Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

Introduction

Saggi Reporter Massively Parallel (MPRA) consentono la misurazione multiplex delle attività di regolamentazione trascrizionali di migliaia a centinaia di migliaia di sequenze di DNA ^{1- 7.} Nella sua implementazione più comune, multiplazione è ottenuta accoppiando ogni sequenza di interesse ad un gene reporter sintetico che contiene un tag di sequenza che identifica a valle di un open reading frame (ORF; la figura 1). A seguito di trasfezione, l'isolamento di RNA e profondo sequenziamento dei fini del 3 'dei trascritti del gene reporter, le relative attività delle sequenze accoppiati possono essere dedotte dalla relativa abbondanza di loro tag di identificazione.

Figura 1 Panoramica di MPRA. Una libreria di MPRA giornalista costruisce è costruito accoppiando putative sequenze di regolamentazione sinteticogeni reporter che consistono di un "inerte" ORF (come GFP o luciferasi) seguito da una sequenza di tag di identificazione. La biblioteca è transfettato in massa in una popolazione di cellule in coltura e trascritto mRNA giornalista viene successivamente recuperata. Sequenziamento profondo viene utilizzato per contare il numero di occorrenze di ogni tag tra i mRNA giornalista e plasmidi trasfettate. Il rapporto tra mRNA risiedono su conti plasmid possono essere usate per dedurre l'attività della corrispondente sequenza regolatrice. Adattato con il permesso di Melnikov, et al ^2.

MPRA può essere adattato a una vasta gamma di disegni sperimentali, di cui 1) la mutagenesi completa dei geni dell'individuo elementi regolatori, 2) la scansione di elementi regolatori nuovi attraverso un luogo di interesse, 3) testare l'effetto della variazione genetica naturale in un insieme di putative promotori, enhancer o silenziatori, e 4) ingegneria semi-razionale di elementi regolatori sintetici. Libraries di varianti di sequenza possono essere generati utilizzando una varietà di metodi, tra cui la sintesi biblioteca oligonucleotidi (OLS) su microarray programmabili ^2,3,6,7, assemblaggio di oligonucleotidi degenerati ^1,4, legatura combinatoria ⁸ e frammentazione del DNA genomico ^5.

Questo protocollo descrive la costruzione di una libreria di promotore varianti con OLS e vettori pMPRA1 e pMPRAdonor1 (Addgene ID 49349 e 49352, rispettivamente; http://www.addgene.org), trasfezione transiente di questa biblioteca in cellule di mammifero in coltura e la successiva quantificazione delle attività di promotore di sequenziamento profondo dei relativi tag (Tag-Seq). Le versioni precedenti di questo protocollo sono stati utilizzati nella ricerca riportata nel Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) e in Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1 Progettazione Sequenza e Sintesi

1. Inizia MPRA con la progettazione e la sintesi di sequenze da dosare per attività di regolamentazione. Per la compatibilità con la serie vettore pMPRA, progettare ogni sequenza utilizzando la seguente configurazione: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', dove var indica la sequenza da dosare e tag denota uno o più tag di identificazione.
2. Le due regioni variabili (var e tag) sono separate da una coppia di KpnI (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) siti di restrizione per facilitare la legatura direzionale di un frammento di gene reporter tra loro. Inoltre, due SFII (GGCCNNNNNGGCC) siti distinti saranno aggiunti mediante PCR per permettere la legatura direzionale nella spina dorsale pMPRA. Le regioni variabili non devono contenere ulteriori copie di qualsiasi di questi siti di restrizione. Se necessario, uno o più di questi enzimi di restrizione possono essere sostituiti, Fino a quando le sostituzioni 1) consentire il taglio efficiente vicino alle estremità di molecole di DNA, e 2) non tagliare altrove nella sequenza vettoriale. Vedi di discussione per ulteriori dettagli.
3. Ottenere i primer richiesti elencati nella tabella 1 da un fornitore commerciale.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabella 1. sequenze di primer. [Indice] denota una sequenza indice 6-8 nt utilizzato per il sequenziamento multiplex. Ottenere almeno 8 primer TagSeq-P2 con indici differenti. Tuttodei primer deve essere purificata mediante HPLC o PAGE.

4. Librerie oligonucleotide possono essere ottenuti da un fornitore o nucleo struttura commerciale, o generati utilizzando un programmabile basato microarray-oligonucleotide sintetizzatore come descritto dal produttore. Risospendere i prodotti OLS in 100 microlitri di buffer TE 0.1.
5. Eseguire le librerie oligonucleotidiche su un TBE-Urea 10% denaturazione gel di poliacrilamide. Caricare circa 1 pmol per corsia e macchia con macchia fluorescente ssDNA-sensibile per valutare la qualità (Figura 2A).
6. Se una band discreta corrispondente alle oligonucleotidi full-length può essere visualizzato (Figura 2A, corsie 1 e 2), asportare il corrispondente fetta gel di acrilammide ed eluire oligonucleotidi in 100 microlitri TE 0.1 notte a temperatura ambiente con agitazione. In caso contrario, procedere con l'OLS sospensione crudo.
7. Amplifica e aggiungere le code SFII alla libreria oligonucleotide con emulsione PCR ⁹ sup>.
8. Impostare 50 microlitri di miscele di reazione PCR come descritto nella Tabella 2. Poi si combinano con 300 ml di olio e miscela di tensioattivo dal DNA emulsione Micellula e kit di purificazione e vortex per 5 minuti a 4 ° C.

Reagente	1x Volume (ml)
Herculase II Fusion DNA polimerasi	0.5
Tampone di reazione 5x Herculase II	10
dNTP (10 mm ciascuno)	1.25
BSA (20 mg / ml)	1.25
MPRA_SfiI_F Primer (25 micron)	0.25
MPRA_SfiI_R Primer (25 micron)	0.25
Modello OLS (1-10 attomol)	varia
Acqua priva di nucleasi	50

ve_content "> Tabella 2 Emulsion PCR mix di reazione (fase acquosa).

9. Utilizzare la concentrazione che dà la resa massima di prodotti di amplificazione senza la comparsa di artefatti (vedi sezione 1.12).
10. Versare l'emulsione risultante in provette per PCR ed eseguire 20 cicli di PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 sec a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C], 3 min a 95 ° C).
11. Piscina e rompere ogni 350 ml di emulsione reazione di PCR con l'aggiunta di 1 ml di isobutanolo e brevemente vortex, e poi purificare il prodotto di amplificazione utilizzando una colonna di purificazione del DNA.
12. Eseguire una aliquota su un gel di agarosio al 2% o 4% per verificare privo di artefatti di amplificazione (Figura 2B).

Figura 2 Preparazione di librerie di sintesi di oligonucleotidi. A) B amplificazione PCR.) Prodotti di aperto ed emulsione amplificazione PCR della stessa seduta biblioteca oligonucleotidi su un gel di agarosio. Amplificazione PCR di librerie di oligonucleotidi complessi crea frequentemente prodotti chimerici e altri artefatti che possono apparire come bande superiori e inferiori. Emulsione PCR può minimizzare questi manufatti.

2. Costruzione Biblioteca

1. Preparare una spina dorsale plasmide linearizzato da digerire vettore pMPRA1 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore, eseguito su un gel di agarosio 1%, asportare la fascia dorsale (in questo caso, 2,5 kb) e purificarlo utilizzando una colonna di spin di gel-purificazione.
2. Digerirei prodotti di PCR emulsione dal punto 1.4 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore e purificano utilizzando le colonne di purificazione del DNA.
3. Per legare la libreria promotore tag nella spina dorsale vettore linearizzato, istituito reazioni contenenti 100 ng del prodotto della PCR digerito, 50 ng del vettore backbone linearizzato e DNA ligasi T4. Incubare per una notte a 16 ° C e poi il calore a 65 ° C per 20 minuti per inattivare la ligasi.
4. Trasforma E. coli con la reazione legatura. Per preservare la complessità biblioteca, mirano a ottenere almeno 10x più cfu che ci sono distinte combinazioni promotore-tag nella libreria progettata.
5. Quando il numero totale di tag è di circa 100.000, il cfu bersaglio può tipicamente essere ottenuto eseguendo 6-8 trasformazioni parallele per libreria.
6. Per ogni trasformazione, unire 50 ml electrocompetent E. coli con 2 ml di mix legatura su ghiaccio. Trasformazione mediante elettroporazione, recuperare le cellule in 800 microlitri SOCsupporto con agitazione a 37 ° C per 1 ora, e poi unire celle dalle trasformazioni parallele.
7. Per valutare l'efficienza di trasformazione, piastra diluizioni seriali da un alinquot di cellule recuperate su piastre di agar LB con 50-100 mg / ml carbenicillina e incubare una notte a 37 ° C. Stimare cfu totale come (cfu osservato) × (fattore di diluizione) × (V - v) / v, dove V è il volume totale delle cellule recuperati e v è il volume dell'aliquota prelevata per le diluizioni seriali.
8. Al tempo stesso, utilizzare il resto delle cellule recuperate per inoculare 200 ml di LB integrato con 100 mg / ml carbenicillina. Crescere le cellule a 37 ° C per una notte in un incubatore shaker e poi isolare il DNA plasmidico secondo procedure standard.
9. Digest un'aliquota della biblioteca isolata plasmide con SFII a 50 ° C per 2 ore e correre su un gel di agarosio 1% per confermare la presenza di inserti.
10. Linearizzare la libreria plasmide da cUtting tra le varianti del promotore e tag utilizzando KpnI e XbaI. Per massimizzare l'efficienza di digestione, eseguire digestioni di serie:
11. In primo luogo, digerire con KpnI a 37 ° C per 1 ora e purificare mediante biglie magnetiche. In secondo luogo, digerire con XbaI con l'aggiunta di 1 U Gambero fosfatasi alcalina a 37 ° C per 2 ore, il calore inattivare a 65 ° C per 5 minuti, e poi purificare con biglie magnetiche.
12. Eseguire una aliquota su un gel di agarosio 1% per verificare completa linearizzazione. Se plasmide uncut è visibile, il frammento linearizzato va gel purificato.
13. Per generare una libreria MPRA adatto per trasfezione in cellule di mammifero, legare un ORF con KpnI / XbaI estremità compatibili nella biblioteca intermedio linearizzato.
14. Per preparare un luc2 ORF frammento compatibile da pMPRAdonor1, digerire il plasmide con KpnI e XbaI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 1%. Accise il frammento ORF (1,7 kb in questo caso) e la purificazione mediante colonna di gel di depurazione centrifuga.
15. Clonare il frammento ORF nella libreria intermedio linearizzato come descritto nei passaggi 2,3-2,8.
16. Digest un'aliquota (corrispondente a 1-2 mg) della biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio all'1%. Se la libreria digerito viene eseguito come una singola banda, passare alla sezione 3 Se si osservano bande addizionali (tipicamente corrispondente al riporto di costrutti intermedi), la libreria può essere ulteriormente purificato come segue:
17. Digest 3-5 mg di biblioteca contaminato con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 0,8% per una notte a 4 ° C.
18. Accise banda libreria corretta, purificare il DNA usando una colonna di spin purificazione gel ed eseguire auto-ligazione con alta concentrazione di T4 DNA ligasi a 37 ° C per 1 ora. Quindi ripetere la trasformazione e la biblioteca ultima estrazione del DNA come descritto al punto 2.8.

3 Transfection, Perturbazione, e RNA Isolation

1. Per ogni trasfezione indipendente, la cultura il numero di cellule (come determinato dalla complessità biblioteca MPRA, vedi Discussione) in mezzo appropriato. Ad esempio, la cultura HEK293T / 17 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina / penicillina / streptomicina. Cellule di coltura per almeno due transfezioni indipendenti per ogni libreria e condizione sperimentale.
2. Trasfezione le cellule in coltura con plasmidi MPRA. Il metodo e le condizioni di trasfezione devono essere ottimizzati per ogni tipo cellulare. Per ogni campione transfettate, mantenere una aliquota (50-100 ng) di DNA plasmide come controllo abbinato.
3. Ad esempio, transfettare 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 cellule cresciute al ~ 50% di confluenza in un piatto di cultura 10 centimetri con 10 mg DNA plasmidico in 1 ml di Opti-MEM ho ridotto siero Media utilizzando 30 microlitri Lipofectamine LTX e 10 ml più reagente. Rimuovere la miscela di trasfezione dopo 5 ore e permettere l'cellule di recuperare per 24-48 ore.
4. Facoltativamente, eseguire qualsiasi perturbazione necessaria ad attivare sequenze regolatrici contestuali o segnale-dipendente nella libreria progettata.
5. Raccogliere le cellule e isolare poli (A) + mRNA utilizzando colonne di cellulosa oligo (dT) standard o perline usando le istruzioni del loro produttore.
6. Assicurarsi che la capacità massima di legame delle colonne o perline superare l'importo totale di mRNA previsto dalle cellule raccolte. Ad esempio, il rendimento atteso dalla sezione 3.3 è di circa 0,5-2,5 mg mRNA.

4. Tag-Seq

1. Per eliminare i residui di vettore DNA dai lisati cellulari trasfettate, trattare ogni campione di mRNA 20 microlitri con 1 ml Turbo DNasi (2 U) e 2,3 microlitri di buffer 10x Turbo DNasi a 37 ° C per 1 ora, aggiungere 2,4 microlitri DNasi Turbo Inattivazione reagente a RT per 5 min con miscelazione, centrifugare a 10.000 g per 90 secondi, e poi trasferire la soluzione in una nuova provetta.
2. Verificare purezza eseguendo PCR come descritto nel capitolo 4.6 da 60-100 ng di ciascun campione di mRNA, e quindi eseguendo i prodotti su un gel di agarosio. Se ampliconi specifici sono visibili (0,25 kb se si utilizza pMPRA1 con luc2), colonna purificare l'mRNA trattata e poi ripetere il trattamento DNasi.
3. Per generare librerie di sequenziamento Tag-Seq, convertire giornalista mRNA in cDNA e aggiungere schede di sequenziamento mediante PCR.
4. Impostare miscele di primer mRNA / RT come descritto nella Tabella 3. Incubare a 65 ° C per 5 minuti, poi disporli sul ghiaccio. In parallelo, impostare reazioni di sintesi di cDNA, come descritto nella Tabella 4.

Reagente	1x Volume (ml)
campione di mRNA (400-700 ng totale)	8
Oligo-0DT (50 micron)	1
dNTP (10 mm ciascuno)	1

ove_content "> Tabella 3 RNA / trascrizione inversa miscela di primer per la sintesi del DNA.

Reagente	1x Volume (ml)
10x SuperScript III RT Buffer	2
MgCl 2 (25 mm)	4
DTT (0.1 M)	2
RNaseOut (40 U / ml)	1
SuperScript III (200 U / ml)	1

Tabella 4 cDNA mix di reazione di sintesi.

5. Unire delicatamente mRNA / RT Primer mescola con miscele di sintesi cDNA. Incubare a 50 ° C per 50 min, 85 ° C per 5 minuti e poi posto su ghiaccio. Infine, incubare con 2 U di ribonucleasi H a 37 ° C per 20 min.
6. Impostare reazioni PCR, come descritto nella Tabella 5 con 4-6 microlitricDNA miscela di reazione o 50 ng plasmide giornalista come modelli. Quindi eseguire amplificazione PCR (95 ° C per 2 min, 26 x [95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec], 72 ° C per 3 min).

Reagente	1x Volume (ml)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix	25
TagSeq_P1 Primer (25 micron)	0.5
TagSeq_P2 Primer (25 micron)	0.5
Template (mRNA, cDNA mix o plasmide DNA)	varia
Acqua priva di nucleasi	50

Tabella 5 Tag-Seq Miscela di reazione PCR.

7. Eseguire i prodotti di PCR attraverso un gel di agarosio al 2%, bande di accisa corrispondenti alle ampliconi libreria di tag-Seq (0,25 kb se si utilizzapMPRA1 con luc2) e purificare queste utilizzano colonne di spin purificazione gel.
8. Piscina, denaturare e sequenziare i ampliconi Tag-Seq purificate direttamente con uno strumento di sequenziamento Illumina.
9. Filtro di bassa qualità si legge eliminando tutto ciò che a) contenere uno o più posizione con una qualità Phred punteggio inferiore a 30 all'interno del tag in sequenza o b) non corrisponde esattamente un tag progettato. Contare il numero di volte che ogni tag rimanente appare in ogni libreria. Normalizzare i conteggi tag di TPM (tag per milione tag sequenziati) e quindi calcolare il rapporto tra i conteggi tag mRNA derivati ​​over-plasmide derivato tag conteggi per ogni coppia di librerie di sequenziamento. Se più tag diversi sono stati collegati per ogni variante di sequenza, utilizzare i loro rapporti mediani per l'analisi a valle.

Representative Results

MPRA facilita ad alta risoluzione, dissezione quantitativa delle relazioni sequenza-attività di elementi di regolazione trascrizionale. Un esperimento MPRA prescelto sarà tipicamente misurazioni risulteranno altamente riproducibili per la maggior parte delle sequenze nella libreria transfettate (Figura 3A). Se scarsa riproducibilità si osserva (Figura 3B), ciò è indicativo di una concentrazione troppo bassa di mRNA del reporter nei campioni di RNA recuperati, a causa sia 1) bassa attività assoluto tra le sequenze dosati, o 2) bassa efficienza di trasfezione.

La Figura 4 mostra un rappresentante "informazione impronta" ^1,2 generato analizzando ~ 37.000 varianti casuali di una sequenza di 145 bp a monte del gene IFNB umano in cellule HEK293 con o senza esposizione al virus Sendai. Il promotore TATA-box e noto esaltatore prossimale ¹⁰ possono essere chiaramente identificati come regi ricco di informazionions in maniera virus-dipendente.

Figura 3 Tag-Seq riproducibilità. Diagrammi a dispersione mostrano esempi di dati Tag-Seq da due transfezioni replicati indipendenti con alta (A) e bassa (B) riproducibilità. Il secondo grafico mostra molti tag outlier con elevato numero di mRNA in una sola delle due repliche. Tali manufatti in genere indicano che le concentrazioni di mRNA giornalista erano troppo bassi per PCR quantitativa, sia a causa di bassa attività assoluti tra i costrutti reporter, o bassa efficienza di trasfezione.

Figura 4. Informazioni footprinting del sito di inizio della trascrizione IFNB umana e potenziatore prossimale. IFNB umana sono stati analizzati utilizzando MPRA in cellule HEK293 con (A) e senza (B) esposizione al virus Sendai. Le barre blu indicano la reciproca informazione tra l'uscita giornalista e il nucleotide in ogni posizione. Il potenziatore prossimale e TATA-box si distinguono come regioni ad alto contenuto informativo su infezione virale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers