Massively Parallel Reporter Analyser hos odlade däggdjursceller

Introduction

Massively Parallel Reporter Analyser (MPRA) tillåter multiplex mätning av transkriptionsreglerande verksamhet tusentals till hundratusentals DNA-sekvenser ^{1- 7.} I sin vanligaste implementering är multiplexering uppnås genom koppling av varje sekvens av intresse till en syntetisk reportergen som innehåller en identifierande sekvens tagg nedströms om en öppen läsram (ORF; Figur 1). Efter transfektion, RNA-isolering och djupa sekvensering av tre "ändarna av reporter gentranskript, kan de relativa verksamhet de kopplade sekvenser härledas från den relativa förekomsten av deras identifieringstaggar.

Figur 1 Översikt över MPRA. Ett bibliotek med MPRA reporter konstruktioner konstrueras genom koppling förmodade regulatoriska sekvenser till syntetiskareportergener som består av ett "inert" ORF (såsom GFP eller luciferas) följt av en identifikationskod sekvens tag. Biblioteket transfekteras en masse i en population av odlade celler och transkriberade reporter mRNA därefter återhämtat sig. Djupt sekvense används för att räkna antalet förekomster av varje tagg bland reporter mRNA och de transfekterade plasmider. Förhållandet av mRNA räknas över plasmid räkningar kan användas för att sluta sig till aktiviteten hos den motsvarande regleringssekvensen. Anpassad med tillstånd från Melnikov, m.fl. ^2.

MPRA kan anpassas till en mängd olika experimentella designer, bland annat 1) omfattande mutagenes av individuella genreglerande element, 2) söka efter nya reglerelement över ett lokus av intresse, 3) testa effekten av naturliga genetiska variationen i en uppsättning av förmodad promotorer, förstärkare och ljuddämpare, och 4) halv rationell konstruktion av syntetiska regulatoriska element. Libraries av sekvensvarianter kan genereras med hjälp av olika metoder, bland annat oligonukleotid bibliotekssyntes (OLS) på programmerbara mikroarrayer ^2,3,6,7, montering av degenererade oligonukleotider ^1,4, kombinato ligering ⁸ och fragmentering av genomiskt DNA ^5.

Detta protokoll beskriver konstruktion av ett bibliotek av promotor-varianter med användning OLS och de pMPRA1 och pMPRAdonor1 vektorer (Addgene IDs 49.349 och 49.352, respektive; http://www.addgene.org), övergående transfektion av detta bibliotek in i odlade däggdjursceller och efterföljande kvantifiering av promotor verksamhet genom djupa sekvensering av tillhörande taggar (Tag-Seq). Tidigare versioner av detta protokoll användes i forskningen redovisas i Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) och i Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1 Sequence Design och syntes

1. Börja MPRA med design och syntes av sekvenser som ska analyseras för lagstiftningsverksamhet. För kompatibilitet med pMPRA vektor serien, utforma varje sekvens enligt följande mall: 5 'ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3', där var betecknar den sekvens som skall analyseras och tagg betecknar en eller flera identifierande taggar.
2. De två variabla regioner (Var och tag) är åtskilda av ett par Kpnl (GGTACC) och Xbal (TCTAGA) restriktionsställen för att underlätta riktad ligering av en reporter genfragment mellan dem. Dessutom kommer två distinkta Sfil (GGCCNNNNNGGCC) webbplatser sättas genom PCR för att möjliggöra riktad ligering in i pMPRA ryggraden. De variabla regionerna får inte innehålla ytterligare exemplar av någon av dessa restriktionsställen. Om så är nödvändigt, en eller flera av dessa restriktionsenzymer kan ersättas, Så länge som de utbyten 1) möjliggöra effektiv kapning nära ändarna av DNA-molekyler, och 2) inte skär någon annanstans i vektorsekvensen. Se diskussion för mer information.
3. Skaffa erforderliga primers som anges i tabell 1 från en kommersiell leverantör.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabell 1 Primersekvenser. [Index] betecknar en 6 till 8 nt index sekvens som används för multiplex sekvensering. Skaffa minst 8 TagSeq-P2 primers med olika index. Allaav primrarna bör renas genom HPLC eller PAGE.

4. Oligonukleotid-bibliotek kan erhållas från en kommersiell leverantör eller kärna anläggning eller genereras med hjälp av en programmerbar mikroarraybaserad oligonukleotidsyntetiserare såsom beskrivs av tillverkaren. Resuspendera OLS produkter i 100 ^ TE 0,1 buffert.
5. Kör de oligonukleotida bibliotek på en 10% TBE-urea denaturerande polyakrylamidgel. Fyll ca 1 pmol per körfält och fläcken med ssDNA känslig fluorescerande fläck att bedöma deras kvalitet (Figur 2A).
6. Om ett diskret band motsvarande oligonukleotiderna fullängds kan visualiseras (figur 2A, spår 1 och 2), utklippning av det motsvarande akrylamidgel skiva och eluera oligonukleotiderna in i 100 | il TE 0,1 över natten vid rumstemperatur med skakning. Annars går du vidare med den råa OLS fjädring.
7. Förstärk och lägg Sfil svansar till oligonukleotiden biblioteket med emulsion PCR ⁹ sup>.
8. Ställ in 50 l PCR reaktionsblandningar som beskrivs i tabell 2. Sedan kombineras med 300 l olja och tensidblandning från Micellula DNA Emulsion och rening kit och skaka i 5 minuter vid 4 ° C.

Reagens	1x volym (l)
Herculase II Fusion DNA Polymerase	0,5
5x Herculase II Reaction Buffer	10
dNTP (10 mM vardera)	1,25
BSA (20 mg / ml)	1,25
Primer MPRA_SfiI_F (25 pM)	0,25
Primer MPRA_SfiI_R (25 pM)	0,25
OLS mall (1-10 attomol)	varierar
Nukleasfritt vatten	till 50

ve_content "> Tabell 2 Emulsion PCR-reaktionsblandning (vattenfasen).

9. Använd den koncentration som ger maximalt utbyte av amplifieringsprodukter utan uppkomsten av artefakter (se avsnitt 1.12).
10. Fördela den erhållna emulsionen till PCR-rör och utför 20 cykler av PCR (2 min vid 95 ° C, 20 x [20 sek vid 95 ° C, 20 sek vid 55 ° C, 30 sek vid 72 ° C], 3 min vid 95 ° C).
11. Pool och bryta varje 350 pl emulsion PCR-reaktionen genom att tillsätta 1 ml isobutanol och kort vortexa och sedan rena amplifieringsprodukten användning av en kolonn DNA-rening.
12. Kör en alikvot på en 2% eller 4% agarosgel för att kontrollera artefaktfria amplifiering (Figur 2B).

Figur 2 Beredning av oligonukleotidsyntesen bibliotek. A) B) Produkter av öppna och emulsion PCR-amplifiering av samma oligonukleotid biblioteket kör på en agarosgel. PCR-amplifiering av komplexa bibliotek oligonukleotid skapar ofta chimära produkter och andra artefakter som kan visas som högre och lägre banden. Emulsion PCR kan minimera dessa artefakter.

2 Biblioteks Entreprenad

1. Förbered en lineariserade plasmiden ryggrad genom uppslutning vektor pMPRA1 med Sfil vid 50 ° C under 2 timmar, kördes på en 1% agarosgel, skära ryggraden bandet (i detta fall 2,5 kb) och rena den med en gel-rening spinnkolonn.
2. Digestde emulsions PCR-produkter från steg 1,4 med Sfil vid 50 ° C under 2 h och rening med användning av DNA-reningskolonner.
3. För att ligera den promotor-tag bibliotek i den linjäriserade vektorryggraden, inrättat reaktioner innehållande 100 ng av den digererade PCR-produkten, 50 ng av linjäriserad vektorryggraden och T4 DNA-ligas. Inkubera över natten vid 16 ° C och sedan värm vid 65 ° C under 20 min för att inaktivera ligaset.
4. Transformera E. coli med ligeringsreaktionen. För att bevara biblioteket komplexitet, syftar till att få minst 10x mer cfu än det finns distinkta promotor-taggkombinationer i utformade biblioteket.
5. När det totala antalet taggar är ca 100.000, kan målet cfu typiskt uppnås genom att utföra 6-8 parallella transformationer per bibliotek.
6. För varje transformation, kombinera 50 ^ elektrokompetenta E. coli-celler med 2 | il ligeringsblandning på is. Trans genom elektroporering, återställa cellerna i 800 l SOCmediet genom skakning vid 37 ° C under 1 h, och sedan kombinera celler från de parallella transformationer.
7. För att utvärdera omvandlingseffektiviteten, plattan serieutspädningar från en alinquot av återvunna celler på LB-agarplattor med 50 till 100 pg / ml karbenicillin och inkubera över natten vid 37 ° C. Uppskatta total cfu som (observerade cfu) × (spädningsfaktor) × (V - v) / v, där V är den totala volymen av återvunna celler och v är volymen av den alikvot som tagits för seriespäd.
8. Samtidigt använder resten av de återvunna cellerna för att ympa 200 ml LB kompletterat med 100 mikrogram / ml karbenicillin. Odla cellerna vid 37 ° C över natt i en skakinkubator och sedan isolera plasmid-DNA enligt standardförfaranden.
9. Matsmältning en alikvot av den isolerade plasmid-bibliotek med Sfil vid 50 ° C under 2 h och kördes på en 1% agarosgel för att bekräfta närvaron av skär.
10. Linjärisera plasmiden bibliotek genom ctt mellan promotorvarianter och taggar med Kpnl och Xbal. För att maximera matsmältningen effektivitet, utföra serie digestions:
11. Först smälta med Kpnl vid 37 ° C under 1 timme och rena med hjälp av magnetiska pärlor. För det andra smälta med Xbal med tillsats av 1 U Shrimp Alkaline Phosphatase vid 37 ° C under 2 h, värmeinaktivering vid 65 ° C under 5 min, och sedan rena med användning av magnetiska pärlor.
12. Kör en alikvot på en 1% agarosgel för att kontrollera fullständig linearisering. Om oklippt plasmid syns ska den lineariserade fragmentet gelrenades.
13. För att generera en MPRA bibliotek lämplig för transfektion i däggdjursceller, ligera en ORF med Kpnl / Xbal -kompatibla gavlarna till arisemellan biblioteket.
14. För att framställa en kompatibel luc2 ORF-fragmentet från pMPRAdonor1, smälta denna plasmid med Kpnl och Xbal vid 37 ° C under en timme och kördes på en 1% agarosgel. Skära ORF fragment (1,7 kb i detta fall) och rena med hjälp av en gelrening spinnkolonn.
15. Klona ORF fragmentet i den linearisemellanbiblioteket enligt steg från 2,3 till 2,8.
16. Matsmältning en alikvot (motsvarande 1-2 ug) av MPRA bibliotek med Kpnl vid 37 ° C under en timme och kördes på en 1% agarosgel. Om diger biblioteket körs som ett enda band, gå vidare till avsnitt 3 Om ytterligare band observeras (typiskt motsvarande överföring av mellanliggande konstruktioner), kan biblioteket renas ytterligare enligt följande:
17. Matsmältning 3-5 ^ g av det förorenade bibliotek med Kpnl vid 37 ° C under en timme och kördes på en 0,8% agarosgel över natten vid 4 ° C.
18. Excidera korrekt bibliotek bandet, rena DNA med användning av en gelrening spinnkolonn och utför själv-ligering med användning av hög koncentration av T4 DNA-ligas vid 37 ° C under 1 tim. Upprepa sedan omvandlingen och sista bibliotek DNA-isolering som beskrivs i steg 2.8.

3 Transfection, Perturbation och RNA Isolation

1. För varje oberoende transfektion, kultur det nödvändiga antalet celler (bestämd enligt MPRA bibliotekets komplexitet, se Diskussion) i lämpligt medium. Till exempel odlings HEK293T / 17-celler i DMEM kompletterat med 10% FBS och L-glutamin / penicillin / streptomycin. Kultur celler för minst två oberoende transfektioner för varje bibliotek och experimentell skick.
2. Transfektera de odlade cellerna med MPRA plasmider. Transfektionen förfarande och förhållanden måste optimeras för varje celltyp. För varje transfekterad prov, behålla en alikvot (50-100 ng) av plasmid-DNA som en matchad kontrollgrupp.
3. Exempelvis transfektera 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 celler odlade till ~ 50% sammanflöde i en 10 cm odlingsskål med 10 mikrogram plasmid-DNA i 1 ml Opti-MEM jag Minskad Serum Medium använder 30 ul Lipofectamine LTX och 10 pl Plus reagens. Avlägsna transfektion blandningen efter 5 timmar och tillåtaceller att återhämta sig under 24 till 48 tim.
4. Eventuellt utföra någon störning krävs för att aktivera kontext eller signalberoende regulatoriska sekvenser i konstruerade biblioteket.
5. Skörda cellerna och isolera poly (A) +-mRNA genom användning av standard oligo (dT) cellulosakolonner eller pärlor med användning av deras tillverkarens instruktioner.
6. Se till att den maximala bindningskapaciteten av kolumnerna eller pärlor överstiga det sammanlagda beloppet av mRNA förväntas de skördade cellerna. Till exempel den förväntade avkastningen från avsnitt 3.3 är ungefär 0,5-2,5 ng mRNA.

4 Tag-Seq

1. För att eliminera överföring av vektor-DNA från transfekterade cellysat, behandla varje 20 ^ mRNA provet med 1 pl Turbo DNas (2 U) och 2,3 l 10x Turbo DNas buffert vid 37 ° C i 1 timme, tillsätt 2,4 l Turbo DNas Inaktive Reagens på RT i 5 min med blandning, centrifugera vid 10000 g under 90 sekunder, och sedan överföra lösningen till ett nytt rör.
2. Verifiera renhet genom att utföra PCR enligt beskrivningen i avsnitt 4.6 på 60-100 ng av varje mRNA prov, och sedan kör de produkter på en agarosgel. Om specifika amplikoner är synliga (0.25 kb om du använder pMPRA1 med luc2), kolumn renar behandlade mRNA och sedan upprepa DNas behandling.
3. För att generera Tag-Seq sekvense bibliotek, konvertera reporter mRNA till cDNA och lägga sekvense adaptrar med PCR.
4. Ställ in mRNA / RT-primer-blandningar som beskrivs i Tabell 3. Inkubera vid 65 ° C under 5 min, sedan placera på is. Parallellt inrättat cDNA syntesreaktioner som beskrivs i tabell 4.

Reagens	1x volym (l)
mRNA prov (400-700 ng totalt)	8
Oligo-0DT (50 ^ iM)	1
dNTP (10 mM vardera)	1

ove_content "> Tabell 3 RNA / Omvänd transkription primer mix för cDNA-syntes.

Reagens	1x volym (l)
10x Superscript III RT buffert	2
MgCl2 (25 mM)	4
DTT (0,1 M)	2
RNaseOut (40 U / ^ il)	1
Superscript III (200 U / ^ il)	1

Tabell 4 cDNA-syntesreaktionsblandningen.

5. Kombinera försiktigt mRNA / RT primer blandas med cDNA syntesblandningar. Inkubera vid 50 ° C under 50 min, 85 ° C under 5 min och sedan placera på is. Slutligen, inkubera med 2 U Ribonuclease H vid 37 ° C i 20 minuter.
6. Ställ in PCR-reaktioner som beskrivs i tabell 5 med 4-6 plcDNA-reaktionsblandningen eller 50 ng reporterplasmid som mallar. Utför sedan PCR-amplifiering (95 ° C under 2 min, 26 x [95 ° C under 30 sek, 55 ° C under 30 sek, 72 ° C i 30 sek], 72 ° C under 3 min).

Reagens	1x volym (l)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix	25
Primer TagSeq_P1 (25 pM)	0,5
Primer TagSeq_P2 (25 pM)	0,5
Template (mRNA, cDNA mix eller plasmid-DNA)	varierar
Nukleasfritt vatten	till 50

Tabell 5 Etikett-Seq PCR-reaktionsblandningen.

7. Kör PCR-produkterna genom en 2% agarosgel, punktskatter band som motsvarar de Tag-Seq biblioteks amplicons (0,25 kb om du använderpMPRA1 med luc2) och rena dessa använder gelrening spinnkolonner.
8. Pool, denaturera och sekvensera de renade Tag-Seq amplikonerna direkt med en Illumina sekvense instrument.
9. Filtrera låg kvalitet läser genom att ta bort allt som a) innehålla en eller flera positioner med en Phred kvalitet slår mindre än 30 i sekvensmärke eller b) inte exakt matcha en utformad tagg. Räkna antalet gånger varje återstående taggen visas i varje bibliotek. Normalisera taggen räknas till TPM (taggar per miljon sekvense taggar) och sedan beräkna kvoten av mRNA-härledda taggantal över plasmid-härledda tagg räknas för varje par av sekvense bibliotek. Om flera olika taggar var knutna till varje sekvens variant använder sina medianförhållanden för nedströms analys.

Representative Results

MPRA underlättar högupplösta, kvantitativ dissektion av sekvens-aktivitetsförhållanden av transkriptionella regulatoriska element. En framgångsrik MPRA experiment kommer typiskt att ge mycket reproducerbara mätningar för majoriteten av sekvenserna i den transfekterade biblioteket (figur 3A). Om dålig reproducerbarhet observeras (figur 3B), är detta ett tecken på en alltför låg koncentration av reporter mRNA i de återvunna RNA-prover, på grund av antingen 1) låga absoluta aktivitet bland de analyserade sekvenserna, eller 2) låg transfektionseffektivitet.

Figur 4 visar ett representativt "informations fotavtryck" ^1,2 genereras genom analys ~ 37.000 slumpmässiga varianter av en 145 bp sekvens uppströms om den humana IFNB genen i HEK293-celler med eller utan exponering för Sendai-virus. Promotorn TATA-box och känd proximala förstärkare ¹⁰ kan tydligt identifieras som informationsrika regions i en virus-beroende sätt.

Figur 3 Tag-Seq reproducerbarhet. Spridningsdiagram som visar exempel på Tag-Seq data från två oberoende replikat transfektioner med hög (A) och låg (B) reproducerbarhet. Den senare tomten visar många utanförliggande taggar med hög mRNA räknas i endast en av de två replikat. Sådana artefakter indikerar vanligtvis att koncentrationerna av reporter mRNA var för låga för kvantitativ PCR-förstärkning, antingen på grund av låga absoluta verksamhet bland reporterkonstruktioner eller låga transfektionseffektiviteter.

Figur 4 Informationsavtryck av IFNB transkriptionsstartstället mänskliga och proximal förstärkare. IFNB genen analyserades med användning MPRA i HEK293-celler med (A) och utan (B) exponering mot Sendai-virus. De blå staplarna visar ömsesidig information mellan reportern utgången och nukleotid vid varje position. Den proximala förstärkare och TATA-box sticker ut som områden med hög informationsinnehåll på virusinfektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers