Abstract
I internt gödsling djur, är sädesvätska brukar läggas till spermier, tillsammans bildar sperma eller ejakulat. Förutom närande och aktivering av spermier, kan komponenterna i sädesvätskan också påverka kvinnliga fysiologin att öka befruktning framgång spermadonator. Även om många studier har rapporterat sådana effekter i arter med olika könen, har få studier behandlas detta i samtidigt hermafroditiska djur. Denna video-protokollet presenteras en metod för att studera effekterna av sädesvätska i snäckor, med användning av en samtidigt hermafroditiska sötvattenssnäcka, den stora dammsnäcka Lymnaea stagn, som modellorganism. Medan förfarandet visas med hjälp av kompletta prostatakörteln extrakt, kan enskilda komponenterna (dvs proteiner, peptider och andra föreningar) i sädesvätskan testas på samma sätt. Effekter av mottagandet av ejakulerar komponenter på äggläggning kan kvantifieras i termer av frekvens för äggläggning ochmer subtila bedömningar av kvinnliga reproduktionsförmåga, såsom ägg nummer inom varje ägg massorna. Resultaten visar att sädesvätska proteiner påverkar kvinnliga reproduktionskapaciteten i denna samtidiga hermafrodit, belysa deras betydelse för sexuell selektion.
Introduction
Vid överlåtelse är spermier brukar åtföljas av sädesvätska produceras av manliga tillbehör körtlar. Medan vissa ejakulat komponenter spelar roller i närande och aktivering av spermier 1, andra påverkar kvinnlig fysiologi i syfte att öka fertilisering framgång spermoljedosering 2-4. Sådana effekter är särskilt utvalda för att, via sexuell selektion, när en art är mycket promiskuösa och har effektiv spermier lagring och sperma matsmältning. Under sådana förhållanden, spermadonatorer tävlar tungt för befruktning av ägg 5. Samtidigt som det finns rikligt Correlational belägg för betydelsen av sädesvätskan ämnen för manlig befruktning framgång, är direkta bevis mer sällsynta och få studier har grävde i detaljerna i fysiologiska förändringar och / eller substanser som ingår 6.
I arter med skilda kön (dvs män och kvinnor, gonochorists) finns det några väl undersökt modell species när det kommer till sädesvätska sammansättning och deras effekter. Exempel på detta är fruktflugan, Drosophila melanogaster 6, malariamyggan, Anophelesgambiae 7, och den röda mjölbagge, Tribolium castaneum 8. Sådana sädesvätska studier är mycket ovanligare när det gäller arter som samtidigt är hermafroditer (dvs individer är funktionellt manligt och kvinnligt på samma gång), även om denna typ av reproduktion är vanligt i hela djurriket 9. Den mest anmärkningsvärda hermafroditiska exempel på överföring av ett tillbehör körtel ämne är förmodligen inspelningen av så kallade kärleks dart i mark sniglar 2,10, där ämnet överförts av den spermadonator via subkutan injektion 11,12, dvs inte tillsammans med spermier. Men det finns många samtidiga hermafroditer som överför manliga tillbehör körtel produkter tillsammans med deras sperma,såsom modellarter som används här, den stora dammen snigel Lymnaea stagn. Tidigare forskning har redan visat att mottagandet av sädesvätska påverkar kvinnliga reproduktiva produktionen av denna art 13-15, och flera av de inblandade sädesvätska proteiner har identifierats 16,17.
Det övergripande målet för detta protokoll, som är en förlängning av de metoder som redovisas i Koene et al 16, är att testa effekterna av sädesvätska proteiner på olika parametrar för äggläggning i snäckor. Detta åstadkoms genom dissektion av prostatakörteln (dvs den manliga tillbehör körtel som producerar sädesvätskan) av sexuellt isolerade givar sniglar från en standardiserad laboratoriekultur. För det andra är donatorns sperma som samlats in från sädesblåsorna och olika behandlingslösningar görs. Därefter prov sniglar bedövades och intravaginalt injiceras med en testlösning (t.ex.prostatakörtelextrakt ensam, prostatakörtelextrakt med spermier, enbart spermier, enbart bärarmedium). Dessa test sniglar sedan kontrolleras för följande dagar till veckor, under normala förhållanden, för att spela in äggläggning. Egg massor samlas, digitalt skannas för att räkna och mäta olika parametrar, och sedan lägga i enskilda flaskor för kläckning. Efter ungefär två veckor är ungarna räknas och digitalt skannas. Alla skanningar, av både ägg massor och ungar, analyseras sedan med hjälp av en fritt tillgänglig bildanalys programpaket.
För detta protokoll laboratorium stam av stora dammsnäcka, Lymnaea stagn, används, som är uppfödd vid VU University i Amsterdam. Arten fungerar som ett modellsystem för att utreda frågor om sexuellt urval och reproduktion i hermafroditer. Djurets relativt stora storlek gör det experimentellt mycket tillgänglig. Dessutom, eftersom det används som modell i många biological discipliner som vi redan vet en hel del om den grundläggande biologin av dessa djur. Denna metod kommer att hjälpa till att studera frågor om processer av sexuell selektion som förmedlas via sädesvätska proteiner i allmänhet. Dessutom, eftersom dessa är samtidiga hermafroditer, är det möjligt att ta itu med om sådana proteiner agerar i liknande och / eller olika sätt som de gör i arter där könen separeras 16,17.
Protocol
1. Avels Facility
- Skaffa vuxna exemplar av Lymnaea stagn (L.) från en laboratoriekultur som den vid VU University.
- Bibehålla den låga koppar vatten vid 20 ° C i både avelsanläggning (molluscarium) och experimentella tankar, som har kontinuerlig vattenomsättning.
- Ställ in ljus / mörkercykel på 12 tim: 12 tim.
- För avel, mata vuxna sniglar bekämpningsmedel sallad efter behag, mata unga ungdomar med TetraPhyll (fiskmat) flingor. Behåll sniglar i separata tankar beroende på deras ålder, från ägg massor som läggs inom en 24 tim tidsram.
- När sniglar tas bort från avelstankar de inte returneras, för att undvika effekterna av att ha vårdats under lite olika förhållanden samt att förhindra pseudoreplication.
2. Dissection
- Isolera sniglarna för en vecka, och mata dem efter behag, för att säkerställa that de har full spermier och sädesvätska butiker.
- Förbered ett stereomikroskop, en dissektion platta med stift, små kirurgiska saxar, grov och fin pincett, en 10 ml spruta fylld med en 50 mM MgCl2-lösning, injektionsnålar (0,3 mm x 13 mm) och några pappershanddukar.
- Euthanize en snigel genom att injicera MgCl2-lösning (i allmänhet 3 ml eller mer för vuxna sniglar med skal längd på 31,6 ± 2,1 mm och våt vikt av 2,89 ± 0,55 g). Penetrera foten med injektionsnålen i 45 ° vinkel och injicera genom att försiktigt sätta press kontinuerligt tills snigeln slappnar av och förblir förlängd (inom några sekunder). Ta bort injektionsnålen och kontrollera om snigeln är avlivas (till exempel genom att kontrollera om tentakel tillbakadragande reflex är frånvarande).
- Ta försiktigt bort skalet efter det krökning med hjälp av grova pincett. Halvvägs försiktigt loss columellar muskeln från skalet genom att skrapa med pincett. Vrid försiktigt than snigel ur sitt skal, efter den slingrande riktning av skalet.
- Placera snigel på dissekering plattan och hålla fast den bakre änden av foten. Sedan placera ett stift genom huvudet och sätta lite spänning på snigeln för att underlätta dissektion.
- Lokalisera den kvinnliga gonopore, som kommer senare att bli en referenspunkt för dissekering.
- Med hjälp av kirurgisk sax och fin pincett, gör den första snittet, strax under kanten på manteln och löpte i den kvinnliga gonopore. När en av sax "bladen trycks under kroppen väggen, lyft upp den en aning för att se till att endast kroppen väggen, och ingen av de inre organen, kapas. Fortsätt skärning ovanför gonopore mot huvudet och skars i en rak linje.
- Lokalisera prostatakörteln (bakre) och sädesblåsorna (främre). Dissekera dessa ut försiktigt och hålla dem på is. Använd dessa för att göra testlösningar som innehåller sädesvätska och / eller spermier. Använd fysiologisk Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl2 • 2 H2O, 3,76 mmol / l MgCl2-6 H2O, 42,69 mmol / l NaCl, 37,53 mmol / L KCl) såsom ett bärarmedium.
- Samla upp sädesvätska, som är närvarande i lumen av prostatakörteln samt spermier från sädesblåsorna. Därefter avbryta både i saltlösning i separata flaskor genom att försiktigt uttrycka deras innehåll och ta bort organvävnad med en pincett. Håll på is och använd samma dag. Senare, blanda dessa suspensioner för att skapa de olika behandlingslösningar.
3. Intravaginal Injection
- Innan intravaginal injektionen, förbereda en kiselskal-formen (för att passa spetsen av skal), 1 mm sprutor, 10-12 cm silikon slang med en diameter på 1 mm, trubbiga kanyler (0,3 mm x 13 mm ), grova pincett och samma 10 ml spruta fylld med en 50 mM MgCl2-lösning försedd med en skarp injektionsnål.
- Samla upp spermier, som behövs för att lägga till sädesvätskan (eller enskilda sädesvätska proteiner) i vissa behandlingar; en biologiskt relevant dos motsvarar 1/3 av en prostatakörteln och sädesblåsa per injektion.
OBS: I den representativa resultat sektionen (figur 1) Resultaten av ett experiment med tre olika behandlingar visas: Kontroll (bärare medium, det vill säga, saltlösning), Ovipostatin (en av de identifierade sädesvätska proteiner) ensam och Ovipostatin tillsammans med spermier. Dessutom, för att uppskatta den biologiskt relevanta dosen i andra arter, bestämma skillnaden i vikt av prostatakörteln av individer som nyligen har parat sig och individer som förblev sexuellt isolerade 16. - Bered en ml sprutor för vardera av de preparerade provlösningarna. Fyll varje spruta med en lösning och se till att det inte finns några luftbubblor inuti.
- Montera en trubbig injektionsnål för varje spruta.
- För injektion använda en enmm diameter kisel rör med en minsta längd av 10 cm.
- Skjut försiktigt silikonröret över injektionsnålen, se till att inte tränga igenom röret och ta bort luft från röret genom att försiktigt applicera trycket på sprutan.
- Söva en snigel genom att följa samma protokoll som i punkt 2.3. Den här gången se till att inte skjuta till mer än 2-3 ml 50 mM MgCl2.
- Lägg snigeln i skalet-formen för att hålla den i ett stabilt läge.
- Leta reda på den kvinnliga gonopore, vilket syns tydligt som en vit fläck på den högra sidan av djuret, främre till höger tentacle och manliga gonopore (denna plats gäller även för andra arter av sötvattenssniglar). Se till att ha fri tillgång.
- Använd en pincett för att hålla i slutet av kisel röret och försiktigt in ca 2-4 mm i kisel röret i kvinnliga gonopore.
- Tillämpa försiktigt tryck på sprutan och injicera 0,03 ml av testlösningen. Vänta en halv minutute för att medge trycket i röret för att sprida sig i den kvinnliga tarmkanalen innan du tar bort röret.
- Returnera behandlade snigeln till sin isolering behållare, där det kan övervakas, och låta den återhämta sig från sedering i försökstanken.
4. Bioanalys
- Märk varje snigel för identifiering och mät dess skallängd. Det senare är en bra indikator på storlek, vilket är relevant när kvantifiera reproduktionskapaciteten.
- Håll varje snigel isolerade i en 460 ml behållare som är perforerad för att möjliggöra vattenutbyte inom den experimentella tanken. Det är viktigt att placera alla behållarna i rätt orientering, med perforeringarna i riktningen för vattenflödet, för att möjliggöra effektiv vattenutbyte.
- Under bioassay, mata sniglar regelbundet med en standardiserad mängd av sallad. Använd en rund, metall hålslag för att skära sallad. I detta protokoll sallad skivor på 19,6 cm 2 används, vilket approximerar enmontera de maximalt kan äta på en dag.
- Samla ett ägg massa med hjälp av den platta sidan av en spatel och skrapa ägget massan från behållarens vägg. Använd sked sidan för att samla ägg massan.
OBS: Ogenomskinlig ägg massor som bara har som inte kan användas för att skanna (de blir genomskinliga inom några timmar efter läggning). För modellarter i detta protokoll, Lymnaea stagn, kontrollera om ägg massor varje dag, eftersom de producerar 2-3 ägg massor per vecka. Detta kan skilja sig åt i andra arter. - Scanna de insamlade ägg massorna digitalt, med hjälp av en (bärbar dator) dator som innehåller skannerdrivrutinen, ett flak scanner, en vanlig millimeterskala, en spatel, överföring tallrikar och glas kakel.
- Placera varje ägg massan på överför plattorna och upprepa tills plattorna är fulla. Därefter, sandskädda ägget massorna torka på hushållspapper och överföra dem på glasplattor i samma ordning som på överföringsplattorna.
- Vänd varje platta upp och ned (denägg massorna fastnar på glas kakel) och försiktigt placera den på flatbäddsskannern, knappt millimeterskala. Applicera lite tryck för att platta till ägget massorna, vilket distribuerar äggen jämnt så att de är alla synliga i samma fokusplan. Montera plattorna med en standardiserad mängd tejp runt två kanter för att säkerställa att alla ägg är tillplattade lika.
- Justera skannerinställningarna. Det är viktigt att justera upplösningen till max, göra en förhandsskanning, beskär arbetsområdet, och justera ljusstyrka och kontrast. Skanna ägg massorna.
- Placera varje ägg massa i sin egen märkt 20 ml glasflaska för vidare utveckling och kläckning.
- Uppdatera vattnet i kläckning flaskor varannan dag för att hålla det ordentligt syresatt. Gör detta enligt hatchling antal och storlek i följande ordning: dekantering / hälla ut (inga ungar), överfyllda (start kläckning), och utvinna ur vattnet med en pipett (många ungar).
- Installera fritt tillgängliga bildanalys programvara ImageJ (NIH, USA) och cellräknare plugin.
- Öppna ImageJ samt ett kalkylprogram för att överföra data till. Öppna sedan en skannad bild av ägg massor i ImageJ.
- Ställ in skalan med hjälp av zoomverktyget för att navigera till millimeterskala. Zooma in och justera fönstret för 1 mm för att fylla upp skärmen. Rita en linje med hjälp av linjeverktyget mellan de två linjer som indikerar 1 mm. Navigera till Analysera och Set skala. I popup-menyn alternativet uppmätta längden blir synlig, justera kända avstånd till 1 och längdenhet till mm. Kryssa i rutan Global, och stäng fönstret.
- Ställ in önskade mått (längd, bredd, omkrets) genom att gå till Analysera och Set Mätningar genom att markera området och Ferets Diameter (längd och bredd). Klicka på OK för att bekräfta och fortsätta med bildanalyser.
- För att mäta de ägg, zoOm i på ett ägg av det första ägget massa som måste mätas. En zoomning av 800% rekommenderas. Sedan, med hjälp av elliptiska verktyget rita en oval precis runt ägget, tryck Ctrl + D för att dra omkretsen på bilden (för att förhindra att mäta samma ägg två gånger). Tryck sedan på Ctrl + M för att spela in ett mått på egenskaperna hos den ovala (längd, bredd, omkrets); en pop-up-skärmen öppnas visar mätningarna.
OBS: Användning av den elliptiska verktyg för att mäta ägg gäller inte för alla arter. För arter med icke-enhetligt formade ägg, använd frihand val istället. - Mät så många ägg som är nödvändiga och sedan spara de åtgärder som. Xls kalkylblad. Eventuellt kopiera data direkt i ett kalkylblad.
- Därefter räknar äggen i ett ägg massa, med hjälp av disken fönstret och sätta räknas manuellt i kalkylbladet.
- Alternativt kan räkna de enskilda ägg per ägg massan med hjälp av cellräknare plug-in. För detta, gå till plugin-program,då, Analysera och välj Cell räknare. Cellräknare Fönstret kommer att dyka upp, kontrollera "behålla original" rutan och tryck på "initiera". En ny disk fönster visas väljer hårkorset verktyget i verktygsfältet och välj en disk typ i cellräknaren menyn. Räkna de enskilda äggen genom att klicka på de enskilda äggen i cellräknare fönstret. Beakta totalantal bredvid den typ räknare i cellräknaren menyn. Kopiera detta nummer manuellt på ett kalkylark eller få resultaten genom att trycka på resultat.
- Räkna flera ägg massor inom en räknings händelse genom att lägga räknartyper, om det behövs.
Representative Results
Figur 1 visar andelen djur som lägger ägg efter intravaginal injektion av antingen kontrollsubstansen (saltlösning), Ovipostatin eller Ovipostatin tillsammans med spermier. N = 15 för varje behandling; se Koene m.fl. 16 för information och statistik (Källa: Figur 3 från Koene et al 2010, PLoS ONE.)..
Figur 1. Effekt av Ovipostatin på ägg massproduktion av Lymnaea stagn. Diagrammet visar andelen djur som lägger ägg efter intravaginal injektion av antingen kontrollsubstansen (saltlösning), Ovipostatin eller Ovipostatin tillsammans med spermier. N = 15 för varje behandling; se Koene et al. 2010 detaljer och statistik. Reprint med tillstånd från Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Den presenterade protokoll visar hur man samlar sädesvätska och hur man testar detta i ett biologiskt meningsfullt sätt. Även om detta förfarande här visas med användning av prostatakörtelextrakt, kan effekten av en enda renad sädesvätska protein också testas genom att följa samma procedur. Självklart, det är i sådana tester alltid viktigt att ta med ordentliga kontroller (sken behandlingar) för att se till att förfarandet och / eller datamediet inte påverkar parametrarna i frågorna 14,16. Med hjälp av denna metod, har det redan visat sig att det finns en enda sädesvätska protein, nämligen Ovipostatin, som förmedlar en minskad äggläggning 14,16. Detta protein, som produceras i prostatakörteln och överförs under parning tillsammans med spermier, representerar den första helt karakteriserade sädesvätska komponent i en samtidig hermafrodit och gör, så långt, inte visar någon likhet med kända proteiner.
Upptäckten att Ovipostatenn minskar ägg massproduktion i mottagaren bekräftar tidigare arbete som visar att ämnen i sädesvätskan kan påverka äggläggning 13-15. Genom att överföra biologiskt relevanta beloppen (se 3.2 16), kan man på ett övertygande sätt visa att det är en sädesvätska protein, och inte förekomsten av spermier själva, som förmedlar den observerade minskningen av äggläggningen (Figur 1). Med tanke på att upprepad mottagandet av sädesvätska via naturliga parningar ökar investeringen per ägg 15, nu blir det högst relevant att kvantifiera andra parametrar för äggläggning. Den presenterade protokollet ger nu de nödvändiga metoder för att göra detta. Även om ingen effekt hittades i Ovipostatin på kläckning framgång för de ägg som av mottagaren 16, kan det finnas andra sädesvätska proteiner som samverkar om med detta protein. Därför parametrar som behöver kvantifieras i detta sammanhang - bredvid om frekvens och ägg nummer - inkluderar ägg storlek, hatching tid, nykläckt utveckling och hatchling storlek. Dessutom är det möjligt att titta på effekterna på andra kvinnliga processer än äggläggning, såsom sperma lagring och användning, samt fördelning av reproduktiva resurser mot den kvinnliga och manliga funktion 14,17. Det är uppenbart att den presenterade metoden avgörande itu med dessa uppföljande frågor, både i Lymnaea stagn och i andra sötvattensniglar.
Sammanfattningsvis experiment med detta protokoll visar att överförda sädesvätska proteiner påverkar den kvinnliga reproduktionsförmågan hos mottagaren i dessa samtidiga hermafroditer. Med tanke på att få studier har tagit upp detta, är det sannolikt att bli mycket vanligare i internt gödsling hermafroditer än idag återspeglas i den vetenskapliga litteraturen. Speciellt när man inser att pre-copulatory partnerval och konkurrens spermier har visat sig spela en viktig roll i dessa hermafroditer 14, vilket highlights potentialen i dessa manliga tillbehör körtel proteiner som sexuellt väljas i detta system. Slutligen bidrar denna forskning till stöd för utveckling av uppfattningen att sädesvätska proteiner är lika viktiga för samtidiga hermafroditer som de är för separata-könsbestämmas arter.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar MR Helmus för voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg och C. Levesque för tekniskt stöd. Denna forskning stöds ekonomiskt av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) och Japan Student Services Organization (Jasso). Denna publikation har stöd av en Open Access-bidrag på NWO till JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen. , Springer-Verlag. (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. Sexual Conflict. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , Elsevier. (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
