Massively Parallel Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

Introduction

Massively Parallel Reporter Analyser (MPRA) tillade multiplex måling af transkriptionsregulerende aktiviteter tusinder til hundredtusinder af DNA-sekvenser ^{1- 7.} I deres mest almindelige gennemførelsen, er multipleksing opnås ved at koble hver sekvens af interesse for en syntetisk reportergen, som indeholder en identificerende sekvensmærke nedstrøms for en åben læseramme (ORF, figur 1). Efter transfektion, RNA-isolering og dyb sekventering af 3 'enderne af reportergenassays transkripter kan de relative aktiviteter af de koblede sekvenser udledes af den relative overflod af deres identificerende mærker.

Figur 1. Oversigt over MPRA. Et bibliotek af MPRA reporterkonstruktioner er konstrueret ved at koble formodede regulatoriske sekvenser til syntetiskreportergener, der består af en "indifferent" ORF (såsom GFP eller luciferase) efterfulgt af en identifikationskode sekvensmærke. Biblioteket transficeres massevis ind i en population af dyrkede celler og transkriberet reporter mRNA efterfølgende tilbagebetalt. Dyb sekventering anvendes til at tælle antallet af forekomster af hvert mærke blandt reporter mRNA'er og de transficerede plasmider. Forholdet af mRNA tæller i plasmid tæller kan anvendes til at udlede aktiviteten af ​​den tilsvarende regulatorisk sekvens. Tilpasset med tilladelse fra Melnikov, et al ^2.

MPRA kan tilpasses til en bred vifte af eksperimentelle design, herunder 1) omfattende mutagenese af enkelte gen-regulatoriske elementer, 2) scanning efter hidtil ukendte regulatoriske elementer på tværs af et locus af interesse, 3) at teste effekten af ​​naturlig genetisk variation i et sæt af formodet promotorer, forstærkere eller lyddæmpere, og 4) semi-rationel teknik af syntetiske regulatoriske elementer. Libraries af sekvensvarianter kan genereres ved hjælp af en række fremgangsmåder, herunder oligonukleotid-bibliotek syntese (OLS) på programmerbare microarrays ^2,3,6,7, samling af degenererede oligonukleotider ^1,4, kombinatorisk ligering ⁸ og fragmentering af genomisk DNA ^5.

Denne protokol beskriver konstruktion af et bibliotek af promotor varianter hjælp OLS og pMPRA1 og pMPRAdonor1 vektorer (Addgene id'er 49.349 og 49.352, henholdsvis; http://www.addgene.org), transient transfektion af dette bibliotek i dyrkede pattedyrceller og efterfølgende kvantificering af promotoren aktiviteter ved dyb sekventering af deres tilknyttede tags (Tag-Seq). Tidligere versioner af denne protokol blev anvendt i den forskning, rapporteret i Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) og i Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1. Sekvens Design og syntese

1. Begynd MPRA med design og syntese af sekvenser, der skal analyseres for regulerende aktivitet. For kompatibilitet med pMPRA vektor-serien, designe hver sekvens ved hjælp af følgende skabelon: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', hvor Var angiver sekvensen, der skal analyseres, og tag betegner en eller flere identifikation tags.
2. De to variable regioner (Var og tag) er adskilt af et par KpnI (GGTACC) og Xbal (TCTAGA) restriktionssteder for at lette retningsbestemt ligering af et reportergen-fragment mellem dem. Desuden vil to forskellige Sfil (GGCCNNNNNGGCC) pladser tilføjes ved PCR for at tillade retningsbestemt ligering i pMPRA rygraden. De variable regioner må ikke indeholde yderligere kopier af nogen af ​​disse restriktionssteder. Hvis det er nødvendigt, en eller flere af disse restriktionsenzymer kan erstattes, Så længe udskiftninger 1) tillade effektiv skæring tæt på enderne af DNA-molekyler, og 2) ikke skære andetsteds i vektoren sekvens. Se Diskussion for yderligere oplysninger.
3. Opnå de nødvendige primere, der er anført i tabel 1 fra en kommerciel leverandør.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [indeks] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabel 1. Primersekvenser. [Indeks] betegner en 6 til 8 nt indeks sekvens anvendes til multiplex sekventering. Opnå mindst 8 TagSeq-P2-primere med forskellige indekser. Alleaf primerne skal renses ved HPLC eller PAGE.

4. Oligonucleotid biblioteker kan opnås fra en kommerciel leverandør eller kerne facilitet, eller genereres ved hjælp af en programmerbar mikroarray-baserede oligonukleotidsynteseapparat som beskrevet af fabrikanten. Opslem OLS produkter i 100 ul TE 0,1 buffer.
5. Kør oligonucleotid biblioteker på en 10% TBE-urea denaturerende polyacrylamidgel. Load cirka 1 pmol per bane og pletten med ssDNA-sensitive fluorescerende pletten for at vurdere deres kvalitet (figur 2A).
6. Hvis en diskret bånd svarende til oligonukleotider i fuld længde kan visualiseres (figur 2A, bane 1 og 2), udskære tilsvarende acrylamidgel skive og eluere oligonucleotider i 100 pi TE 0,1 natten over ved stuetemperatur med omrystning. Ellers fortsæt med anvendelse af ufortyndet OLS suspension.
7. Forstærk og tilføje Sfil haler til oligonukleotidet biblioteket ved hjælp af emulsion PCR ⁹ sup>.
8. Opsætning 50 pi PCR-reaktionsblandinger, som beskrevet i tabel 2. Derefter kombineres med 300 ul olie og overfladeaktivt blandingen fra Micellula DNA Emulsion og oprensningskit og vortex i 5 minutter ved 4 ° C.

Reagens	1x Volumen (pl)
Herculase II Fusion DNA-polymerase	0,5
5x Herculase II Reaktionsbuffer	10
dNTP (10 mM hver)	1.25
BSA (20 mg / ml)	1.25
Primer MPRA_SfiI_F (25 uM)	0.25
Primer MPRA_SfiI_R (25 uM)	0.25
OLS skabelon (1-10 attomol)	varierer
Nuclease-frit vand	50

ve_content "> tabel 2. Emulsion PCR-reaktionsblanding (vandfasen).

9. Brug den koncentration, der giver den maksimale udbytte af amplifikationsprodukter uden forekomsten af ​​artefakter (se afsnit 1.12).
10. Doser resulterende emulsion i PCR-rør og udføre 20 PCR-cykler (2 min ved 95 ° C, 20 x [20 sek ved 95 ° C, 20 sek ved 55 ° C, 30 sekunder ved 72 ° C], 3 minutter ved 95 ° C).
11. Pool og bryde hver 350 pi emulsion PCR-reaktion ved tilsætning af 1 ml isobutanol og kort omhvirvling, og derefter oprense amplifikationsprodukt under anvendelse af en DNA-oprensningssøjle.
12. Køre en alikvot på en 2% eller 4% agarosegel for at verificere artefaktfri amplifikation (figur 2B).

Figur 2. Fremstilling af oligonukleotid syntese biblioteker. A) B) Produkter af åbne og emulsion PCR-amplifikation af samme oligonukleotid bibliotek køre på en agarosegel. PCR-amplifikation af komplekse oligonucleotid- biblioteker ofte skaber kimære og andre artefakter, der kan fremstå som højere og lavere bånd. Emulsion PCR kan minimere disse artefakter.

2. Bibliotek Byggeri

1. Forbered en lineariseret plasmid rygrad ved at fordøje vektor pMPRA1 med SfiI ved 50 ° C i 2 timer, kørt på en 1% agarose gel, udskære rygraden båndet (i dette tilfælde 2,5 kb), og rense det ved hjælp af en gel-oprensning spinkolonne.
2. Digestemulsionen PCR-produkter fra trin 1.4 med Sfil ved 50 ° C i 2 timer og rense under anvendelse af DNA oprensningssøjler.
3. At ligere promotor-tag bibliotek i den lineariserede vektor rygrad, nedsat reaktioner indeholdende 100 ng af den fordøjede PCR-produkt, 50 ng lineariseret vektor rygraden og T4 DNA-ligase. Inkuber natten over ved 16 ° C og opvarmes derpå ved 65 ° C i 20 minutter for at inaktivere ligasen.
4. Transformere E. coli med ligeringsreaktionen. For at bevare biblioteket kompleksitet, har til formål at opnå mindst 10x mere cfu end der er særskilte promotor-tag kombinationer i designet biblioteket.
5. Når antallet af mærkater er cirka 100.000, kan mål cfu typisk opnås ved at udføre 6-8 parallelle transformationer pr biblioteket.
6. For hver transformation kombinere 50 pi elektrokompetente E. coli-celler med 2 ul ligeringsblanding på is. Transform ved elektroporation, inddrive de celler i 800 ul SOCmedium ved omrystning ved 37 ° C i 1 time, og derefter kombinere celler fra parallelle transformationer.
7. At evaluere transformationseffektiviteten, plade seriefortyndinger fra en alinquot af genvundne celler på LB-agarplader med 50-100 ug / ml carbenicillin og inkuberes natten over ved 37 ° C. Estimere samlede cfu som (observeret cfu) × (fortyndingsfaktor) × (V - v) / v, hvor V er det totale volumen af genvundne celler og V er rumfanget af den alikvote udtaget til seriefortyndingerne.
8. Samtidig, skal du bruge resten af ​​den genfundne celler til podning af 200 ml LB suppleret med 100 ug / ml carbenicillin. Dyrk cellerne ved 37 ° C natten over i en rysteinkubator og derefter isolere plasmid-DNA efter standardprocedurer.
9. Fordøj en alikvot af isolerede plasmid bibliotek med Sfil ved 50 ° C i 2 timer og kørt på en 1% agarosegel for at bekræfte tilstedeværelsen af skær.
10. Linearisere plasmidet bibliotek af cUtting mellem promotoren varianter og mærker via Kpnl og Xbal. For at maksimere fordøjelsen effektivitet, udføre serielle spaltninger:
11. Først fordøje med KpnI ved 37 ° C i 1 time og renses ved hjælp af magnetiske perler. For det andet, fordøje med XbaI med tilsætning af 1 U Shrimp Alkaline Phosphatase ved 37 ° C i 2 timer, varme inaktivering ved 65 ° C i 5 minutter, og derefter oprense ved hjælp af magnetiske perler.
12. Køre en alikvot på en 1% agarosegel for at kontrollere fuldstændig linearisering. Hvis uskåret plasmid er synlige, bør det lineariserede fragment geloprenset.
13. For at generere et MPRA bibliotek egnet til transfektion ind i pattedyrceller ligere en ORF med KpnI / XbaI -kompatible ender i den lineariserede mellemliggende biblioteket.
14. For at fremstille en kompatibel luc2 ORF fragment fra pMPRAdonor1, fordøje dette plasmid med Kpnl og Xbal ved 37 ° C i 1 time og kørt på en 1% agarosegel. Udskære ORF fragment (1,7 kB i dette tilfælde) og renses ved hjælp af en gel-oprensning spinkolonne.
15. Klon ORF fragment i lineariseret mellemliggende bibliotek som beskrevet i trin fra 2,3 til 2,8.
16. Fordøj en portion (svarende til 1-2 ug) af MPRA bibliotek med Kpnl ved 37 ° C i 1 time og kørt på en 1% agarosegel. Hvis fordøjet biblioteket kører som et enkelt bånd, til afsnit 3. Hvis yderligere bånd observeres (typisk svarende til fremførsel af mellemliggende konstruktioner), kan biblioteket renses yderligere som følger:
17. Skær 3-5 ug af det forurenede bibliotek med KpnI ved 37 ° C i 1 time og kørt på en 0,8% agarosegel natten over ved 4 ° C.
18. Udskære korrekte bibliotek båndet oprense DNA ved anvendelse af en gel rensning spinkolonne og udfør selvligering ved hjælp af høj koncentration T4 DNA-ligase ved 37 ° C i 1 time. Derefter gentage transformationen og endelig bibliotek DNA-isolering som beskrevet i trin 2.8.

3. Transfection, Perturbation, og RNA isolering

1. For hver selvstændig transfektion, kultur det nødvendige antal celler (som bestemt ved MPRA bibliotek kompleksitet, se diskussionen) i passende medium. For eksempel kultur HEK293T / 17 celler i DMEM suppleret med 10% FBS og L-glutamin / penicillin / streptomycin. Kultur celler til mindst to uafhængige transfektioner for hvert bibliotek og eksperimentel tilstand.
2. Transficere de dyrkede celler med MPRA plasmider. Transfektionsblandingen fremgangsmåde og betingelser skal optimeres for hver celletype. For hver transficeret prøve, bevarer en alikvot (50-100 ng) af plasmid-DNA som en matchet kontrol.
3. For eksempel transficere 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 celler dyrket til ~ 50% konfluens i en 10 cm dyrkningsskål med 10 ug plasmid-DNA i 1 ml Opti-MEM I Reduced Serum Medium anvendelse af 30 pi lipofectamin LTX og 10 pi Plus reagens. Fjern transfektion blandingen efter 5 timer og tilladeceller til at komme i 24-48 timer.
4. Eventuelt udføre enhver forstyrrelse kræves for at aktivere kontekstafhængige eller signal-afhængig regulatoriske sekvenser i designet biblioteket.
5. Cellerne høstes og isolere poly (A) + mRNA under anvendelse af standard oligo (dT) cellulose søjler eller perler ved hjælp af deres producentens anvisninger.
6. Sørg for, at den maksimale bindingskapacitet af søjlerne eller perler overstige det samlede beløb af mRNA forventet fra høstede celler. For eksempel det forventede afkast fra afsnit 3.3 er cirka 0,5-2,5 ug mRNA.

4. Tag-Seq

1. For at eliminere overførsel af vektor-DNA fra transficerede cellelysater behandle hver 20 pi mRNA prøve med 1 pi Turbo DNase (2 U) og 2,3 pi 10x Turbo DNase-buffer ved 37 ° C i 1 time, tilsættes 2,4 pi Turbo DNase Inaktivering reagenset ved RT i 5 min med blanding, centrifugeres ved 10.000 g i 90 sekunder, og derefter overføre opløsningen til et nyt rør.
2. Bekræft renhed ved at udføre PCR som beskrevet i afsnit 4.6 om 60-100 ng af hver mRNA prøve, og derefter køre produkterne på en agarosegel. Hvis specifikke amplikoner er synlige (0,25 kb, hvis du bruger pMPRA1 med luc2), kolonne rense det behandlede mRNA og derefter gentage DNase behandling.
3. For at generere Tag-Seq sekventering biblioteker, konvertere reporter mRNA til cDNA og tilføje sekventering adaptere ved PCR.
4. Opsæt mRNA / RT primer blandinger som beskrevet i tabel 3. Inkuberes ved 65 ° C i 5 min, og derefter placere på is. Sideløbende nedsat cDNA syntesereaktioner som beskrevet i tabel 4.

Reagens	1x Volumen (pl)
mRNA prøve (400-700 ng i alt)	8
Oligo-0DT (50 uM)	1
dNTP (10 mM hver)	1

ove_content "> tabel 3. RNA / Reverse transskriptionsprimer mix til cDNA-syntese.

Reagens	1x Volumen (pl)
10x SuperScript III RT Buffer	2
MgCl2 (25 mM)	4
DTT (0,1 M)	2
RNaseOut (40 U / ul)	1
SuperScript III (200 U / pl)	1

Tabel 4. cDNA-syntese reaktionsblanding.

5. Forsigtigt kombinere mRNA / RT-primeren blandes med cDNA-syntese blandinger. Inkuber ved 50 ° C i 50 minutter, 85 ° C i 5 minutter og derefter placere på is. Endelig inkuberes med 2 U af ribonuklease H ved 37 ° C i 20 min.
6. Opsæt PCR-reaktioner som beskrevet i tabel 5 med 4-6 ulcDNA-reaktionsblandingen eller 50 ng reporterplasmid som skabeloner. Derefter udføre PCR-amplifikation (95 ° C i 2 minutter, 26 x [95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek] 72 ° C i 3 minutter).

Reagens	1x Volumen (pl)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix	25
Primer TagSeq_P1 (25 uM)	0,5
Primer TagSeq_P2 (25 uM)	0,5
Skabelon (mRNA, cDNA blanding eller plasmid-DNA)	varierer
Nuclease-frit vand	50

Tabel 5. Tag-Seq PCR-reaktionsblanding.

7. Kør PCR-produkterne gennem en 2% agarosegel, punktafgifter bands, der svarer til Tag-Seq bibliotek amplikoner (0,25 kb, hvis du brugerpMPRA1 med luc2) og rense disse ved hjælp af geloprensning spin-søjler.
8. Pool, denaturere og sekventere de rensede Tag-Seq amplikoner direkte med en Illumina sekventering instrument.
9. Filter lav kvalitet læser ved at fjerne alt det, a) indeholde en eller flere stilling med en Phred kvalitet score mindre end 30 inden for den sekventeret tag eller b) ikke svarer nøjagtigt til en konstrueret tag. Tæl antallet af gange hver resterende mærke vises i hvert bibliotek. Normalize mærkeantallene TPM (tags per million sekventeret tags), og derefter beregne forholdet af mRNA-afledte mærkeantallene i plasmid afledt mærkeantallene for hvert par af sekventering biblioteker. Hvis flere forskellige mærker var knyttet til hver sekvens variant bruge deres median forhold til downstream-analyse.

Representative Results

MPRA letter i høj opløsning, kvantitativ dissektion af sekvens-aktivitetsforhold af transkriptionelle regulatoriske elementer. En vellykket MPRA eksperiment vil typisk give meget reproducerbare målinger for størstedelen af sekvenser i den transficerede bibliotek (figur 3A). Hvis dårlig reproducerbarhed observeret (figur 3B), er dette tegn på en for lav koncentration af reporter mRNA'er i de udvundne RNA-prøver, enten som følge af 1) lavt absolut aktivitet blandt de analyserede sekvenser, eller 2) lav transfektionseffektivitet.

Figur 4 viser et repræsentativt "information fodspor" ^1,2 genereres ved at analysere ~ 37.000 tilfældige varianter af et 145 bp opstrøms for det humane IFNB genet i HEK293-celler med eller uden eksponering for Sendai-virus. Promotor TATA-box og kendt proksimale forstærker ¹⁰ kan tydeligt identificeres som information-rige regions i et virus-afhængig måde.

Figur 3. Tag-Seq reproducerbarhed. Scatter plot viser eksempler på Tag-Seq data fra to uafhængige replikat transfektioner med høj (A) og lav (B) reproducerbarhed. Sidstnævnte plot viser mange outlier tags med høj mRNA tællinger i én af de to gentagelser. Sådanne artefakter indikerer typisk, at koncentrationerne af reporter mRNA'er var for lav til kvantitativ PCR-amplifikation enten på grund af lave absolutte aktiviteter blandt reporter konstruktioner eller lave transfektionseffektiviteter.

Figur 4. Information fodaftryk af den menneskelige IFNB transkriptionsstartstedet og proximale forstærker. IFNB genet, blev analyseret under anvendelse af MPRA i HEK293-celler med (A) og uden (B) udsættelse for Sendai-virus. De blå søjler viser den gensidige information mellem reporteren output og nucleotidet i hver position. Den proximale forstærker og TATA-box skiller sig ud som regioner med høj informationsindhold på virusinfektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers