두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.
포유 동물과 곤충 모두에서 신경 세포의 정보는 다른 더 낮은 순서 뇌 센터에서 처리됩니다. 이 센터는 수렴 및 피드 포워드와 피드백 배선을 포함하여 분기 해부학 적 연결을 통해 연결되어있다. 또한, 같은 기원의 정보는 부분적으로 다른 때로는 같은 뇌 영역에 평행 경로를 통해 전송됩니다. 이러한 배선 전략과 서로에 대한, 특히 자신의 시간 종속성의 진화 혜택뿐만 아니라 전산 장점을 이해하기 위해서는 높은 시간 해상도에서 같은 준비에 다른 책자 또는 neuropiles의 단일 신경 세포에 대한 동시 접근이 필요하다. 여기에서 우리는 두 개의 연속 neuropiles 1, 더듬이 로브 (AL), 제 후각 처리 단계와 버섯 몸 (MB), 고차 통합 센터 invo에 멀티 유닛 활동을 기록하기 위해 고유의 세포 장기 접근을 보여줌으로써 꿀벌에 집중학습 및 기억 형성 또는 MB와 AL 연결이 병렬의 연결이 책자에 lved. 후자의 예로서 선택하고, 완전하게 설명 될 것이다. 지원 비디오에서 건설 및 유연한 멀티 채널 와이어 전극의 영구 삽입을 보여줍니다. 마이크로 와이어 전극 채널의 인접 쌍 차동 증폭 비약적 노이즈를 감소시키고 신호의 소스가 밀접 전극 팁의 위치와 관련되어 있음을 확인한다. 사용 와이어 전극의 기계적 유연성을 허용 안정적인 침략 장기 녹음 많은 시간 동안 기존에있는 여분의 세포 내 생체에 기록하는 기술에 비해 분명한 장점 일까지.
꿀벌뿐만 아니라 다른 대부분의 곤충은 주로 후각에 의존하고 있습니다. 다른 사람의 사이에 그들은 방향, 짝짓기, 동종와의 통신 및 채집을 위해 후각 신호를 사용합니다. 그들의 잘 정교 후각 시스템은 꽃 냄새 자극에 관련된 학습 행동의 풍부한 레퍼토리에 기여한다. (- 5 리뷰가 3 참조) 이러한 문제가 쉽게 제어 실험실 조건에서 공부하실 수 있습니다. 뉴런의 상대적으로 작은 숫자와 그들의 "미니 두뇌"(info 참조 6) 꿀벌의 후각 코딩을 공부하고 신경 활동의 모니터링 기간 동안 학습을위한 적합 모델 생물한다.
곤충뿐만 아니라 포유 동물의 후각 시스템 (검토를 위해 7,8 참조) 훌륭한 정도 유사한 구성을 보여줍니다. 꿀벌의 안테나 (10, 11)을 따라 sensillae에 위치한 약 80,000 수용체 뉴런 9 neur에 환경 냄새 자극을 번역ONAL 신호. 후각 수용체 뉴런의 축색 돌기는 척추 동물의 후각 망울에 비해 사구체 조직이 더듬이 로브 (AL)를 신경을 분포시키다. AL은 약 4,000 지역의 interneurons (LN)에 의해 서로 상호 연결에 대한 164 사구체를 포함한다 (검토를 위해 12 참조). 특히 꿀벌로는 림프절 누덕 누덕 기운 측면 연결을 제공하고 다른 모집단이 원소와 configural 후각 코딩 특성 (13, 14)을 가지고 있다는 것이 최근에 밝혀졌다. AL은 내측과 외측 더듬이 로브 기관 (M-및 L-ALT 상승을주는 복부와 지느러미 헤미 로브로 분할되는 것으로 도시되었다 이전에 M-및 내측 및 외측 더듬이 로브 protocerebral에 대한 L-APT 되나 ) 17 – 15 기관. 여기에 곤충 뇌의 통합 명칭에 대한 최근의 노력에 의해 도입 된 새로운 기관 용어 (18)이 사용됩니다. 두 ALTS는 (L-및 m-ALT) 410 (L-ALT) 또는 510 (M-ALT) uniglomerular proje 하나를 결합ction의 뉴런 (PN), 각각 15,16,19. 두 책자의 PN이 최근 (검토를 위해 17, 20 참조) 병렬 2의 코드 냄새로 표시되었습니다, 두 책자는 시냅스 케년 세포 (KC), 버섯 몸 (MB)가 교장 뉴런 분기 연결을 형성한다. 23 – 각 MB는 약 172,000 관세청 (21)를 포함하고 있습니다. 매크로 블럭은 자극 통합, 학습 및 기억 형성에 관여하는 것으로 알려져있다. Vertica의 또는 알파 – 로브 수평 또는 베타 – 로브 (22, 24) : 관세청의 AXO의 수상 돌기는 두 가지 출력 영역이 꽃자루 (버섯의 줄기)를 형성한다. MB의 출력은 약 400 외인성 뉴런 (EN) (24)에 수렴한다. 후각 정보 처리에 대해 책임이 대부분 수직 돌출부 (22)의 복부 측면에 분포 ENS. 최근에는이 지역에서 기록 EN들이 냄새 보상 협회 (25)를 인코딩하는 것으로 나타났습니다.
같은 시간29 – 곤충뿐만 아니라 척추 동물의 후각 시스템 내에서 pects는 잠재적 인 코딩의 원리 (26)와 같은 중요하고 중요한 부분이되었다. 동시에 높은 시간 해상도에서 다른 사이트에서 여러 개의 뉴런을 기록 할 수 있으려면, 우리는 꿀벌과, 후각 시스템에서 다른 대상 지역에 도입 된 사용자 정의 멀티 채널 와이어 전극을 사용하여 이중 멀티 유닛에 기록하는 기술을 설립했다. 이 방법은 하나의 뉴런과 평행선 후각, 이중 후각 통로 2 또는 다른 후속 neuropils 1 사이 신경 세포의 집단의 수준에서 꿀벌의 후각 시스템에서 시간 처리를 분석하고 비교하는 가능하게한다. 최근 전극의 다른 구성을 사용하는 로커스트 후각 시스템 (30)에서와 유사한 방식으로 실험 배경 불변 악취 인식 (31)을위한 시공간 부호화 메커니즘을 분석 할 수 있었다. 일우리, 기존 듀얼 레코딩 동시 연결 활동 프로파일에 대한 공간 정보를 수집 수 있습니다.
칼슘 이미징에서 얻은 넓은 공간 샘플링에 비해이 방법은 두 가지 지점에서 녹음을 할 수 있습니다. 그러나, 칼슘 이미징 기술에 비해 장점은 종래의 CCD 촬상 또는 2 광자 촬상 취득 하나에 의해 제공 될 수없는 활동 전위 기록의 높은 시간 정밀도이다. 여기에 설명 된 세포 전극은 영구적으로 이식 된 전극 드리프트를 방지 뇌와 머리 캡슐에 상대적으로 고정되어 있습니다. 이것은 날카로운 세포 내 전극의 사용에 비해 명확한 이점이다. 세포 내 기록과 칼슘 이미징에 비해 또 다른 장점은 많은 시간의 일에 이르는 확장 된 신경 관측 시간입니다. 이것은 학습과 기억 형성의 신경 상관 관계를 조사하는 중요한 전제 조건입니다. 다중의 추가 혜택단위 기록은 더 토론 섹션에 설명되어 있습니다.
이 방법론 개요에서는 사용자 정의 디자인 와이어 전극의 제조 과정이 표시됩니다 (32, 33)에서 적응과 꿀벌의 뇌의 장기 멀티 유닛 녹음에 적합. 또한, 전극의 이러한 유형은 영구적 동시에 기록하는 꿀벌 후각 시스템 내의 두 개의 다른 기록 사이트에서 주입되는 방법 예 L-많은 자극 프로토콜을 허용하는 긴 기간 동안 m-ALT는 2를 나타낸다. 기록 위치의 확인을 위해 기록 사이트의 염색 및 후 기록 시각화에 대한 예제 및 프로토콜이 제공된다.
이 문서는 생산 및 맞춤 설계 다중 채널 마이크로 와이어 전극의 사용 방법을 보여줍니다. 설명 전극을 하나의 단위 및 (자세한 내용은 1,2,25 참조를 위해) 하나의 표본 내에서 지연 시간 측정과 다른 뉴런과 다른 neuropils의 다른 시간 응답 특성에 특히 유용 인구 활동을 모두 기록하기에 적합하다. 또한 우리는 영구적 일까지 시간 동안 지속 꿀벌을 행동에 안정적인 장기 녹음을 할 수 있도록 마이크로 와이어 전극을 구현하는 방법을 보여 주었다.
세포 외 멀티 유닛 녹음은 공간 정보와 결합 된 높은 시간 해상도를 달성하기 위해 유리한 도구가되었다. 우리의 경우에, 이러한 병렬 신경원 소책자 또는 2 개의 상이한 neuropils 어느 하나이다. 다수의 뉴런 병렬 단일 뉴런 수준 및 높은 시간 해상도로 기록하고 분석 할 수있다. 다중 단위 기록41 – INGS 먼저 곤충 39 나중에 포유 동물 (38)에 적용 하였다. 실질적인 진전은 세포 외 멀티 채널 기록하는 기술 42,43의 개발 및 개선을 달성 하였다. 이것은, 예를 들어, 새로운 전극 (44) 또는 신규 스파이크 정렬 및 클러스터링 알고리즘 (45)의 개발을 포함한다. 48 – 세포 외 여러 장치에 기록하는 기술의 일반적인 방법이 아니라 46에 설명되어 있습니다. 이 비디오에 표시된 자체 내장 된 전극을 추가로 더 전극 당 microwires 또는 마이크로 와이어가 팁 사이에 측정 가능한 일정한 거리를 얻기 위해 트위스트 수를 추가하여 적용 할 수 있습니다. 두 절차는, 그러나, 유연성을 감소시키고, 전극의 두께를 증가로 이어질 것이다.
일반적으로 매 나방, 메뚜기와 바퀴벌레 40,49 같은 훨씬 더 큰 곤충 세포 레코딩에 사용되는 실리콘 프로브에 비해 – </SUP> (51) 기술 마이크로 와이어 전극, 유연 작은 잠재적 인 뇌의 움직임에 쉽게 대응할 수 있고, 따라서, 안정적으로 훨씬 광범위한 행동 레퍼토리를 보여 꿀벌과 개미 같은 작은 곤충 사회에서 사용할 수 있습니다. 설명 마이크로 와이어, 라운드 유연하고 작고 목표는 오래 공부하면 분명 장점이 주위 조직에 따라서 덜 해로운 동안 대부분의 실리콘 프로브는, 자신의 삽입 채널을 따라 축삭과 신경 조직을 절단 구조와 같은 날카로운 생크가 손상 및 행동 동물의 장기 소성. 마이크로 와이어 전극의 또 다른 장점은 저비용 제조 및 취급이 용이하다. 대신 정중 비싼 실리콘 프로브 세정 전극 와이어는 갓 그러므로, 혼잡의 결여 문제를 종래의 뇌에 삽입 컷된다. 또한 그것은 하나를 다른 하나 neuropiles O 삽입 동일한 제제에 하나 이상의 마이크로 와이어 전극을 사용하는 것이 가능하다R 책자 2 우리는 여기에서 보여준다. 이 방법은 다른 신경 처리 수준에서 응답 대기 시간 및 상호 작용 같은 시간적 측면을 분석하고 비교하는 것이 특히 바람직하다.
우리는 세포 외 기록 된 신호가 그 자체로 단일 세포 활성을 반영하지 않는다는 사실을 인식하고있다. 항상 전극 팁 주위 전압 활성 화합물이다. 하나의 전극 사이 인접한 두 마이크로 와이어 채널의 차이가 항상 계산 신호의 소스를 정확하게. 따라서 단일 유닛 활동을 추출하는 데 스파이크 신호 소스는 항상 하나 또는 쉽게 구별 스파이크 파형 발생 다른 전극 채널 중 하나에 매우 근접했다. 멀리에서 신호는 이웃 neuropils의 근육 활동 또는 활동과 같이 비슷한 모양과 진폭을 불러 일으키는 동시에 두 전극에 도달하고이 절차에 의해 삭제됩니다. Spike2의 템플릿 정합 기법을 사용우리는 동일하지 않습니다 하나의 유닛 활동을 얻기 위해 매우 확신하지만, 하나의 신경 세포의 활동에 매우 가깝습니다. 그러나, 스파이크의 정렬 문제는 세포 내 레코딩 기술을 사용하여 회피 될 수있다.
날카로운 전극 또는 패치 피펫 하나 단일 세포 기록은 단일 신경 세포의 생리적 특성에 대한 심층적 인 지식을 할 수 있습니다. 그러나, 작은 곤충 뉴런의 크기와 자신의 신경 돌기 (꿀벌 PN이 52 예. 미만 1 μm의)에만 단기 녹음 관리 할 수 있습니다. 또한, 내 휴대 전화 기록은 침략있을 가능성이 시간 제한에 대한 또 다른 이유는 세포에 손상을 줄 수있는. 곤충의 생체 세포 내 기록은 거의 한 시간보다 더 오래 갈 수 없습니다. 단일 식별 신경, 복부 짝 maxilar 신경 # 1 (VUMmx1)에서 세포를 기록 마틴 해머 (53)의 선구적인 작업을위한 충분있는 시간이 길어집니다. 그는 내가 할 수직접 보상 경로에 잉크의 활동. 율리아 Mauelshagen (54)는 세포 내에서 식별 된 버섯 신체 외부의 신경 세포의 활동을 등록, 고전적 조건 중 한 Pedunculus 외인성 신경 # 1 (PE1). 그들은 케년 세포의 전기 자극 후 LTP를 발견했을 때 동일한 신경 세포는 멘젤과 만츠 (55)의 초점이었다. 그러나 오카다와 동료 (56)는 세포 외 녹음하는 동안 PE1의 식별을 위해 세포 내에서 잘 특성화 급상승 패턴 (더블, 트리플 스파이크)를 사용할 수 있습니다. 두 가지 방법을 모두 조합 한 후, 확인 된 신경 세포와 세포 외 장기 녹음에서 세포 내 기록은 미래의 연구를위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.
그러나, 그들의 시간 반응 관계 및 / 또는 플라스틱의 변화를 분석하는 일까지 많은 시간 동안 다른 처리 레벨에서 동시에 여러 개의 셀 (단위)를 기록하는 날카로운 전극을 사용하여 전거의 불가능하다.
62 – 제 칼슘 이미징 칼슘 민감 염료를 사용하여 꿀벌에서 57,58 접근과 악취 응답의 공간 패턴의 분석은 59 접근되었습니다. 그러나, 많은 경우에 칼슘 민감 염료 다시 꿀벌의 수명 및 분석 세포의 본질적인 특성을 제한 침습 조작을 통해 뇌 조직에 도입되어야한다. 이 문제는 유전자 도입 칼슘 센서 63, 64을 사용하여 초파리와 같은 다른 모델 생물 극복된다. 그들은 가능성 악취 응답의 시간적 특성에 영향을 미치는 칼슘 버퍼로서 작용할 수로하지만, 일반적으로, 칼슘 센서는 다른 제한을 도입 할 수 있습니다. 칼슘 이미징 또는 계산 방법과 함께 동시 세포 내 기록은 영상의 적절한 시간 해상도는 65, 66를 처리 증명할 수 있습니다. 그러나, 화상 형성 공정 자체의 시간 해상도는 신속한이다R 제한. 2 광자 이미징 빠른 시퀀스 (68)를 획득 할 수있을 수도 있지만 광학 수집 시스템은 보통 5 ~ 20 Hz에서 67 시간 분해능으로 CCD 이미징을 사용합니다. 그러나, 증가 샘플링 속도는 항상 공간 해상도의 손실과 함께 간다. 또한 꿀벌에 사용 칼슘 민감 염료는 획득 시간 (69)을 감소 표백을 겪는다.
곤충의 다른 생리 학적 기록 기술에 비해 유연한 멀티 채널 마이크로 와이어 전극을 하나의 단위와 꿀벌 행동 인구의 연결 활동에 오랜 시간 접속을 보장합니다.
우리는 서로 다른 기록 사이트 간의 시간적 부호화 양태의 분석을 용이하게 동일 동물에서 상이한 처리 단계에서 이들 두 전극을 사용하는 방법을 설명했다. 연구 문제와 여기에 설명 전극 건물의 기본 방법 곤충 모델에 따라 쉽게 확장된다수 및 / 또는 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 다 채널 전극을 생성하기 위해 세 번의 와이어 이상을 사용하도록 고려된다. 또한, 기록 위치의 숫자는 연장 이상의 소책자 또는 neuropils의 시간적 측면을 관찰하는 것은 가능하다 할 수있다. 우리의 희망은이 방법은 많은 과학자를 격려하고 작은 두뇌의 복잡한 신경 처리의 이해에 긍정적으로 기여할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |