt valgt for, via seksuell seleksjon, når en art er svært promiskuøse og har effektiv oppbevaring av sperm og sperm fordøyelsen. Under slike forhold, sædgiver konkurrere tungt for befruktning av egg fem. Mens det er rikelig correlational bevis for betydningen av sædvæsken stoffer for mannlige befruktning suksess, er direkte bevis mer sjeldne og få studier har dykket ned i detaljene i fysiologiske endringer og / eller stoffer som er involvert seks.
I arter med separate kjønnene (dvs. menn og kvinner; gonochorists) er det noen godt undersøkt modell spesies når det kommer til sædvæsken sammensetning og deres effekter. Eksempler inkluderer bananflue, Drosophila melanogaster 6, malariamyggen, Anopheles gambiae 7, og den røde mel bille, Tribolium castaneum åtte. Slike sædvæsken studier er mye sjeldnere når det gjelder arter som samtidig er tvekjønnet (dvs. individer er funksjonelt mannlige og kvinnelige samtidig), selv om denne modusen for reproduksjon er vanlig i hele dyreriket ni. Det mest bemerkelsesverdige tvekjønnet eksempel på overføring av et tilbehør kjertel stoffet er trolig skyting av såkalte love-dart i landsnegler 2,10, hvor stoffet er overført sæddonor via sprøyte injeksjon 11,12, dvs. ikke sammen med spermatozoa. Men det er mange samtidige hermafroditter som overfører mannlige tilbehør kjertel produkter sammen med sin sperm,slik som modellarter som brukes her, den store dammen snegle Lymnaea stagn. Tidligere forskning har allerede vist at mottak av sædvæsken påvirker den kvinnelige reproduktive produksjonen av denne arten 13-15, og flere av de involverte sædvæsken proteiner har blitt identifisert 16,17.
Det overordnede målet med denne protokollen, som er en utvidelse av metodene som ble rapportert i Koene et al 16, er å teste effekten av sædvæsken proteiner på ulike parametere for egglegging i gastropod bløtdyr. Dette gjøres ved disseksjon av prostatakjertelen (dvs., den mannlige tilbehør kjertel som produserer sædvæsken) av seksuelt isolert donor snegler fra en standardisert laboratoriekultur. For det andre er donorens sæd hentes fra sædblærene og ulike behandlingsløsninger er gjort. Deretter blir test snegler bedøvet og intravaginalt injisert med en testløsning (f.eksprostatakjertelen ekstrakt alene, prostatakjertel ekstrakt med sperm, sperm alene, carrier medium alene). Disse test snegler blir deretter overvåket for følgende dager til uker, under standardbetingelser, for å spille inn egglegging. Egg massene samles, digitalt skannet for telling og måling av ulike parametere, og deretter sette i enkelte ampuller for klekking. Etter ca to uker, blir hatchlings telles og digitalt skannet. Alle skanner, av både egg massene og hatchlings, blir deretter analysert ved hjelp av en fritt tilgjengelig bildeanalyse programvarepakke.
For denne protokollen laboratoriet stamme av den store dammen sneglen, Lymnaea stagn, blir brukt, som er avlet ved Vrije Universitet i Amsterdam. Denne arten fungerer som et modellsystem for å undersøke spørsmål om seksuell seleksjon og reproduksjon i hermafroditter. Dyrets relativt store størrelse gjør det eksperimentelt svært tilgjengelig. I tillegg, fordi det er brukt som en modellarter i mange biological disipliner vi allerede vet mye om den grunnleggende biologi av disse dyrene. Denne metoden vil bidra til å studere spørsmål om prosesser av seksuell seleksjon som medieres via sædvæsken proteiner generelt. I tillegg, fordi disse samtidige hermaphrodites, er det mulig å ta opp om slike proteiner opptre like og / eller ulike måter som de gjør i forbindelser hvor kjønnene separeres 16,17.
Protocol
En. Avl Facility
- Skaff voksne eksemplarer av Lymnaea stagn (L.) fra et laboratorium kultur som den på VU University.
- Oppretthold lav-kobber vann ved 20 ° C både i avl innretning (molluscarium) og eksperimentelle tanker, som har kontinuerlig vannutskifting.
- Sett lys / mørke syklus på 12 timer: 12 hr.
- For avl, mate voksne snegler plantevernmiddel-free salat ad libitum, mate de små yngel med TetraPhyll (fiskefôr) flak. Oppretthold snegler i separate tanker i henhold til deres alder, fra egg massene som er lagt innenfor en 24-timers tidsramme.
- Når sneglene er fjernet fra hekke tanker de ikke er returnert, for å unngå virkningene av å ha blitt holdt under litt andre forhold, samt å hindre pseudoreplication.
2. Dissection
- Isoler sneglene for en uke, og mate dem ad libitum, for å sikre that de har full sæd og sædvæsken butikker.
- Forbered en stereo mikroskop, en disseksjon plate med pinner, små kirurgiske saks, grove og fine tang, en 10 ml sprøyte fylt med en 50 mM MgCl 2-løsning, kanyler (0,3 mm x 13 mm) og noen papirhåndklær.
- Avlive en snegl ved injisering av MgCl2-løsning (vanligvis 3 ml eller mer for et voksent snegler med et skall lengde på 31,6 ± 2,1 mm, og våtvekten av 2,89 ± 0,55 g). Trenge foten med kanylen i en 45 ° vinkel og injisere ved å forsiktig bruke press kontinuerlig til sneglen slapper av og forblir utvidet (i løpet av sekunder). Fjern kanylen og sjekke om sneglen avlives (for eksempel ved å sjekke om det tentakkel tilbaketrekking refleks er fraværende).
- Fjern forsiktig skallet etter at krumning ved hjelp av grove tang. Halvveis, forsiktig løsne columellar muskel fra skallet ved å skrape med pinsett. Vri forsiktig tHan snegle ut av skallet, som følge av viklingen retningen av skallet.
- Plasser sneglen på disseksjon plate og peke ut den bakre delen av foten. Deretter plasserer en pinne gjennom hodet og legge litt spenning på sneglen å lette disseksjon.
- Lokaliser den kvinnelige gonopore, som vil senere bli et referansepunkt for disseksjon.
- Bruke kirurgiske saks og fin pinsett, ta det første snittet, like under kanten av mantelen og skar inn i kvinnelige gonopore. Når en av saks 'bladene skyves under kroppsveggen, løftes litt opp for å sikre at bare den kroppsveggen, og ingen av de indre organer, er kuttet. Fortsett å skjære over gonopore mot hodet og klippes i en rett linje.
- Lokaliser prostatakjertelen (posterior) og sædblærene (anterior). Dissekere disse ut, og oppbevar dem på is. Bruke disse for å gjøre testløsninger inneholdende forutgående væske-og / eller sperm. Bruk fysiologiske Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6 H 2 O, 42.69 mmol / l NaCl, 37.53 mmol / l KCl) som bæremedium.
- Samle sædvæsken som er til stede i lumen av prostatakjertelen samt spermier fra sædblærene. Deretter suspendere både i saltvann i separate hetteglass ved forsiktig uttrykke deres innhold og fjerne organ vev med en tang. Hold på is og bruke den samme dagen. Senere, blande disse suspensjoner til å lage de forskjellige behandlingsløsninger.
Tre. Intravaginal Injection
- Før start av intravaginal injeksjonsprosedyre fremstille en silisium skall-formen (laget for å passe til enden av skallet), 1 mm sprøyter, 10 til 12 cm silisium-rør med en diameter på 1 mm, avstumpet injeksjonsnåler (0,3 mm x 13 mm ), grove pinsett og det samme 10 ml sprøyte fylles med en 50 mM MgCl 2-løsning utstyrt med en skarp injeksjonsnål.
- Samle sperm, som trengs for å legge til sædvæsken (eller individuelle sædvæsken proteiner) i noen behandlinger; en biologisk relevant dose tilsvarer 1/3 av en prostatakjertel og sædvæske per injeksjon.
MERK: I den representative resultater seksjonen (Figur 1) resultatene av et eksperiment med tre ulike behandlinger er vist: Control (carrier medium, dvs. saltvann), Ovipostatin (en av de identifiserte sædvæsken proteiner) alene og Ovipostatin akkompagnert med sperm. I tillegg til å anslå biologisk relevant dose hos andre arter, bestemme forskjellen i vekt av prostatakjertelen av personer som nylig har parret og enkeltpersoner som forble seksuelt isolert 16. - Forbered en ml sprøyter for hver av de preparerte test løsninger. Fyll hver sprøyte med en løsning og at det ikke er luftbobler inne.
- Monter en avstumpet kanyle på hver sprøyte.
- For injeksjon bruke en 1mm diameter silisium rør med en lengde på minst 10 cm.
- Skyv silisium slangen over kanylen, og pass på ikke å pierce røret, og fjerne luft fra røret ved å forsiktig påføre press på sprøyten.
- Anaesthetize en snegle ved å følge den samme protokollen som i punkt 2.3. Denne gangen sørg for ikke å injisere mer enn 2-3 ml 50 mM MgCl 2.
- Lå sneglen i skallet-mold å holde den i en stabil posisjon.
- Finn den kvinnelige gonopore, som er godt synlig som en hvit flekk på høyre side av dyret, anterior til høyre tentakkel og mannlige gonopore (denne plasseringen gjelder også andre arter av ferskvannssnegler). Sørg for å ha uhindret tilgang.
- Bruk en tang for å holde enden av silisiumrøret og forsiktig sett omtrent 2-4 mm av silisium røret inn i hunn gonopore.
- Nøye bruke trykk til sprøyten og injisere 0,03 ml av testoppløsningen. Vent et halvt minute for å tillate at trykket i røret for å spre seg inn i hunn-tarmkanalen før de tas av røret.
- Returnere det behandlede sneglen sin isolasjon container, hvor det kan bli overvåket, og at det å komme seg fra sedasjon i forsøkstanken.
4. Bioassay
- Label hver snegl for identifisering og måle dens skall lengde. Sistnevnte er en god indikator på den størrelse, som er relevant når kvantifisere reproduksjons utgang.
- Hold hver snegl isolert i en 460 ml beholder som er perforert for å tillate vannutveksling innen eksperimentell tank. Det er viktig å plassere alle beholdere i riktig retning, med perforeringene i retning av vannstrømmen, for å tillate effektiv vannutskifting.
- Under bioassay, mate snegler regelmessig med en standardisert mengde salat. Bruk en rund metall puncher å kutte salat. I denne protokollen salat plater på 19,6 cm 2 er brukt, som tilnærmer den enmontere de maksimalt kan spise på en dag.
- Samle et egg masse ved hjelp av den flate siden av en slikkepott og skrap egget masse fra beholderen veggen. Bruk skjeen side å samle inn egg masse.
MERK: Opaque egg massene som nettopp har blitt lagt, kan ikke brukes for skanning (de blir gjennomsiktig løpet av noen få timer etter legging). For modellarter i denne protokollen, Lymnaea stagn, se etter egg massene hver dag, siden de produserer 2-3 egg massene per uke. Dette kan være forskjellig i andre arter. - Skanne de innsamlede egg massene digitalt, ved hjelp av en (bærbar) datamaskin som inneholder skannerdriveren, en flat bed scanner, en standard millimeter skala, en slikkepott, overføre tallerkener og glass fliser.
- Plasser hvert egg masse på de overfører platene og gjenta til platene er fulle. Deretter DAB egg massene tørke på kjøkkenpapir og overføre dem til glassfliser i samme rekkefølge som på de overfører platene.
- Snu hver flis opp ned (denegg massene vil feste seg til glasset flis) og forsiktig plasserer den på planskanneren, rett under millimeterskala. Påfør litt press for å flate ut egg massene, som vil fordele eggene jevnt slik at de er alle synlige innenfor samme fokusplanet. Monter flisene med en standardisert mengde tape rundt to kanter for å sikre at alle eggene er flatet likt.
- Juster skannerinnstillingene. Det er viktig å justere oppløsningen på full styrke, gjøre en forhåndsskanning, beskjærer arbeidsområdet, og justere lysstyrke og kontrast. Skann egg massene.
- Plasser hvert egg masse i sin egen merket 20 ml hetteglass for videreutvikling og klekking.
- Oppdater vannet i klekke ampuller annenhver dag for å holde det ordentlig oksygenrikt. Gjør dette i henhold til hatchling antall og størrelse, i følgende rekkefølge: dekantering / helle av (ingen hatchlings), overfylte (starten på klekking), og trekke ut vannet med en pipette (mange hatchlings).
- Installer den fritt tilgjengelig programvare for bildeanalyse ImageJ (NIH, USA) og celleteller plugin.
- Åpen ImageJ samt et regnearkprogram for å overføre dataene til. Deretter åpner du et skannet bilde av egg massene i ImageJ.
- Still skalaen ved å bruke zoomverktøyet til å navigere til millimeterskala. Zoom inn og justere vinduet for en mm for å fylle opp skjermen. Tegn en linje ved hjelp av linjeverktøy mellom de to linjene som indikerer en mm. Naviger til å analysere, og Set skala. I pop-up menyen målt lengde alternativet blir synlig, justere kjent avstand til en og lengdeenhet til mm. Kryss av i boksen Utland, og lukke vinduet.
- Sett de foretrukne målinger (lengde, bredde, omkrets) ved å navigere til Analysere, og Set Målinger ved å velge Område og Feret diameter (lengde og bredde). Klikk OK for å bekrefte og fortsette med bildet analyser.
- For å måle eggene, zoOM in på en egg av den første egg massen som skal måles. En zoom på 800% anbefales. Deretter bruker elliptiske verktøyet tegne en oval nøyaktig rundt egget, trykker du ctrl + D for å trekke omkretsen på bildet (for å unngå å måle den samme egg to ganger). Deretter trykker du ctrl + M for å spille inn et mål på egenskapene til den ovale (lengde, bredde, omkrets); en pop-up-skjermen åpner viser målingene.
MERK: Bruken av den elliptiske verktøy for å måle eggene ikke gjelder for alle arter. For arter med ikke-uniformt formet egg, bruker frihånd valg i stedet. - Mål så mange egg som nødvendige og deretter lagre de tiltak som. Xls-regneark. Eventuelt, kopier data direkte inn i et regneark.
- Deretter telle eggene innen et egg masse, ved å bruke disken vinduet og sette de teller manuelt inn i regnearket.
- Alternativt telle de enkelte egg per egg masse ved hjelp av celleteller plug-in. For dette, gå til Plug-ins,deretter, analysere og velg Celleteller. Den celleteller vindu vil dukke opp, sjekk 'holde opprinnelige' boksen og trykk 'initial'. En ny tellervinduet vises, velger trådkorset verktøyet fra verktøylinjen og velg en teller type i celleteller menyen. Telle de enkelte egg ved å klikke på de enkelte egg i celleteller vinduet. Observere det totale antallet ved siden av disken type i celleteller menyen. Kopier dette nummeret manuelt til et regneark eller oppnå resultater ved å trykke Resultater.
- Count flere egg massene innen ett telling hendelsen ved å legge benketyper, om nødvendig.
Representative Results
Fig. 1 viser prosent dyr legger egg etter intravaginal tilførsel av enten styre stoff (saltoppløsning), Ovipostatin eller Ovipostatin sammen med sæden. N = 15 for hver behandling; se Koene et al 16 for detaljer og statistikk (Kilde: Figur 3 fra Koene et al 2010, PLoS ONE.)..
Figur 1 Effekt av Ovipostatin på egg masseproduksjon av Lymnaea stagn.. Grafen viser hvor mange prosent av dyr legger egg etter intravaginal injeksjon av enten styre substans (saltvann), Ovipostatin, eller Ovipostatin akkompagnert med sperm. N = 15 for hver behandling; se Koene et al. 2010 detaljer og statistikk. Opptrykk med tillatelse fra Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Den presenterte protokollen viser hvordan å samle sædvæsken og hvordan du kan teste dette i et biologisk meningsfull måte. Selv om denne fremgangsmåten her er vist ved hjelp av prostatakjertel-ekstrakt, kan effekten av en enkelt renset sædvæske protein også testes ved å følge samme prosedyre. Selvfølgelig, i slike tester er det alltid viktig å inkludere passende kontroller (sham-behandling) for å sikre at fremgangsmåten og / eller bærematerialet ikke påvirker parametrene i spørsmål 14,16. Ved hjelp av denne fremgangsmåte, har det allerede blitt vist at det er en enkelt forutgående væske protein, nemlig Ovipostatin, som medierer en reduksjon av egglegging 14,16. Dette proteinet, som produseres i prostatakjertelen og overført under paring sammen med sædceller, representerer den første fullstendig karakterisert sædvæsken komponent i en simultan hermafroditt og gjør, så langt, ikke viser noen likheter med kjente proteiner.
Oppdagelsen av at Ovipostatinn reduserer egg masseproduksjon i mottakeren bekrefter tidligere arbeidet som indikerer at stoffer i sæden kan påvirke egglegging 13-15. Ved å overføre biologisk relevante mengder (se 3.2 16), kan en overbevisende måte viser at det er en forutgående væske protein, og ikke tilstedeværelsen av spermatozoa seg selv, som medierer den observerte reduksjonen i egglegging (figur 1). Gitt at gjentatt mottak av sædvæsken via naturlige parringer øker investeringen per egg 15, nå blir det svært relevant å kvantifisere andre parametre for egglegging. Den presenterte protokollen gir nå de nødvendige metoder for å gjøre dette. Selv om ingen effekt ble funnet av Ovipostatin på hekkesuksess av egg lagt av mottakeren 16, kan det være andre sædvæsken proteiner som fungerer i samspill med dette proteinet. Derfor parametere som må kvantifisert i denne sammenheng - ved å legge frekvens og egg nummer - inkluderer egg størrelse, hatchengsle tid, hatchling utvikling og hatchling størrelse. I tillegg er det mulig å se på effekter på andre kvinnelige prosesser enn egglegging, for eksempel sperm lagring og bruk, så vel som til anvendelse av reproduksjons ressurser mot den kvinnelige og mannlige funksjon 14,17. Åpenbart er det presentert metoden instrumental i å ta opp disse oppfølgingsspørsmål, både i Lymnaea stagn og i andre ferskvann snegler.
I sum, eksperimenter ved hjelp av denne protokollen viser at overførte sædvæsken proteiner påvirker den kvinnelige reproduksjonsevnen til mottakeren i disse samtidige hermafroditter. Gitt at få studier har adressert dette, er det sannsynlig å være mye mer vanlig i internt gjødsling hermafroditter enn det som er reflektert i den vitenskapelige litteraturen. Spesielt når man innser at pre-copulatory partnervalg og sperm konkurranse har vist seg å spille en viktig rolle i disse hermafroditter 14, som highlights potensialet av slike hann tilbehør kjertel proteiner å være seksuelt valgt i dette systemet. Til slutt, hjelper denne forskningen for å støtte utviklingen av forestillingen om at sædvæsken proteiner er av like stor betydning for samtidige hermafroditter som de er for separate-sexed arter.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker MR Helmus for voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg og C. Levesque for teknisk assistanse. Denne forskningen er økonomisk støttet av den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO), Royal nederlandske Academy of Arts and Sciences (knaw) og Japan Student Services Organization (Jasso). Denne publikasjonen ble støttet av en Open Access-stipend på NWO til JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen. , Springer-Verlag. (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. Sexual Conflict. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , Elsevier. (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
