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Biology

जनरेशन और मानव INO80 Chromatin Remodeling परिसर और Subcomplexes का शोधन

Published: October 23, 2014 doi: 10.3791/51720
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल पैदा करने और जंगली प्रकार और मानव INO80 chromatin remodeling जटिल के उत्परिवर्ती संस्करणों सफ़ाई के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है. मिलान INO80 सब यूनिटों के संस्करणों stably HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं, और सब यूनिटों के विशिष्ट सेट की कमी पूरी परिसरों और परिसरों क्रोमैटोग्राफी क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध कर रहे हैं चिह्नित.

Abstract

INO80 chromatin remodeling परिसरों एटीपी निर्भर nucleosome remodeling उत्प्रेरित द्वारा nucleosome गतिशीलता और डीएनए अभिगम्यता विनियमित. मानव INO80 परिसरों Ino80, उत्प्रेरक सबयूनिट और परिसरों की विधानसभा के लिए पाड़ के रूप में दोनों में कार्य करता है जो एक SNF2 तरह ATPase, सहित 14 प्रोटीन से मिलकर. अन्य सब यूनिटों के कार्य और वे INO80 परिसर के chromatin remodeling गतिविधि में योगदान तंत्र है जिसके द्वारा खराब होने के कारण मानव कोशिकाओं या heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम में INO80 सबअसेंबली पैदा करने की चुनौती के लिए भाग में, समझा रहते हैं. इस जौव प्रोटोकॉल एक सबयूनिट या सब यूनिटों का एक सबसेट कमी कर रहे हैं कि मानव INO80 chromatin remodeling subcomplexes की शुद्धि की अनुमति देता है कि एक प्रक्रिया का वर्णन है. एन टर्मिनली झंडा मिलान Ino80 सीडीएनए stably मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन का उपयोग कर 293 सेल लाइनों में पेश कर रहे हैं चिह्नित. INO80 परिसर के सब यूनिटों का एक सबसेट ख है कि घटना मेंई एक उन सब यूनिटों की विधानसभा के लिए आवश्यक प्लेटफार्म की कमी है कि बजाय उत्परिवर्ती Ino80 प्रोटीन व्यक्त, नष्ट कर दिया. घटना में एक व्यक्ति सबयूनिट समाप्त किया जा रहा है, stably झंडा व्यक्त एक HEK 293 सेल लाइन में इस सबयूनिट को लक्षित एक transfects siRNAs Ino80 ATPase चिह्नित. परमाणु अर्क तैयार कर रहे हैं, और झंडा immunoprecipitation Ino80 डेरिवेटिव युक्त प्रोटीन अंशों को समृद्ध करने के लिए किया जाता है. शुद्ध INO80 subcomplexes की रचनाओं तो ऐसे immunoblotting, चांदी धुंधला, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पन्न INO80 और INO80 subcomplexes आगे साथ जौव प्रोटोकॉल में वर्णित हैं जो विभिन्न जैव रासायनिक assays, का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि किसी भी स्तनधारी बहु सबयूनिट chromatin remodeling के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन और संशोधित परिसरों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

Introduction

Evolutionarily संरक्षित SNF2 परिवार chromatin remodeling परिसरों क्रोमेटिन संगठन और डीएनए अभिगम्यता 1 के प्रमुख नियामकों हैं. ये remodeling परिसरों हमेशा कुछ मामलों में, विभिन्न गौण प्रोटीन के साथ assembles और बहु ​​सबयूनिट स्थूल आणविक विधानसभाओं रूपों, जो एक केंद्रीय SNF2 तरह ATPase सबयूनिट, शामिल हैं. एटीपी निर्भर chromatin remodeling प्रक्रिया के आणविक विवरण का अध्ययन करने के लिए, यह परिसरों की गतिविधियों के लिए सब यूनिटों और / या डोमेन संरचनाओं का दिया कैंपेन्स के योगदान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के विश्लेषण विशेष प्रोटीन या डोमेन संरचनाओं की कमी है कि अत्यधिक शुद्ध उत्परिवर्ती परिसरों उत्पन्न करने की क्षमता की आवश्यकता होती है.

एटीपी निर्भर chromatin remodeling परिसरों का पिछला संरचना समारोह पढ़ाई व्यापक रूप से (refs 1-4, उदाहरण के लिए, देखें) के कारण खमीर जीनोम की बेहतर manipulability लिए खमीर मॉडल प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया है. संरक्षण का दियाorthologous remodeling परिसरों के बीच सबयूनिट संरचना और कार्यक्षमता, संरचना और खमीर remodeling परिसरों के समारोह की पढ़ाई उच्च यूकैर्योसाइटों में अपने समकक्षों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. बहरहाल, प्रशंसनीय प्रजाति विशिष्ट remodeling परिसरों के बीच मतभेद लाभ या संरक्षित सब यूनिटों के संरक्षित डोमेन के भीतर प्रजातियों विशिष्ट सब यूनिटों, लाभ या संरक्षित सब यूनिटों की प्रजाति विशेष के डोमेन की हानि, और अनुक्रम परिवर्तनशीलता के नुकसान से उत्पन्न, मौजूद है. इस तरह के मतभेदों को सिद्धांत रूप में उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं नया आणविक और सेलुलर वातावरण के लिए अनुकूल करने के लिए जरूरत के द्वारा संचालित किया जा सकता है. यह न केवल तंत्र में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं भी एटीपी निर्भर chromatin remodeling प्रक्रिया के बुनियादी तंत्र पर प्रकाश डालता है, लेकिन क्योंकि इस प्रकार, उच्च यूकेरियोटिक remodeling परिसरों के सब यूनिटों nucleosome remodeling प्रक्रिया में योगदान कैसे समझ, मूल्यवान है जो chromatin संरचना द्वारा hig में और जीन अभिव्यक्तिउसे यूकैर्योसाइटों विनियमित रहे हैं.

इस प्रकार अब तक, केवल biochemically परिभाषित chromatin remodeling परिसरों और subcomplexes प्राप्त करने में कठिनाइयों की वजह से भाग में बहु सबयूनिट स्तनधारी chromatin remodeling परिसरों की संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन, वहाँ सीमित किया गया है. हम आंशिक रूप से क्रोमैटोग्राफी शुद्धि stably एन टर्मिनली झंडा मिलान जंगली प्रकार या Ino80 5-7 से उत्परिवर्ती संस्करणों में चिह्नित व्यक्त मानव कोशिकाओं से बरकरार INO80 या INO80 subcomplexes तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें नीचे वर्णित प्रक्रियाओं के साथ इन कठिनाइयों, circumvented है (चित्रा 1) . मानव कोशिकाओं से बरकरार INO80 परिसरों प्राप्त करने के लिए, FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन stably INO80 परिसर 8-10 की सब यूनिटों एन्कोडिंग झंडा मिलान चिह्नित cDNAs व्यक्त ट्रांसजेनिक HEK293 सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. INO80 सब यूनिटों की अधिक अभिव्यक्ति कुछ हद तक विषाक्त हो सकता है, क्योंकि यह अलग और चयनात्मक सह तहत प्रतिरूप सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैnditions बड़े पैमाने पर सेल संस्कृतियों के विस्तार के लिए आवश्यक कई मार्ग दौरान स्थिर transgene अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए. सब यूनिटों में से केवल एक सबसेट होते हैं कि छोटे INO80 subcomplexes प्राप्त करने के लिए, हम सफलतापूर्वक दो दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है (चित्रा 2A, बी). पहले में, हम stably विशिष्ट यूनिटों 5 के साथ बातचीत के लिए आवश्यक डोमेन कमी है Ino80 के उत्परिवर्ती संस्करणों व्यक्त HEK293 FLP में सेल लाइनों उत्पन्न करते हैं. वैकल्पिक रूप से, siRNA मध्यस्थता पछाड़ना एक उपयुक्त झंडा चिह्नित INO80 सबयूनिट (अप्रकाशित डेटा) व्यक्त कोशिकाओं से वांछित सबयूनिट व्यय किया जाता है. अंत में, मानव INO80 परिसरों को शुद्ध करने के लिए फ्लैग agarose आधारित क्रोमैटोग्राफी 11 जिससे प्रभावी रूप से शुद्ध INO80 या INO80 subcomplexes युक्त अंतिम अंश में साइटोसोलिक प्रोटीन contaminating की उपस्थिति को कम करने, परमाणु अर्क से एक INO80 युक्त अंश को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Protocol

1 जनरेशन और पूर्ण लंबाई या ध्वज की उत्परिवर्ती संस्करण जताते HEK293 स्थिर सेल लाइन्स की संस्कृति मिलान टैग Ino80 या अन्य INO80 परिसर सब यूनिटों

  1. पूरी लंबाई या उत्परिवर्ती मानव Ino80 ATPase या एक में फ्रेम, एन टर्मिनल झंडा मिलान टैग के साथ स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर pcDNA5 / FRT में एक और INO80 सबयूनिट एन्कोडिंग क्लोन सीडीएनए.
  2. आगे बढ़ने से पहले डीएनए अनुक्रमण द्वारा डाला cDNAs के अनुक्रम की पुष्टि करें.
  3. अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए, DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम), 5% glutamine युक्त मध्यम में 10 सेमी टिशू कल्चर बर्तन में HEK293 कोशिकाओं में FLP-बढ़ती है, और 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम).
  4. कोशिकाओं ~ 70% confluency तक पहुँचते हैं, कुल मात्रा में, प्रत्येक टिशू कल्चर डिश FuGENE6 अभिकर्मक अभिकर्मक के 40 μl, उचित pcDNA5 / FRT अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के 0.5 ग्राम, और FLP recombinase encodes जो pOG44, की 9.5 ग्राम का एक मिश्रण जोड़ें 800 μl की.
  5. 48 घंटे बाद, Trypsinize और एसPLIT 01:30 10 में सेमी व्यंजन के अनुपात में कोशिकाओं, और 5% glutamine, 10% FBS के साथ DMEM में उन्हें विकसित, और 3 के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी - 4 सप्ताह. (- 5 दिन आम तौर पर हर 3) यह पीले रंग की बारी शुरू होता है जब भी संस्कृति के माध्यम से बदलें.
  6. झंडा चिह्नित प्रोटीन के उच्चतम स्तर व्यक्त कि सकारात्मक क्लोन की पहचान करने के लिए, व्यक्तिगत hygromycin बी प्रतिरोधी कालोनियों का चयन करें और एक 24 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से करने के लिए उन्हें स्थानांतरित.
    1. कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा ~ 1 मिलीलीटर पीबीएस और गोली में अच्छी तरह से प्रत्येक से 80% confluency, फसल कोशिकाओं तक पहुँचने.
    2. सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 60 μl में सेल गोली resuspend.
    3. एसडीएस पृष्ठ और ध्वज की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए पश्चिमी सोख्ता को resuspended सेल गोली का विषय आधा चारा प्रोटीन चिह्नित; भविष्य का विश्लेषण करती है के लिए अन्य आधा बचा.
  7. कोई झंडा चिह्नित मानव Ino80 प्रोटीन सेल lysates में पाया जाता है, प्रारंभिक प्रतिरूप सेल लोकप्रियता का विस्तार15 सेमी टिशू कल्चर बर्तन में एक 24 अच्छी तरह से थाली की एकल कुओं से कोशिकाओं चढ़ाना से आगे आबादी.
    1. 15 सेमी बर्तन, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बर्फ ठंड पीबीएस में मिला हुआ कोशिकाओं के पास resuspend और स्थानांतरण से कोशिकाओं फसल के लिए.
    2. अतिरिक्त पीबीएस जोड़कर 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को ले आओ.
    3. गोली 5 मिनट के लिए 1000 XG पर कोशिकाओं, और सतह पर तैरनेवाला के लिए जितना संभव हटा दें.
    4. Lys450 बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली (20 मिमी HEPES-NaOH पीएच 7.9, 450 मिमी NaCl Resuspend, 0.5% TritonX-100, 10 मिमी KCl, 4 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी EDTA, 10% ग्लिसरॉल, 1 मिमी डीटीटी, 200 माइक्रोन PMSF, और 1: 1,000 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल).
      नोट: यहाँ और कहीं, हमेशा तुरंत एक प्रयोग शुरू होने से पहले बफ़र्स को डीटीटी, PMSF, और protease अवरोध कॉकटेल जोड़ें.
    5. इम्यूनो-वेग विरोधी झंडा agarose जेल के 20 μl का उपयोग परिणामस्वरूप पूरे सेल lysate से प्रोटीन झंडा चिह्नित, और पश्चिमी सोख्ता द्वारा झंडा eluates का विश्लेषण. [Immun की जानकारी के लिएoprecipitation प्रक्रिया, चरण 5 देखना]
  8. वांछित प्रतिरूप सेल लाइनों 12 के जमे हुए शेयरों को तैयार है और उपयोग करें जब तक तरल नाइट्रोजन में उन्हें दुकान.

रोलर बोतलों में 2 बढ़ते HEK293 सेल लाइन्स

INO80 परिसरों की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए, संस्कृति कोशिकाओं 10 में - 20 रोलर बोतलें; प्रत्येक रोलर बोतल से एक ठेठ उपज पैक कोशिकाओं की ~ 1 मिलीलीटर है.

  1. प्रत्येक रोलर बोतल, hygromycin बी के बिना 200 मिलीलीटर DMEM, 5% glutamine, और 10% बछड़ा सीरम, जोड़
  2. प्रत्येक रोलर बोतल में एक भी पास मिला हुआ 15 सेमी पकवान से कोशिकाओं के सभी स्थानांतरण
  3. प्लेस रोलर एक 37 डिग्री सेल्सियस रोलर बोतल इनक्यूबेटर में बोतलें और 0.2 rpm पर बारी बारी से.
  4. कोशिकाओं ~ 70% confluency तक पहुँचते हैं, टपकना और मध्यम त्यागें.
  5. प्रत्येक बोतल को ~ बर्फ की 50 मिलीलीटर ठंड पीबीएस जोड़ें. बोतलों होल्डिंग क्षैतिज, धीरे सेल monolayer ढीला ज़ुल्फ़.
  6. 250 मिलीलीटर प्लास्ट के लिए resuspended कोशिकाओं स्थानांतरणआईसी शंक्वाकार बोतलें और बर्फ पर जगह.
  7. अतिरिक्त पीबीएस के साथ रोलर बोतलों कुल्ला बोतल बोतल से क्रमिक रूप से स्थानांतरित. कुल्ला समाधान नहीं रह स्पष्ट (आमतौर पर के बारे में 5 बोतलें कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के बाद) हो गया है, सेल निलंबन में जोड़ें.
  8. 10 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
  9. धीरे, पीबीएस में कोशिकाओं resuspend एक एकल 250 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतल में उन्हें गठबंधन, और आगे की प्रक्रिया जब तक बर्फ पर रहते हैं.

एक और झंडा चिह्नित INO80 सबयूनिट व्यक्त कोशिकाओं में INO80 सब यूनिटों के 3 siRNA मध्यस्थता पछाड़ना

एक एकल सबयूनिट कमी INO80 subcomplexes प्राप्त करने के लिए उपयोग झंडा immunopurification stably shRNA व्यक्त siRNA इलाज कोशिकाओं या कोशिकाओं से INO80 परिसरों को शुद्ध करने के लिए. (छोटे दखल आरएनए) अभिकर्मक प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित "रिवर्स" siRNA 15 सेमी बर्तन में बढ़ HEK293 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है. प्रोटोकॉल कोशिकाओं और थानेदार की एक एकल 15 सेमी पकवान के लिए हैULD जरूरत कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है उसके अनुसार बढ़ाया जा. SiRNA इलाज कोशिकाओं से INO80 परिसर के biochemically उपयोगी मात्रा में तैयार करने के लिए, एक 40 से 15 सेमी बर्तन में उगाया संस्कृतियों के लिए ऊपर पैमाने पर होना चाहिए; पैक सेल गोली के 4 मिलीलीटर - इन लगभग 2 निकलेगा.

  1. Stably 15 सेमी बर्तन में पास confluency को INO80 परिसर के वांछित सबयूनिट व्यक्त HEK293 कोशिकाओं को विकसित.
  2. SiRNA मेजबान बफर के एक मात्रा में जोड़ें (20 मिमी KCl, 6 मिमी HEPES-पीएच 7.5, और 0.2 मिमी 2 MgCl) पर्याप्त lyophilized siRNA युक्त ट्यूब को siRNA के एक 50 माइक्रोन स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए. समाधान पिपेट और एक बार कुछ नीचे और siRNA पूरी तरह भंग कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए एक nutator पर सेते हैं.
  3. SiRNAs और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त अभिकर्मक कॉकटेल तैयार करें. बहुत सौम्य मिश्रण के साथ सीरम मध्यम कम 32 μl Lipofectamine RNAiMAX साथ 50 माइक्रोन siRNA स्टॉक समाधान के 10 μl मिक्स और Opti- सदस्य के 4 मिलीलीटर में जोड़ने; अलकम सभी अभिकर्मकों उपयोग करने से पहले आरटी को संतुलित करने के लिए.
  4. 30 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण सेते हैं.
  5. Stably अभिकर्मक के लिए वांछित INO80 सबयूनिट व्यक्त FLP में HEK293 कोशिकाओं तैयार करें.
    1. 3.4 कदम की ऊष्मायन के दौरान, आरटी पीबीएस के साथ एक बार 15 सेमी बर्तन में कोशिकाओं को धोने.
    2. वे प्लेट लिफ्ट बंद करने के लिए शुरू अभी तक पीबीएस हटाने के बाद, 1 मिलीलीटर trypsin के साथ कोशिकाओं का इलाज.
    3. तुरंत कोशिकाओं trypsinized और धीरे मिश्रण को पूरा मध्यम (DMEM + 5% glutamine 10% FBS) के 10 मिलीलीटर जोड़ें. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
    4. ~ 4 एमएल पूरा मध्यम में सेल गोली Resuspend, और एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग सेल मेजबान गिनती.
    5. ~ 5.4 x 10 6 / एमएल के एक एकाग्रता के लिए पूरा मध्यम के साथ कोशिकाओं पतला.
  6. प्रत्येक 15 सेमी डिश, 4 मिलीलीटर अभिकर्मक कॉकटेल द्वारा पीछा 15 मिलीलीटर पूरी संस्कृति के माध्यम जोड़ें. Thoro हैं मध्यम और अभिकर्मक कॉकटेल सुनिश्चित करने के लिए धीरे भंवरughly मिलाया. अंत में, समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए धीरे ज़ुल्फ़ फिर सेल निलंबन के एक मिलीलीटर जोड़ने और.
  7. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति के 60 घंटे के बाद, धीरे मध्यम, बर्फ ठंड पीबीएस में resuspend कोशिकाओं को हटाने और परमाणु अर्क तैयार करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना.

परमाणु अर्क के 4 तैयारी

यह प्रक्रिया Dignam 13 के प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है और सेल छर्रों शुरू करने के आकार के आधार पर नीचे तक पहुंचा जा सकता है. आमतौर पर, पैक सेल गोली पैदावार अंतिम परमाणु निकालने के 1 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर. सभी बफ़र्स बर्फ का ठंडा होना चाहिए, और एक उपयुक्त ठंड कमरा उपलब्ध नहीं है अगर सभी कदम एक ठंडे कमरे में या बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. नाभिक का अलगाव:
    1. धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर (15 या 50 मिलीग्राम) एक उपयुक्त आकार के लिए कोशिकाओं शंक्वाकार ट्यूब और स्पिन स्नातक हस्तांतरण.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और पैक सेल PEL की मात्रा को मापनेचलो. पैक कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर ~ 3 एक्स 10 8 HEK293 कोशिकाओं से मेल खाती है.
    3. 5 पैक सेल बफर की मात्रा (: 1,000 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल 10 मिमी HEPES, पीएच 7.9, 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl और हौसले से 1 मिमी डीटीटी, 200 माइक्रोन PMSF गयी, और 1) जोड़ें. कोमल pipetting द्वारा सेल गोली Resuspend.
    4. ठीक 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर गोली कोशिकाओं, और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
    6. सेल गोली के आकार के बफर ए में ऊष्मायन के दौरान 2 गुना तक बढ़ जाना चाहिए
    7. बफर के दो पैक सेल मात्रा में कोशिकाओं Resuspend, और एक उचित आकार Dounce ऊतक homogenizer सेल निलंबन हस्तांतरण. पैक कोशिकाओं का कम से कम 2 मिलीलीटर के साथ शुरू करते हैं, तो एक 7 मिलीलीटर homogenizer का उपयोग करें; 2 के लिए - 4 मिलीलीटर पैक कोशिकाओं, एक 15 मिलीलीटर homogenizer का उपयोग करें; और पैक कोशिकाओं के 10 या अधिक मिलीग्राम के लिए, एक 40 एमएल homogenizer का उपयोग करें.
    8. Dounce homogenizer संयुक्त राष्ट्र के ढीले कांच मूसल के साथ सेल निलंबन homogenizeकोशिकाओं के 90% टिल 1% trypan नीले रंग के साथ सकारात्मक दाग.
    9. एक जावेद -17 या इसी तरह के रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 25,000 XG पर एक 45 मिलीलीटर उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन को निलंबन स्थानांतरण (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें).
    10. परमाणु गोली से, साइटोसोलिक प्रोटीन या विभाजन के दौरान नाभिक के बाहर रिसाव कि प्रोटीन होता है जो सतह पर तैरनेवाला, हटा दें.
  2. नमक के साथ नाभिक निकालने:
    1. जोड़ें बफर सी (20mm HEPES, पीएच 7.9, 25% ग्लिसरॉल, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी EDTA, और हौसले गयी 1 मिमी डीटीटी, 200 माइक्रोन PMSF, और 1: 1,000 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल) परमाणु गोली; पैक सेल मात्रा (~ 1 एक्स 10 9 कोशिकाओं) शुरू करने की हर 3 मिलीलीटर के लिए 2.5 एमएल बफर सी का उपयोग करें.
    2. एक गिलास छड़ी या एक विंदुक का प्रयोग, ट्यूब की दीवार से परमाणु गोली बेदखल और एक उचित आकार का एक Dounce homogenizer के लिए पूरे मिश्रण हस्तांतरण.
    3. वें homogenizing द्वारा नाभिक Resuspendएक ढीला मूसल से दो स्ट्रोक के साथ ई मिश्रण.
    4. एक ठंडा बीकर में resuspended परमाणु अंश स्थानांतरण. निलंबन गहरी कम से कम 0.5 सेमी बीकर भर जाएगा कि इस तरह के एक बीकर चुनें.
    5. धीरे बर्फ पर एक विंदुक या गिलास छड़ी के साथ निलंबन क्रियाशीलता जबकि क्रोमेटिन या अन्य अघुलनशील संरचनाओं से परमाणु प्रोटीन निकालने के लिए, धीरे धीरे 5 एम NaCl के dropwise अलावा द्वारा 0.42 एम NaCl को निलंबन का नमक एकाग्रता में वृद्धि; 5 एम NaCl के सभी जोड़ दिया गया है एक बार, समाधान बहुत चिपचिपा या जेल की तरह हो जाना चाहिए. एम NaCl निम्न सूत्र के अनुसार 0.42 एम NaCl के अंतिम एकाग्रता का हल लाने की जरूरत 5 की मात्रा की गणना:
      समीकरण 1
    6. ध्यान से एक प्रकार 45 तिवारी ओ के लिए एक प्रकार 70.1 तिवारी रोटर के लिए 10 मिलीलीटर polycarbonate ट्यूबों में चिपचिपा निलंबन हस्तांतरण (या समकक्ष) या 70 मिलीलीटर पॉली कार्बोनेट की बोतलेंइसी तरह रोटर (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) आर. 70 मिलीलीटर की बोतल का उपयोग अगर 10 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग या टोपी विधानसभा के साथ अगर parafilm के साथ कसकर सील.
    7. धीरे धीरे एक nutator का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सील ट्यूब रॉक.
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 120,000 XG पर एक प्रकार 45 तिवारी या 30 मिनट के लिए 70.1 तिवारी रोटर में नमूने स्पिन.
    9. एक भी प्लास्टिक ट्यूब या बोतल स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. इस सतह पर तैरनेवाला परमाणु निकालने है, और गोली क्रोमेटिन और अन्य परमाणु मलबे में शामिल है.
    10. सुविधा आकार aliquots में परमाणु निकालने फूट डालो तरल नाइट्रोजन में इसे फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

मानव INO80 या INO80 Subcomplexes के 5 क्रोमैटोग्राफी शोधन

  1. जमे हुए परमाणु निकालने पिघलना करने के लिए, स्थिर सामग्री तक हाथों के बीच benchtop या रोल ट्यूब पर निकालने वाले जगह ट्यूब एक घोल बन जाता है. निकालने पूरी तरह से टी है जब तक फिर बर्फ पर या ठंडे कमरे में ट्यूबों की जगहhawed.
  2. फ्रीज पिघलना चक्र के दौरान गठित हो सकता है किसी भी वेग को दूर करने के लिए एक प्रकार 70.1 तिवारी रोटर या समकक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 100.000 XG पर thawed परमाणु 10 मिलीलीटर polycarbonate ultracentrifuge ट्यूबों को निकालने, और स्पिन स्थानांतरण.
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. 1,000 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल: 1 मिमी डीटीटी, 200 माइक्रोन PMSF, और 1 के अंतिम सांद्रता के लिए ताजा डीटीटी, PMSF, और protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल जोड़ें.
  4. , Immunopurification के लिए विरोधी झंडा agarose तैयार अंत में एक स्वच्छ स्केलपेल के साथ काट दिया गया है, जिसमें से एक टिप के साथ एक P200 या इसी तरह पिपेट का उपयोग कर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब विरोधी झंडा agarose मोती का 50% घोल के 200 μl स्थानांतरण करने के लिए या धार.
  5. 30 सेकंड के लिए 8000 XG पर एक benchtop microcentrifuge में centrifugation द्वारा मोती गोली. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और Lys450 बफर के 1 मिलीलीटर में मोती resuspending द्वारा मोती धोने, और 30 सेकंड के लिए 8000 XG पर मोती गोली. बी धोदो बार और ईएडीएस.
  6. अंत में एक स्वच्छ स्केलपेल या रेजर ब्लेड और, एक ही टिप का उपयोग कर, हस्तांतरण के साथ काट दिया गया है, जिसमें से एक टिप के साथ एक P200 या इसी तरह समायोज्य मात्रा पिपेट का उपयोग परमाणु निकालने के बारे में 100 μl में धोया विरोधी झंडा agarose मोती Resuspend निकालने वाले 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब resuspended मोती. मोतियों के सभी 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरित कर दिया गया है जब तक कुछ बार दोहराएँ.
  7. एक प्रयोगशाला रोटेटर पर धीमी रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए निकालने / मनका मिश्रण सेते हैं. वैकल्पिक: डीएनए contaminating दूर करने के लिए 25 इकाइयों / एमएल के एक एकाग्रता में Benzonase शामिल.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा झंडा agarose लीजिए.
  9. 10 मिलीलीटर Lys450 में Resuspend, धोने कोमल एक nutator पर कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर मोती गोली.
  10. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब Lys450 और स्थानांतरण मोतियों की 150 μl - 100 में resuspend. सहसभी मोती microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरित कर दिया गया है जब तक Lys450 के 150 μl - ntinue 100 के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला.
  11. एक microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 8000 XG पर मोती स्पिन. 1ml EB100 बफर (10 मिमी HEPES पीएच 7.9, 10% ग्लिसरॉल, 100 मिमी NaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.05% TritonX-100, और हौसले गयी 1 मिमी डीटीटी, 200 माइक्रोन PMSF के साथ एक बार 1 मिलीलीटर Lys450 साथ तीन गुना अधिक धो लें और , और 1: 1,000 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल).
  12. , बाध्य प्रोटीन elute 0.25 मिलीग्राम / एमएल 1x झंडा पेप्टाइड युक्त 200 μl EB100 बफर जोड़ने के लिए. एक nutator पर 4 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक पर 30 मिनट सेते हैं.
  13. एक microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 8000 XG पर मोती गोली. एक ताजा microcentrifuge ट्यूब, eluted INO80 जटिल होता है जो सतह पर तैरनेवाला, स्थानांतरण.
  14. क्षालन चार से अधिक बार दोहराएँ, और एक एकल ट्यूब में सभी supernatants पूल.
  15. Eluted प्रोटीन अंश से किसी भी अवशिष्ट झंडा agarose मोती निकालने के लिए,एक खाली स्पिन स्तंभ के माध्यम से eluate गुजरती हैं.
  16. Eluted प्रोटीन अंश ध्यान लगाओ ~ 10 गुना एक अल्ट्रा केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (50,000 आणविक वजन कटऑफ) का उपयोग.
  17. झंडा पेप्टाइड को निकालने के लिए दो desalting कॉलम के माध्यम से केंद्रित प्रोटीन अंश क्रमिक रूप से गुजरती हैं.
  18. तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, 20 μl aliquots में शुद्ध, desalted प्रोटीन अंश फूट डालो.
  19. चांदी से सना हुआ जैल पर या पश्चिमी सोख्ता द्वारा INO80 या INO80 subcomplexes की सबयूनिट संरचना का विश्लेषण करें, और मानकों के रूप में जाना जाता है एकाग्रता की पुनः संयोजक INO80 सब यूनिटों की तैयारियों का उपयोग अर्द्ध मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता द्वारा उनके सांद्रता का अनुमान है.

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Representative Results

चित्रा 1, उत्पन्न शुद्ध, और मानव INO80 एटीपी निर्भर chromatin remodeling परिसरों विशेषताएँ इस्तेमाल प्रक्रियाओं का सारांश एक प्रवाह चार्ट से पता चलता है.

आंकड़े 2 और 3 में सचित्र के रूप में, इन प्रक्रियाओं जिससे INO80 के enzymatic गतिविधियों के लिए इन लापता सब यूनिटों के योगदान के बाद जैव रासायनिक विश्लेषण को सक्षम करने, विभिन्न यूनिटों की कमी है कि दोनों जंगली प्रकार INO80 और INO80 subcomplexes की पीढ़ी को सक्षम. 2 हमारे पास दो रणनीतियों का वर्णन चित्रा INO80 परिसर की वास्तुकला परिभाषित करने के लिए और INO80 subcomplexes उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 2A में दिखाया गया है, पहले में बरकरार INO80 परिसरों जंगली प्रकार सब यूनिटों (Ies2 या INO80E) का ध्वज टैग संस्करणों के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं. Subcomplexes सब यूनिटों के विभिन्न सेट विधानसभा जिस पर व्यक्तिगत डोमेन कमी है कि उत्परिवर्ती Ino80 प्रोटीन का मिलान टैग संस्करणों के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता हैble. चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप परिसरों की पवित्रता चांदी का उपयोग कर मूल्यांकन किया है परिसरों की रचना विभिन्न INO80 सब यूनिटों (3B चित्रा) के खिलाफ या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर मूल्यांकन किया है, जबकि डेटा (एसडीएस polyacrylamide जैल दाग नहीं दिखाया गया है). इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम चित्रा 2A में लाल रंग में दिखाया गया सब यूनिटों Ino80 NTD (एन टर्मिनल डोमेन) का विलोपन पर खो गए थे कि पाया; नीले रंग में दिखाया गया सब यूनिटों Ino80 HSA (helicase संत एसोसिएटेड) डोमेन का विलोपन पर खो गए थे; और एक लंबे प्रविष्टि क्षेत्र (सफेद) द्वारा अलग SNF2N और HelicC क्षेत्रों (बैंगनी) से बना SNF2 ATPase डोमेन,, बैंगनी में दिखाया गया सब यूनिटों के लिए बाध्य करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त था. या तो कमी है कि इस प्रकार, INO80 subcomplexes (INO80ΔN.com या INO80ΔNΔHSA.com) लाल और नीले रंग में दिखाया लाल या सब यूनिटों में दिखाया गया सब यूनिटों झंडा Ino80ΔN या झंडा INO80ΔNΔHS के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता हैएक, क्रमशः 5.

यह एक उपयुक्त झंडा चिह्नित INO80 सबयूनिट (अप्रकाशित परिणाम) व्यक्त कोशिकाओं से व्यक्ति सब यूनिटों घट द्वारा subcomplexes उत्पन्न करने के लिए भी संभव है. चित्रा 2B में दिखाया गया है पहले उदाहरण में, सबयूनिट एक्स के siRNA मध्यस्थता पछाड़ना INO80 में किसी भी अन्य यूनिटों की विधानसभा के लिए आवश्यक नहीं है एक्स, सुझाव INO80 परिसर से ही एक्स depletes. दूसरे और तीसरे उदाहरण में, वाई या जेड या तो की siRNA पछाड़ना वाई और जेड एक पारस्परिक रूप से निर्भर ढंग से INO80 परिसर में इकट्ठा सुझाव, सह कमी वाई और जेड सब यूनिटों दोनों के लिए होता है.

चित्रा 1
. चित्रा 1 फ्लो चार्ट मानव INO80 एटीपी निर्भर chromatin remodeling परिसरों, उत्पन्न शुद्ध और विशेषताएँ इस्तेमाल प्रक्रियाओं का वर्णन एफ, एक एन टर्मिनल में फ्रेम झंडा मिलान टैग; भारत सरकार, जीन के को मेंब्याज. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
सब यूनिटों का एक सबसेट होते हैं कि INO80 subcomplexes उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया दो रणनीतियों दिखा चित्रा 2 आरेख. (ए) Ino80 ATPase अन्य INO80 सब यूनिटों को इकट्ठा जिस पर के रूप में मॉड्यूलर scaffolds कि समारोह क्षेत्रों में शामिल है. (बी) siRNA मध्यस्थता पछाड़ना एक उपयुक्त FLAG- व्यक्त कोशिकाओं से वांछित सबयूनिट (एक्स या वाई या जेड) खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चिह्नित INO80 सबयूनिट (जैसे, झंडा Ino80ΔN). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3 Immunopurified INO80 परिसरों और subcomplexes की रचना की चित्रा 3 विश्लेषण. (ए) INO80 परिसरों या subcomplexes stably एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन संकेत झंडा टैग प्रोटीन, व्यक्त कोशिकाओं से शुद्ध, और चांदी धुंधला द्वारा कल्पना थे. अधिकार सबसे लेन में नमूना कोई झंडा चिह्नित प्रोटीन व्यक्त कि 293 पैतृक कोशिकाओं से तैयार किया गया था; इस पर नियंत्रण लेन में दिखाई देते हैं कि प्रोटीन झंडा agarose को गैर विशेष रूप से है कि बाँध contaminants हैं. बाईं तरफ लेबल कई INO80 सब यूनिटों के लिए इसी बैंड से संकेत मिलता है, और सही वजन आणविक मार्कर की mobilities पर उन. जंगली प्रकार Ino80 की स्थिति काले आयत ने संकेत दिया है, और Ino80 म्यूटेंट के पदों पर खुला हलकों से संकेत कर रहे हैं. काला लाइन द्वारा अलग गलियों अलग जैल से कर रहे हैं. (बी) INO80 परिसरों और subcomplexes पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गयाप्रतिनिधि NTD, HSA की सब यूनिटों, और SNF2 मॉड्यूल के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग. इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था. चेन एट अल, मानव INO80 Chromatin Remodeling परिसर की सबयूनिट संगठन. एक evolutionarily संरक्षित कोर परिसर एटीपी निर्भर nucleosome Remodeling उत्प्रेरित. . पीपी 11283-11289: जैव रसायन विज्ञान खंड 286 के जर्नल. © 2011, जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी. द्वारा इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

उच्च यूकैर्योसाइटों से बहु सबयूनिट स्तनधारी chromatin remodeling परिसरों की संरचनात्मक और कार्यात्मक पढ़ाई उत्परिवर्ती सब यूनिटों से युक्त या कुल मिलाकर कुछ यूनिटों की कमी ऐसे परिसरों की biochemically उपयोगी मात्रा में तैयार करने की कठिनाई के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. सबसे पहले, स्तनधारी कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली हो गया है: तकनीकी बाधाओं के एक नंबर रहे हैं. जिसका जीनोम आसानी recombineering तकनीक का उपयोग कर संपादित किया और लक्षित किया जा सकता खमीर कोशिकाओं के विपरीत, स्तनधारी जीनोम अधिक संरचनात्मक जटिल और recombineering हस्तक्षेप करने के लिए कम संभावना है. इस प्रकार, संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों में विलोपन या स्तनधारी जीन का संशोधन अधिक समय लगता है और अधिक विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता है. एक परिणाम के रूप में, उत्परिवर्ती स्तनधारी परिसरों संरचनात्मक म्यूटेशनों ले जाने या सबयूनिट (एस) के सबसेट कमी की पीढ़ी दर सीमित कर दिया गया है. दूसरा, जैव रासायनिक पुनर्गठन असमलैंगिक का उपयोग दृष्टिकोणlogous प्रोटीन अभिव्यक्ति सिस्टम अक्सर परिभाषित बहु प्रोटीन विधानसभाओं उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण जिसका सब यूनिटों आवश्यकता हो सकती है एक साथ उचित stoichiometry में व्यक्त किया जा करने के लिए और / या विशिष्ट संरक्षिकाओं या सहकारकों से मदद के साथ, एक विशेष क्रम में इकट्ठा किया जा करने के लिए बहुत बड़े परिसरों, के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है. इसके Ino80 ATPase सबयूनिट कीट या ई में व्यक्त करने के लिए विशेष रूप से कठिन है क्योंकि इन समस्याओं, INO80 परिसर के मामले में विशेष रूप से गंभीर हैं biochemically उपयोगी मात्रा में कोलाई कोशिकाओं. INO80 chromatin remodeling जटिल की पढ़ाई में, यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीतियों का उपयोग कर इन चुनौतियों में से कुछ को नाकाम करने के लिए संभव हो गया है.

यह विभिन्न जैव रासायनिक एक का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है कि अच्छी तरह से परिभाषित chromatin remodeling परिसरों की शुद्धि सक्षम बनाता है stably INO80 परिसर के मिलान में चिह्नित सब यूनिटों व्यक्त मानव कोशिका लाइनों जनरेटिंग, इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम हैssays. यह पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए स्तनधारी सेल लाइनों में इंजीनियर cDNAs देने के लिए क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करने की तुलना में स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए काफ़ी सिद्धांत अधिक समय में है, क्षणिक अभिकर्मक कई कमियां से ग्रस्त है. सबसे पहले, डीएनए में एक क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट अतिरिक्त गुणसूत्र के रूप सेल चक्र के दौरान आत्म प्रचार नहीं कर सकते हैं आमतौर पर अल्पकालिक वेक्टर है और. दूसरा, अभिकर्मक दक्षता सेल प्रकार और विकास की स्थिति पर निर्भर करता है बहुत भिन्न होता है. विषम अभिकर्मक सेल आबादी के भीतर एक चयनात्मक विकास लाभ या नुकसान प्रदान कि एक मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न का कारण बन सकती है. इस प्रकार, क्षणिक transgenes प्रोटीन की biochemically उपयोगी मात्रा की शुद्धि के लिए आवश्यक कोशिकाओं की बड़ी राशि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कई सेल मार्ग के दौरान खो दिया हो जाते हैं की शुरुआत की. स्थिर सेल लाइनों सबसे अधिक एक प्रोटीन एन्कोडिंग cDNAs की यादृच्छिक एकीकरण में होने वाली विधियों के प्रयोग से उत्पन्न कर रहे हैंब्याज की. हालांकि, बेतरतीब ढंग से एकीकृत cDNAs अंतर्जात जीनों की अभिव्यक्ति को बाधित और कई सेल मार्ग के साथ जीन मुंह बंद करने के लिए विषय हो सकता है. इन कारणों के लिए, हम आम तौर पर सीडीएनए stably stably जीनोम में एकीकृत एक भी FRT साइट में FLP recombinase की मध्यस्थता प्रविष्टि के माध्यम से एक विशिष्ट गुणसूत्र स्थान में शामिल किया है जिसमें FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन प्रौद्योगिकी, का उपयोग कोशिकाओं में Ino80 cDNAs परिचय.

स्थिर सेल लाइनों का चुनाव करते समय, यह exogenously व्यक्त फ्लैग टैग, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती Ino80 प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है. झंडा चिह्नित Ino80 प्रोटीन अक्सर बहुत कम स्तर पर व्यक्त की है और इसलिए मुश्किल या एक 24 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से विकसित कोशिकाओं के कच्चे lysates में पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाने के लिए असंभव है, क्योंकि यह प्रारंभिक क्लोनल विस्तार करने के लिए अक्सर आवश्यक है सेल आबादी Ino80 प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग से पहले. झंडा चिह्नित Ino80 प्रोटीन तो शुद्ध और सह किया जा सकता हैपूर्व पश्चिमी सोख्ता से विश्लेषण करने के लिए ध्वज immunopurification द्वारा ncentrated.

siRNA मध्यस्थता पछाड़ना की दक्षता अभिकर्मक के समय में सेल घनत्व काफी संवेदनशील है; हम transfections प्रोटोकॉल में सिफारिश की है कि अन्य की तुलना में घनत्व में कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया जब पछाड़ना दक्षता की कमी हुई है पाया. siRNA अभिकर्मक के लिए समय के इष्टतम लंबाई चर रहा है और यह लक्ष्य प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों में लक्षित प्रोटीन का कारोबार दर की स्थिरता पर निर्भर करता है, के रूप में प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता है, और जो प्रोटीन को डिग्री सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है. व्यक्तिगत सब यूनिटों ख़ाली siRNAs की क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में, एक यह तेजी से और अधिक हो सकता है के रूप में चयनात्मक दबाव के तहत सेल लाइनों stably व्यक्त shRNAs पैदा करने पर विचार करना चाह सकते हैं लागत प्रभावी सेल लाइनों की biochemically उपयोगी मात्रा में विकसित करने के लिए. हालांकि, यह मुश्किल साबित हो सकता हैस्थिर सेल लाइनों में shRNA की मध्यस्थता पछाड़ना का उपयोग पर्याप्त पछाड़ना प्राप्त करने के लिए.

इसके अलावा हमारी प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण INO80 परिसरों की शुद्धि के लिए शुरू सामग्री के रूप में परमाणु अर्क का इस्तेमाल होता है. हम पूरे सेल के अर्क से immunopurified INO80 परिसरों अक्सर ATPase और / या Ino80 ATPase से सम्बंधित nucleosome remodeling गतिविधियों के साथ दूषित कर रहे हैं कि मिल गया है; परिसरों परमाणु अर्क से शुद्ध कर रहे हैं जब इस तरह के प्रदूषण को काफी हद तक बचा है.

परमाणु अर्क बरकरार INO80 परिसरों के अलगाव की तैयारी महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर पर निर्भर करता है. सबसे पहले, परमाणु अर्क तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं बरकरार है और स्वस्थ होना चाहिए. धोया सेल गोली प्रफुल्लित करने की उम्मीद है दो गुना कोशिकाओं प्रफुल्लित नहीं है और / या सतह पर तैरनेवाला कोशिकाओं के शुरू जनसंख्या अस्वस्थ हो सकता है, इस कदम पर परेशान हो जाता है hypotonic बफर ए में ऊष्मायन के बाद. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं फसल या मेजबान चरणों के दौरान भी मोटे तौर पर नियंत्रित किया गया हो सकता है, या वे बफर ए द्वितीय में भी लंबे समय incubated गया हो सकता है, यह इस क्रोमेटिन कतरनी और होगा के रूप में, कोशिकाओं या परमाणु गोली ज्यादा homogenize महत्वपूर्ण नहीं है घुलनशील अंश में डीएनए जारी. घुलनशील अंश में डीएनए बाद शुद्धि और INO80 परिसरों की परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. विशेष रूप से, डीएनए contaminating जिससे धोने और क्षालन कदम की क्षमता को कम करने और / या अंतिम विशुद्ध अंश में डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन contaminating की बहुतायत वृद्धि हो सकती है, agarose विरोधी ध्वज के साथ निकालने की ऊष्मायन के दौरान अवक्षेप की वृद्धि हुई गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं . इसके अलावा, डीएनए पर निर्भर कर रहे हैं कि नीचे की ओर जैव रासायनिक assays उपाय गतिविधियों, निकालने से डीएनए के इस प्रकार संभावित उठाने पर इन परीक्षणों की व्याख्या को मुश्किल हो सकती है. अधिक-homogenization से बचने के लिए, सेल के दौरान यह trypan नीले पॉजिटिव सेल का प्रतिशत जाँच करने के लिए सलाह दी जाती हैhomogenizer के प्रत्येक स्ट्रोक के बाद; homogenization के 6 स्ट्रोक - HEK293 कोशिकाओं के लिए, के पास पूरा सेल आम तौर पर 4 की आवश्यकता है. यह भी है homogenizing जबकि हवाई बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. चरण 4.2.8 में 120,000 XG स्पिन से सतह पर तैरनेवाला केवल एक बहुत कम chromatin गोली के पास बादल या चिपचिपा पदार्थ की मात्रा या शीर्ष पर चल साथ एक स्पष्ट, गैर चिपचिपा समाधान होना चाहिए. सतह पर तैरनेवाला एकत्रित करते समय यह क्रोमेटिन और / या डीएनए शामिल हो सकते हैं, जैसा कि एक, बादल या चिपचिपा सामग्री के किसी भी इकट्ठा करने के लिए नहीं ध्यान रखना चाहिए. अंत में, यह जमी कोशिकाओं से तैयार परिसरों कम विशिष्ट गतिविधि प्रदर्शन करने के लिए और अधिक contaminating डीएनए और प्रोटीन शामिल करने के लिए करते हैं, के बाद से परमाणु अर्क तैयार करने से पहले कोशिकाओं ठंड से बचने के लिए बेहतर है.

निकालने और विरोधी झंडा agarose शुरू करने की राशि के बीच इष्टतम अनुपात अर्क accessibi में मौजूद झंडा चारा प्रोटीन की एकाग्रता पर निर्भर करता हैझंडा मिलान और जरूरतों के lity अनुभव से निर्धारित किया जाना है. हम आम तौर पर विरोधी झंडा agarose मोती के 100 μl बिस्तर मात्रा और 3 के साथ immunopurification शुरू - परमाणु निकालने के 14 मिलीलीटर; इस्तेमाल किया निकालने की राशि प्रयोग और निकालने की उपलब्धता के लक्ष्यों पर निर्भर करता है. विरोधी झंडा agarose का उपयोग कर एक भी कदम immunopurification आमतौर पर उनकी गतिविधियों की विश्वसनीय assays के लिए पर्याप्त एक हद तक INO80 या INO80 subcomplexes शुद्ध करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, इस तरह जेल निस्पंदन, घनत्व ढाल अवसादन, या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के रूप में अतिरिक्त शोधन कदम (एस), अन्य परिसरों की शुद्धि के लिए आवश्यक हो सकता है या जैव रासायनिक assays की व्याख्या उलझा सकता है कि दूषित गतिविधियों को दूर करने के लिए.

यहाँ वर्णित रणनीतियों अधिक आम तौर पर उपयोगी अन्य chromatin remodeling एंजाइमों की पढ़ाई के साथ ही अन्य बड़े multiprotein परिसरों के लिए होना चाहिए. अन्य म्यू का विश्लेषण करने के लिए इन रणनीतियों का सफल आवेदनltiprotein परिसरों अन्य सब यूनिटों को इकट्ठा जिस पर पाड़ (एस) और सब यूनिटों के विशिष्ट सबसेट इकट्ठा जिसके साथ विशिष्ट डोमेन या क्षेत्रों (ii) परिभाषा के रूप में सेवा है कि एक व्यक्ति सबयूनिट या सबयूनिट (ओं) (i) पहचान पर निर्भर करता है. ऐसे डोमेन की परिभाषा में जाना संरचनात्मक डोमेन के अनुरूप है कि evolutionarily संरक्षित क्षेत्रों या क्षेत्रों के लिए कोर पाड़ सबयूनिट (एस) के प्राथमिक अनुक्रम का विश्लेषण करके की जा सकती है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

लेखक 'प्रयोगशाला में काम जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (GM41628) से अनुदान द्वारा और ग्रेटर कैनसस सिटी समुदाय फाउंडेशन में हेलेन नेल्सन मेडिकल रिसर्च फंड से मेडिकल रिसर्च के लिए Stowers संस्थान के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro 10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine) Life Technologies 35050-079
Fetal Bovine Serum SAFC 12176C
FuGENE6 transfection reagent Promega E2312
Hygromycin B, sterile in PBS AG Scientific H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector Life Technologies V6010-20
Flp-In HEK293 cells Life Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector Life Technologies V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma F2426
calf serum SAFC 12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool Dharmacon / Thermo Scientific various
5x siRNA resuspension buffer Dharmacon / Thermo Scientific #B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 51985-091
PBS Cellgro 45000 VWR
TrypLE (trypsin) Life Technologies 12604
1x FLAG Peptide Sigma F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column Bio-Rad 737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) Amicon UFC805024 Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns Thermo Scientific 89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse Sigma F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit Sigma F7425
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340
benzonase Novagen 70664
Equipment
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge Beckman-Coulter 339080
JA-17 rotor Beckman-Coulter 369691
10 ml polycarbonate tubes Beckman-Coulter 355630
70 ml polycarbonate bottles Beckman-Coulter 355655
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter 339160
Type 70.1 Ti rotor Beckman-Coulter 342184
BD Clay Adams Nutator Mixer BD Diagnostics 15172-203 VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator Glas-Col 099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200 MJ Research PTC 200
roller bottle incubator Bellco biotechnology 353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 Millipore IPFL07810
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes Costar 3207

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 92 chromatin remodeling INO80 SNF2 परिवार ATPase संरचना समारोह एंजाइम शुद्धि
जनरेशन और मानव INO80 Chromatin Remodeling परिसर और Subcomplexes का शोधन
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Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R.… More

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).

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