2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。
哺乳類や昆虫の両方における神経情報が異なる上位と下位の脳センターで処理されます。これらのセンターは、収束し、フィードフォワードおよびフィードバック配線を含む発散解剖学的な接続を介して接続されている。さらに、同じ起源の情報が部分的に異なる、時には同じ脳の領域へと並列経路を介して送信されます。これらの配線戦略、特にお互いに自分の時間的依存関係の進化の恩恵だけでなく、計算上の利点を理解するためには、高い時間分解能で同じ準備で別の管またはneuropilesの単一ニューロンへの同時アクセスを持っていることが必要である。ここでは、2以降のneuropiles 1、触角葉(AL)は、まず嗅覚処理段階とキノコ体(MB)、高次の統合センターINVOでマルチユニット活動を記録するためにユニークな細胞外の長期的なアクセスを実証することによってミツバチに集中学習および記憶形成、又はMBとALを接続する2つの平行な神経管2にLVED。後者の例として選択した、完全に説明される。支持ビデオフレキシブルマルチチャンネルワイヤ電極の構成と永久挿入が実証される。マイクロワイヤ電極チャネルの対の差動増幅を大幅にノイズを低減し、信号源は、電極先端の位置と密接に関連していることを検証する。使用するワイヤ電極の機械的柔軟性は、従来の余分およびin vivo記録技術における細胞内に比べて明らかな利点である、日まで多くの時間にわたって安定した侵略的な長期的な録音を可能にする。
ミツバチだけでなく、他のほとんどの昆虫は重く嗅覚に依存しています。とりわけ彼らは向き、交尾、同種との通信、および採餌のための嗅覚を使用しています。そのほかには、嗅覚系を精緻フローラルの匂い刺激に関連した行動を学習するの豊かなレパートリーに貢献しています。 (5 –口コミ3を参照)これらの動作は容易に制御された実験条件下で研究することができる。彼らの"ミニ頭脳」(cp. 6)神経細胞の比較的小さな数字でミツバチ神経活動の監視中に嗅覚コーディングや学習を研究するのに適したモデル生物になります。
昆虫だけでなく、哺乳動物の嗅覚系は、(レビューのために7,8を参照)を大幅に類似の組織を示している。ミツバチにアンテナ10,11に沿ってsensillaeに位置し約80,000受容ニューロン9は neurに環境匂い刺激を翻訳onal信号。嗅覚受容ニューロンからの軸索は、脊椎動物の嗅球に匹敵する糸球体の組織を持っている触角葉(Al)を、支配する。 ALは、約4,000局所介在ニューロン(LN) によって相互に接続約164の糸球体を含む(総説については12を参照されたい)。特にミツバチでは、LNSは斑状の横方向の接続を提供し、異なる部分集団は、元素及びconfigural嗅覚符号13,14性質を有することがことが最近示された。 ALは、内側と外側触角葉管(m-及びL-ALTを生じさせる腹と背側半葉に細分されることが示された。以前はm-および内側 – と横触角葉のprotocerebral用L-APTと呼ばれる管内15から17)。ここでは昆虫の脳の統一命名法のための最近の努力によって導入された新しい道の専門用語は、18を使用します。両方のALTは(L-およびM-ALT)410(L-ALT)、または510(M-ALT)uniglomerular projeいずれかを組み合わせてctionニューロン(PN)、それぞれ15,16,19。両方の管のPNには、最近(レビューのために17,20参照 )、平行2のコードの臭いに示されており、両方の管は、シナプスケニヨン細胞(KC)、キノコ体(MB)は、プリンシパルニューロンと発散接続を形成する。 23 –各MBは約172,000 KCの21が含まれています。 MBは、刺激の統合、学習、および記憶形成に関与することが知られている。のVerticaまたはα-ローブと水平またはベータローブ22,24:KCののAXOの樹状突起は、主に2つの出力領域を有し、花柄(キノコの茎)を形成する。 MBの出力は、約400外因性ニューロン(JA)24に収束する。嗅覚の情報処理を担当するが、ほとんど垂直のローブ22の腹側面を支配するENS。最近では、この領域に記録されたENには、臭気報酬の関連付け25をコードすることが示されている。
としての時間的29 –昆虫だけでなく、脊椎動物の嗅覚系内pectsは、潜在的なコーディングの原則26のような重要かつ重要な側面となっている。同時に、高時間分解能での異なるサイトから複数のニューロンを記録することができるために、我々は蜂の嗅覚系で異なる標的領域に導入され、カスタマイズされたマルチチャンネルワイヤ電極を用いた二重マルチユニット記録技術を確立しました。このアプローチは、単一のニューロンと、パラレル嗅覚経路、デュアル嗅覚経路2または別のその後のneuropils 1間の神経細胞の集団のレベルでミツバチの嗅覚系で時間的処理を分析し、比較することを可能にします。最近、電極の異なる構成を使用して、ローカスト嗅覚系30で同様の実験的なアプローチを背景不変の臭気認識31のための時空間コード化メカニズムを解析することができました。目当方、確立されたデュアル録音が同時に神経活動プロファイルに関する空間情報を収集できます。
カルシウムイメージングから得た広い空間サンプリングに比べてこの方法は、2スポットから録音することができます。しかしながら、カルシウムイメージング技術と比較して利点は、従来のCCD撮像又は2光子イメージング取得のいずれかによって提供することができない活動電位の記録の高い時間精度である。ここで説明する細胞外電極は、恒久的に移植された電極のドリフトを回避し、脳や頭部カプセルと比較して固定されている。これはシャープな細胞内の電極の使用量に比べて明らかな利点である。細胞内記録とカルシウムイメージングと比較したもう一つの利点は、何時間から日までの範囲の拡張、神経観測時間である。これは、学習と記憶形成の神経相関を調査するための重要な前提条件である。マルチのその他の利点単位記録はさらなる議論の項に概説されています。
この方法論の概要では、カスタム設計ワイヤ電極の製造手順は、32,33とミツバチの脳内の長期的なマルチユニットレコーディングに適してから適応、表示されます。さらに、これらのタイプの電極が永久的に多くの刺激プロトコルを可能にするために長期間にわたって同時にL-及びm-ALTを記録するためにミツバチ嗅覚系内の2つの異なる記録部位に注入する方法の一例が示されている2。記録位置の確認のために記録部位の染色後の記録可視化のための例とプロトコルを提供する。
この記事では、カスタム設計されたマルチチャンネルマイクロワイヤ電極の製造および使用方法を示しています。記載された電極は、単一のユニットと(詳細は1,2,25を参照)、単一の試料内での待ち時間の測定値と異なるニューロンと異なるneuropilsの他の時間応答特性のために特に便利です人口活性の両方を記録するのに適している。さらに我々は永久に日まで時間持続ミツバチの振る舞いに、安定した長期的な録音を可能にするために、マイクロワイヤ電極を実装する方法が示されている。
細胞外のマルチユニット記録は、空間情報と組み合わせ、高い時間分解能を達成するための有利なツールとなりました。我々の場合において、これらの神経路は、平行又は2つの異なるneuropils 1のいずれかである。複数のニューロンが並列に単一ニューロンレベルで、高時間分解能で記録し、分析することができる。マルチユニット記録41 –イングスは、最初の昆虫39に、後に哺乳類38で適用された。実質的な進展は、細胞外多チャンネル記録技術42,43の開発·改良を達成した。これは、例えば、新たな電極44または新規のスパイク45を選別し、クラスタリングアルゴリズムの開発を含む。 48 –細胞外多単位記録技術の一般的な方法は、46に記載されている。この動画に示される自己内蔵の電極は、さらに、電極あたりのマイクロワイヤを追加することによって適合させることができる、マイクロワイヤは、先端の間の測定可能な一定の距離を得るためにねじられ得る。両方の手順は、しかし、柔軟性が低下し、電極の厚さの増加につながる。
一般的にスズメガ、イナゴやゴキブリ40,49のようなはるかに大きな昆虫細胞外記録用に使用されるシリコンプローブに比べて– </商標> 51記載のマイクロワイヤ電極は、可撓性小さく、潜在的な脳の動きに容易に対応でき、従って、確実にはるかに広い行動レパートリーを示すミツバチやアリのような小さな社会性昆虫で使用することができる。記載されたマイクロワイヤは、ラウンド柔軟で小さく、目標は長く勉強している場合は明らかな利点で、周囲の組織への、したがって害が少ないながら、ほとんどのシリコンプローブは、その挿通チャンネルに沿って軸索と神経組織を切断する構造のような鋭いシャンクを持っている無傷で行動する動物での短期可塑性。マイクロワイヤ電極の別の利点は、その低コスト製造及び取り扱いが容易である。代わりに、慎重に高価なシリコーンプローブを洗浄の電極線を新たに、したがって、輻輳の欠如の問題を前に、脳への挿入および切断される。さらに、それはどちらか異なるneuropiles 1○内に挿入同じ製剤内の複数のマイクロワイヤ電極を使用することが可能であるRトラクト2我々はここに示したよう。このアプローチは、異なる神経処理レベルでの応答潜時との相互作用のような時間的な側面を分析し、比較することが特に有利である。
我々は細胞外記録された信号は、 それ自体が一つの細胞活性を反映していないという事実を認識しています。それは、常に電極チップの周りの電圧活性の化合物である。信号源を特定するために、一方の電極内で隣接する二つのマイクロワイヤーチャネルの差が常に計算されます。このように単一ユニット活動を抽出するために使用されるスパイク信号のソースは、常に1つまたは容易に識別可能なスパイク波形が得られる他の電極チャネルのいずれかに非常に近かった。遠くからの信号は、近隣neuropilsの筋活動や活動のように、比較可能な形や振幅を想起させると同時に、両方の電極に到達し、この手順によって破棄されます。 Spike2のテンプレートマッチング技術を用いて、私たちは同じではありません、単一のユニット活動を得るために非常に自信を持って、単一ニューロン活動に非常に近い。しかし、スパイクソーティングの問題は、細胞内記録技術を用いることによって回避することができる。
鋭い電極やパッチピペットのいずれかでの単一細胞記録は、単一のニューロンの生理学的特性についての徹底的な知識を許す。しかし、昆虫の神経細胞とその神経突起の小さなサイズ( 例えば 。ミツバチのために、1μm未満のPN 52)のみ短期録音を管理可能である。さらに、内細胞の録音は侵襲的かもしれませんし、場合によっては時間的な制限のためのもう一つの理由である細胞に害を与える可能性があります。昆虫におけるin vivo細胞内記録はほとんど1時間を長持ちしない。シングルに識別ニューロン、腹側の不対maxilarニューロン#1(VUMmx1)からの細胞内記録マーティンハンマー53の先駆的な仕事のために十分であった時間ウィンドウ。彼はLでし報酬経路に直接インクをその活性を。アーネMauelshagen 54が細胞内に特定されキノコ体の外因性ニューロンの活性を登録して、古典的条件の間に茎外因性ニューロン#1(PE1)。彼らはケニヨン細胞の電気刺激後にLTPを見つけたとき、同じニューロンはメンツェルとマンツ55の焦点が合っていた。しかし、岡田ら56は、細胞外記録中のPE1の識別のために、細胞内で十分に特徴付けられたスパイクパターン(ダブル、トリプルスパイク)を使用することができます。両方の方法の全てを組み合わせた後、特定されたニューロンおよび細胞外の長期的な記録から細胞内記録は、将来の調査のための強力なツールになるかもしれません。
しかし、私は彼らの時間応答の関係を分析するために日までに何時間かけて異なる処理レベルで同時に複数のセル(単位)を記録するために鋭利な電極を使用して、および/あるいはプラスチックの変更ほとんど不可能だ。
62 –最初のカルシウムイメージングは、カルシウム感受性色素を用いたミツバチ57,58に近付くと匂い応答の空間パターンの分析は、59アクセス可能だった。しかしながら、多くの場合、カルシウム感受性色素は、再度ハチの寿命と分析された細胞の固有の特性を制限侵襲的な操作を介して脳組織に導入しなければならない。この問題は、遺伝的に導入されたカルシウムセンサー63,64を使用してショウジョウバエのような他のモデル生物で克服される。それらはおそらく匂い応答の時間的な特性に影響を与えるカルシウムバッファとして作用することができるように、しかし、一般的に、カルシウムセンサは、他の制限を導入することができる。カルシウムイメージングまたは計算の手法と組み合わせて同時細胞内記録は、画像の適切な時間分解能が65,66を処理することを証明することができます。しかし、画像処理自体の時間分解能は、早咲きのですR限られた。 2光子イメージングは、より高速なシーケンス68を取得することができるかもしれませんが、光収集システムは、通常は、5月20日Hzの67の時間分解能で、CCDイメージングを使用しています。しかし、増加のサンプリングレートは常に空間分解能の損失と一緒に行く。さらにミツバチで使用されるカルシウム感受性染料も取得時間69を減少させ、漂白を受ける。
昆虫における他の生理学的記録技術と比較して、当社の柔軟なマルチチャンネルマイクロワイヤ電極は、単一のユニットと蜂を振る舞うの人口神経活動への長時間アクセスを確保。
我々は、異なる記録部位間の時間的符号化態様の分析を容易に同じ動物において、異なる処理段階で、これらの2つの電極を使用する方法を実証した。ここで示す電極の建物の基本的な方法昆虫研究課題とモデルに依存して、簡単に拡張されているできるおよび/または適合させることができる。例えば、それはマルチチャネル電極を製造するために3つの単一ワイヤよりも多くを使用することが考えられる。また、記録部位の数は拡張され、二つ以上の管またはneuropilsの時間的局面を観察することが可能であることができる。私たちの願いは、この方法は多くの科学者を鼓舞し、小さな脳で洗練された神経細胞の処理の理解に積極的に貢献することである。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |