Massivt Parallelle Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

Introduction

Massivt Parallelle Reporter Analyser (MPRA) tillate multiplex måling av transkripsjonsregulerende aktiviteter ener til hundretusener av DNA-sekvenser ^{1- 7.} I deres mest vanlige gjennomføringen, er multipleksing oppnås ved kobling av hver sekvens av interesse for en syntetisk reporter-genet som inneholder et identifikasjonssignal-sekvens nedstrøms for en åpen leseramme (ORF, figur 1). Etter transfeksjon, RNA isolering og sekvensering av dype til 3 'endene av reporter gen-transkripter, kan de relative aktiviteter av de koblede sekvenser utledes fra den relative overflod av deres identifisering av tagger.

Figur 1. Oversikt over MPRA. Et bibliotek av MPRA reporter konstruerer er konstruert ved kobling antatte regulatoriske sekvenser til syntetiskrapportørgener som består av en "inert" ORF (eksempel GFP eller luciferase) etterfulgt av et identifikasjonssignal-sekvens. Biblioteket er tilført i hopetall inn i en populasjon av dyrkede celler og transkribert reporter mRNA er senere gjenfunnet. Dyp-sekvensering blir brukt til å telle antallet forekomster av hver merkelapp mellom rapportør mRNAer og de transfekterte plasmider. Forholdet av mRNA teller løpet plasmid teller kan benyttes til å utlede aktiviteten av den tilsvarende regulerende sekvens. Tilpasset med tillatelse fra Melnikov, et al ^to.

MPRA kan tilpasses et bredt spekter av eksperimentelle design, herunder 1) omfattende mutagenese av individuelle genet regulatoriske elementer, 2) scanning for nye regulatoriske elementer over et locus av interesse, 3) testing av effekten av naturlig genetisk variasjon i et sett av putative arrangører, Forsterker eller lyddempere, og 4) semi-rasjonell prosjektering av syntetiske regulatoriske elementer. Libraries av sekvensvarianter kan genereres ved hjelp av en rekke metoder, inkludert oligonukleotid bibliotek syntese (OLS) på programmerbare mikromatriser ^2,3,6,7, montering av degenererte oligonukleotider ^1,4, kombi ligation ⁸ og fragmentering av genomisk DNA ^fem.

Denne protokollen beskriver byggingen av et bibliotek av arrangøren varianter bruker OLS og pMPRA1 og pMPRAdonor1 vektorer (Addgene IDer 49349 og 49352, henholdsvis; http://www.addgene.org), transient transfeksjon av dette biblioteket i dyrkede pattedyrceller og påfølgende kvantifisering hos arrangøren aktiviteter ved dyp sekvensering av deres tilknyttede koder (Tag-Seq). Tidligere versjoner av denne protokollen ble brukt i forskning rapportert i Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) og i Kheradpour et al. Genome Forskning 23, 800-811 (2013).

Protocol

1. Sequence design og syntese

1. Begynn MPRA med design og syntese av sekvenser som skal undersøkes, for regulatorisk aktivitet. For kompatibilitet med pMPRA vektor-serien, designe hver sekvens ved hjelp av følgende mal: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- Var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ", der Var betegner sekvensen som skal analyseres og tag betegner en eller flere identifiserer tags.
2. De to variable regioner (Var og tag) er adskilt av et par KpnI (GGTACC) og Xbal (TCTAGA) restriksjonsseter for å lette retningsbestemt ligering av et reporter-gen-fragmentet mellom dem. I tillegg vil to forskjellige SFII (GGCCNNNNNGGCC) nettsteder legges til ved PCR for å tillate retnings ligation inn i pMPRA ryggrad. De variable regioner må ikke inneholde flere eksemplarer av noen av disse restriksjonsseter. Om nødvendig, kan en eller flere av disse restriksjonsenzymer kan erstattes, Så lenge som erstatninger 1) tillater effektiv kapping nær til endene av DNA-molekylene, og 2) ikke skjære andre steder i vektorsekvensen. Se diskusjon for ytterligere detaljer.
3. Skaff de nødvendige primere oppført i tabell 1 fra en kommersiell leverandør.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabell 1. Primer sekvenser. [Indeks] betegner en 6 til 8 nt index sekvens brukes for multiplexed sekvensering. Få minst åtte TagSeq-P2 primere med ulike indekser. Alleav de primere som blir renset ved hjelp av HPLC eller PAGE.

4. Oligonukleotid-biblioteker kan fås fra en kommersiell leverandør eller kjernefasilitet, eller genereres ved hjelp av en programmerbar mikromatrisebasert oligonukleotid synthesizeren som beskrevet av produsenten. Suspender OLS produkter i 100 ul TE 0.1 buffer.
5. Kjør oligonukleotid-biblioteker på en 10% TBE-Urea denaturerende polyakrylamidgel. Last inn ca 1 pmol per kjørefelt og flekken med ssDNA sensitive fluorescerende flekken for å vurdere deres kvalitet (Figur 2A).
6. Hvis en diskret bånd tilsvarende full-lengde oligonukleotider kan visualiseres (figur 2A, felt 1 og 2), skjære den tilsvarende akrylamid-gel og eluere skive oligonukleotider inn i 100 ul TE-0.1 over natten ved romtemperatur med risting. Ellers, fortsett å bruke rå OLS suspensjon.
7. Forsterke og legge SFII haler til oligonukleotid biblioteket ved hjelp av emulsjon PCR ⁹ sup>.
8. Sett opp 50 ul PCR-reaksjonsblandinger som beskrevet i tabell 2. Deretter kombinert med 300 ul av olje og overflateaktivt middel, blandingen fra Micellula DNA Emulsion and Purification kit og vortex i 5 min ved 4 ° C.

Reagens	1x Volume (ul)
Herculase II Fusion DNA Polymerase	0.5
5x Herculase II Reaction Buffer	10
dNTP (10 mm hver)	1.25
BSA (20 mg / ml)	1.25
Primer MPRA_SfiI_F (25 mm)	0,25
Primer MPRA_SfiI_R (25 mm)	0,25
OLS mal (1-10 attomol)	varierer
Nukleasefritt vann	50

ve_content "> Tabell 2. Emulsion PCR reaksjon mix (vannfasen).

9. Bruk av konsentrasjonen som gir den maksimale utbytte av amplifiseringsprodukter uten at utseendet av gjenstander (se avsnitt 1.12).
10. Tilsett den resulterende emulsjon inn i PCR-rør og utføre 20 sykluser med PCR (2 min ved 95 ° C, 20 x [20 sek ved 95 ° C, 20 sek ved 55 ° C, 30 sek ved 72 ° C], 3 min ved 95 ° C).
11. Pool og bryte hver 350 pl PCR-reaksjon emulsjon ved å tilsette 1 ml isobutanol og kort virvling og deretter rense produktet ved hjelp av en forsterkning DNA rensing kolonne.
12. Kjør en alikvot på en 2% eller 4% agarosegel for å verifisere gjenstand frie forsterkning (figur 2B).

Figur 2. Utarbeidelse av oligonukleotidsyntese biblioteker. A) B PCR-amplifikasjon.) Produkter av åpne og emulsjon PCR-amplifikasjon av det samme oligonukleotid biblioteket kjørt på en agarose gel. PCR forsterkning av komplekse oligonukleotid bibliotekene ofte skaper kimære produkter og andre gjenstander som kan vises som høyere og lavere band. Emulsion PCR kan minimere disse gjenstandene.

2. Library Construction

1. Tilbered en linearisert plasmid-ryggraden ved å fordøye vektor pMPRA1 med SFII ved 50 ° C i 2 timer, kjørt på en 1% agarosegel, skjære ryggraden båndet (i dette tilfelle, 2,5 kb) og renser det ved hjelp av en gel-rensing spinnkolonne.
2. Digestde emulsjon PCR-produkter fra trinn 1.4 med SFII ved 50 ° C i 2 timer og rense ved hjelp av DNA-rensekolonner.
3. For å ligere promoter-tag-bibliotek inn i den lineariserte vektoren ryggrad, satt opp reaksjoner inneholdende 100 ng av det fordøyde PCR-produktet, 50 ng av linearisert vektor ryggrad og T4-DNA-ligase. Inkuber over natten ved 16 ° C og deretter oppvarmning ved 65 ° C i 20 min for å inaktivere ligasen.
4. Transform E. coli med ligeringsreaksjonen. For å bevare biblioteket kompleksitet, som mål å få minst 10x mer cfu enn det er distinkte promoter-tag kombinasjoner i designet biblioteket.
5. Når det totale antall koder er omtrent 100.000, kan målet cfu typisk oppnås ved å utføre transformasjonene 6-8 parallelle per bibliotek.
6. For hver transformasjon, kombinere 50 mL electrocompetent E. coli-celler med 2 pl av ligerings blandingen på is. Transform av elektroporering, gjenopprette cellene i 800 mL SOCmedium ved risting ved 37 ° C i 1 time, og deretter kombinere cellene fra de parallelle transformasjoner.
7. For å evaluere transformasjonseffektivitet, plate seriefortynninger fra en alinquot av de gjenvundne celler på LB agarplater med 50-100 pg / ml Carbenicillin og inkuberes over natten ved 37 ° C. Beregn totalt cfu som (observert cfu) x (fortynningsfaktor) x (V - V) / V, hvor V er det totale volum av de gjenvundne celler og v er volumet av alikvoten tatt for de serielle fortynninger.
8. På samme tid, bruker resten av de gjenvundne celler for å inokulere 200 ml LB supplert med 100 pg / ml Carbenicillin. Dyrk celler ved 37 ° C over natten i en risteinkubator, og deretter isolere plasmid-DNA etter standard prosedyrer.
9. Fordøy en delmengde av det isolerte plasmid-bibliotek med SFII ved 50 ° C i 2 timer og kjøres på en 1% agarosegel for å bekrefte tilstedeværelse av innsatser.
10. Linearize plasmidet biblioteket ved cUtting mellom promotoren varianter og kodene ved hjelp KpnI og XbaI. Å maksimere fordøyelsen effektivitet, utføre serie digestions:
11. Først fordøye med Kpnl ved 37 ° C i 1 time og rens ved hjelp av magnetiske kuler. For det andre, fordøye med Xbal med tilsetning av 1 U alkalisk rekefosfatase ved 37 ° C i 2 timer, varmeinaktivering ved 65 ° C i 5 min, og deretter rense ved hjelp av magnetiske kuler.
12. Kjør en alikvot på en 1% agarosegel for å bekrefte fullstendig linearisering. Hvis kuttet plasmid er synlig, bør det lineariserte fragment bli gelrenset.
13. For å generere en MPRA bibliotek egnet for transfeksjon inn i pattedyrceller, ligate en ORF med KpnI / XbaI -kompatible endene inn i linearized mellom biblioteket.
14. For å fremstille en kompatibel luc2 ORF-fragment fra pMPRAdonor1, fordøye dette plasmid med Kpnl og Xbal ved 37 ° C i 1 time og kjøres på en 1% agarosegel. Vesenet ORF fragment (1,7 kb i dette tilfellet) og rens ved hjelp av en gel-rensing spinnkolonne.
15. Klon ORF-fragment inn i den lineariserte mellom bibliotek som beskrevet i trinn 2.3 til 2.8.
16. Fordøy en alikvot (tilsvarende 1-2 ug) av MPRA bibliotek med Kpnl ved 37 ° C i 1 time og kjøres på en 1% agarosegel. Dersom fordøyd biblioteket kjører som en enkelt band, fortsett til punkt 3. Hvis ytterligere band er observert (typisk tilsvarende overføring av mellomliggende konstruksjoner), kan biblioteket bli ytterligere renset som følger:
17. Fordøy 3-5 ug av det forurensede bibliotek med Kpnl ved 37 ° C i 1 time og kjørt på en 0,8% agarosegel over natten ved 4 ° C.
18. Avgifts riktig bibliotek band, rense DNA ved hjelp av en gel-rensing spin-kolonne og utføre selv-ligering ved hjelp av høy konsentrasjon T4 DNA-ligase ved 37 ° C i 1 time. Deretter gjentar transformasjon og endelig bibliotek DNA isolert som beskrevet i trinn 2.8.

3. Transfection, forstyrrelse, og RNA Isolation

1. For hver uavhengig transfeksjon, kultur det nødvendige antall celler (som bestemmes av MPRA biblioteket kompleksitet, se diskusjon) i passende medium. For eksempel kultur HEK293T / 17 celler i DMEM supplert med 10% FBS og L-glutamin / penicillin / streptomycin. Kultur celler i minst to uavhengige transfections for hvert bibliotek og eksperimentell tilstand.
2. Transfektere de dyrkede celler med MPRA plasmider. Den transfeksjon fremgangsmåte og betingelser som må være optimalisert for hver celletype. For hver transfektert prøven, beholder en alikvot (50-100 ng) av plasmid-DNA som en kontrollgruppe.
3. For eksempel transfektere 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 celler dyrket til ~ 50% samløpet i en 10 cm kultur tallerken med 10 mikrogram plasmid DNA i 1 ml Opti-MEM jeg Redusert Serum medium med 30 mL Lipofectamine LTX og 10 mL Plus Reagens. Fjern transfeksjon blandingen etter 5 timer og larceller for å gjenopprette i 24-48 timer.
4. Eventuelt utføre en forstyrrelse som kreves for å aktivere kontekst eller signalavhengig regulatoriske sekvenser i designet biblioteket.
5. Høste celler og isolere poly (A) + mRNA ved hjelp av standard oligo (dT) cellulose kolonner eller perler som bruker deres produsentens anvisninger.
6. Påse at den maksimale bindingskapasitet av kolonnene eller perler stiger den totale mengden av mRNA forventet fra de høstede celler. For eksempel er den forventede avkastningen fra avsnitt 3.3 ca 0,5-2,5 mikrogram mRNA.

4. Tag-Seq

1. For å eliminere overføring av vektor-DNA fra de transfekterte cellelysater, behandler hver 20 ul mRNA prøve med 1 pl Turbo DNase (2 U) og 2,3 pl 10x Turbo DNase-buffer ved 37 ° C i 1 time, tilsett 2,4 pl Turbo inaktive DNase Reagens på RT i 5 min med omrøring, sentrifuger ved 10.000 g i 90 sekunder, og deretter overføre oppløsningen til et friskt rør.
2. Bekreft renhet ved å utføre PCR som beskrevet i avsnitt 4.6 på 60-100 ng av hver mRNA prøve, og deretter å kjøre produkter på en agarose-gel. Hvis bestemte amplikonene er synlige (0,25 kb hvis du bruker pMPRA1 med luc2), kolonne rense behandlet mRNA og deretter gjenta DNase behandling.
3. For å generere Tag-Seq sekvense biblioteker, konvertere reporter mRNA til cDNA og legge sekvense adaptere med PCR.
4. Sett opp mRNA / RT primer blandinger som beskrevet i Tabell 3. Inkuber ved 65 ° C i 5 min, deretter plassere på is. Parallelt oppstilling cDNA-syntesereaksjoner, som beskrevet i tabell 4.

Reagens	1x Volume (ul)
mRNA prøve (400-700 ng totalt)	8
Oligo-0DT (50 mm)	1
dNTP (10 mm hver)	1

ove_content "> Tabell 3. RNA / Revers transkripsjon primerblanding for cDNA syntese.

Reagens	1x Volume (ul)
10x Superscript III RT Buffer	2
MgCl2 (25 mM)	4
DTT (0,1 M)	2
RNaseOut (40 U / mL)	1
Super III (200 U / mL)	1

Tabell 4. cDNA syntesereaksjonsblanding.

5. Forsiktig kombinere mRNA / RT primerblandinger med cDNA syntese mikser. Inkuber ved 50 ° C i 50 min, 85 ° C i 5 min og deretter plassere på is. Til slutt, inkuberes med 2 U of Ribonuclease H ved 37 ° C i 20 min.
6. Sett opp PCR-reaksjoner som beskrevet i tabell 5 med 4-6 mLcDNA reaksjonsblandingen eller 50 ng reporter plasmid som maler. Deretter utføre PCR-amplifikasjon (95 ° C i 2 min, 26 x [95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek], 72 ° C i 3 min).

Reagens	1x Volume (ul)
2x PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	25
Primer TagSeq_P1 (25 mm)	0.5
Primer TagSeq_P2 (25 mm)	0.5
Mal (mRNA, cDNA-blanding eller plasmid DNA)	varierer
Nukleasefritt vann	50

Tabell 5. Tag-Seq PCR reaksjon mix.

7. Kjør PCR produktene gjennom en 2% agarosegel, forbruks band som tilsvarer de Tag-Seq bibliotek amplikonene (0,25 kb hvis du brukerpMPRA1 med luc2) og rense disse ved hjelp av gel rensing spin kolonner.
8. Pool, denaturere og sekvensere de rensede Tag-Seq amplikonene direkte med en Illumina sekvense instrument.
9. Filter lav kvalitet leser ved å fjerne alt som a) inneholde en eller flere stilling med en Phred kvalitet scorer mindre enn 30 i løpet av den sekvensert tag eller b) ikke akkurat matche et designet tag. Telle antall ganger hver gjenværende tag vises i hvert bibliotek. Normalisere tag teller til TPM (tags per million sekvensert tags) og deretter beregne forholdet mellom mRNA-avledet tag tellinger i løpet av plasmid-avledet tag teller for hvert par av sekvense biblioteker. Hvis flere forskjellige koder ble knyttet til hver sekvens variant, bruke sine median forholdstall for genetisk analyse.

Representative Results

MPRA rette for høy oppløsning, kvantitativ disseksjon av sekvens-aktivitet relasjoner av transkripsjonsregulerende elementer. En vellykket MPRA eksperiment vil typisk gi svært reproduserbare målinger for de fleste av sekvenser i transfektert biblioteket (figur 3A). Dersom dårlig reproduserbarhet er observert (figur 3B), er dette en indikasjon på en for lav konsentrasjon av rapportør mRNA i de gjenvunne RNA prøver, på grunn av enten 1) lavt absolutt aktivitet blant de analysert sekvenser, eller 2) lav transfeksjon effektivitet.

Figur 4 viser en representativ "informasjon fotavtrykk" ^1,2 genereres ved å analysere ~ 37000 tilfeldige varianter av en 145 bp-sekvens oppstrøms for det menneskelige IFNb genet i HEK293-celler med og uten eksponering for Sendai-virus. Arrangøren TATA-boksen og kjente proksimale Enhancer ¹⁰ kan tydelig identifiseres som informasjonsrikt reginer i en virusavhengig måte.

Figur 3. Tag-Seq reproduserbarhet. Scatter plott som viser eksempler på Tag-Seq data fra to uavhengige replikere transfections med høy (A) og lav (B) reproduserbarhet. Sistnevnte Plottet viser mange avvik tagger med høy mRNA teller i bare ett av de to gjentak. Slike gjenstander vanligvis indikere at konsentrasjonene av rapportør mRNA var for lav for kvantitativ PCR amplifikasjon, enten på grunn av lave absolutte aktiviteter blant rapportør konstruksjoner, eller transfeksjon lave virkningsgrader.

Figur 4. Informasjon footprinting av den menneskelige IFNb transkripsjon start stedet og proksimale forsterker. IFNb-genet ble analysert ved hjelp av MPRA i HEK293-celler med (A) og uten (B) eksponering av Sendai-virus. De blå linjer viser gjensidig informasjon mellom rapportøren utgang og nukleotid ved hver posisjon. Den proksimale enhancer og TATA-boksen skiller seg ut som områder med høy informasjonsinnhold på virusinfeksjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers