Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.
In beide zoogdieren en insecten neuronale informatie wordt verwerkt in verschillende hogere en lagere orde hersencentra. Deze centra worden gekoppeld via convergente en divergente anatomische verbindingen waaronder feedforward en feedback bedrading. Verder wordt informatie van dezelfde oorsprong gedeeltelijk via parallelle wegen naar verschillende en soms in dezelfde hersengebieden. De evolutionaire voordelen als de rekenkundige voordelen van deze bedrading strategieën en vooral hun temporele afhankelijkheden elkaar begrijpen, is het noodzakelijk om gelijktijdige toegang tot enige neuronen van verschillende stukken of neuropiles in hetzelfde preparaat bij hoge temporele resolutie hebben. Hier concentreren we ons op honingbijen door aan te tonen een unieke extracellulaire toegang op lange termijn om multi eenheid activiteit opnemen op twee opeenvolgende neuropiles 1, de antennal kwab (AL), de eerste geur verwerkingsfase en de paddestoel lichaam (MB), een hogere orde integratie centrum involved in leren en geheugen vorming, of twee parallelle neuronale traktaten 2 aansluiten van de AL met de MB. De laatste werd als voorbeeld gekozen en zal volledig worden beschreven. In de ondersteuning van video van de bouw en permanente inbrengen van flexibele multi channel draadelektroden wordt aangetoond. Paarsgewijze differentiële amplificatie van het micro draadelektrode kanalen drastisch vermindert de ruis en controleert of de bron van het signaal nauw gerelateerd aan de positie van de elektrode. De mechanische flexibiliteit van de gebruikte draadelektroden laat stabiel invasieve langdurige opnames gedurende vele uren tot dagen, dat is een duidelijk voordeel ten opzichte van conventionele extra en intracellulaire in vivo opnametechnieken.
Honingbijen evenals de meeste andere insecten sterk afhankelijk zijn reukzin. Onder meer ze gebruiken olfactorische signalen voor oriëntatie, de paring, de communicatie met soortgenoten, en foerageren. Hun goed uitgewerkt olfactorische systeem draagt bij aan een rijke repertoire van leergedrag gerelateerd aan bloemen geur stimuli. Deze gedragingen kunnen gemakkelijk worden bestudeerd onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (voor een overzicht zie 3-5). Hun "mini hersenen" (vgl. 6) met hun relatief kleine aantallen neuronen maakt de honingbij een geschikt modelorganisme voor het bestuderen van olfactorische codering en het leren tijdens de bewaking van neurale activiteit.
Het olfactorische systeem insecten en zoogdieren toont analoog organisatie grotendeels (voor overzicht zie 7,8). In honingbijen ongeveer 80.000 receptor neuronen 9 gelegen in sensillae langs de antennes 10,11 vertalen het milieu geur stimulus tot een neuronale signaal. Axonen olfactorische receptor neuronen innerveren de antennaal kwab (AL) die een glomerulaire organisatie vergelijkbaar met de vertebraat bulbus olfactorius heeft. De AL bestaat uit ongeveer 164 glomeruli met elkaar verbonden door ongeveer 4000 lokale interneuronen (LN) (voor een overzicht zie 12). Vooral in de honingbij is onlangs aangetoond dat LNS bieden fragmentarisch laterale connectiviteit en dat verschillende subpopulaties bezitten elementaire en configurele olfactorische codering eigenschappen 13,14. De AL werd aangetoond worden onderverdeeld in een ventrale en een dorsale hemi kwab die aanleiding geven tot de mediale en de laterale antennaal kwab-darmkanaal (m-en l-ALT; voorheen genoemd m-en l-APT voor mediale-en laterale antennal kwab protocerebral darmkanaal 15-17). Hier een nieuw traktaat terminologie geïntroduceerd door een recente poging voor een uniforme nomenclatuur van het insect hersenen zal worden gebruikt 18. Beide ALTs (l-en m-ALT) combineren ofwel 410 (l-ALT) of 510 (m-ALT) uniglomerular projectie neuronen (PN), respectievelijk 15,16,19. PN van beide stukken zijn onlangs aangetoond code geuren in parallel 2 (voor een overzicht zie 17,20), en beide traktaten synaptically vormen uiteenlopende verbindingen met Kenyon cellen (KC), de paddestoel lichaam (MB) hoofdsom neuronen. Elke MB bevat ongeveer 172.000 KCs 21-23. De MB's zijn bekend betrokken te zijn bij stimulus integratie, leren en geheugen vorming. De axo dendrieten van KCs vormen de steel (steel van de paddestoel), die twee hoofduitgang regio heeft: de Vertica of alfa-kwab en de horizontale of beta-kwab 22,24. De uitgang van de MB convergeert slechts ongeveer 400 extrinsieke neuronen (NL) 24. Ens verantwoordelijk voor olfactorische informatieverwerking vooral innerveren het ventrale aspect van de verticale kwab 22. Onlangs is aangetoond dat ENS opgenomen in dit gebied coderen de geur beloning vereniging 25.
Temporele als29 – aspecten binnen het olfactorische systeem van insecten en gewervelde dieren hebben een belangrijke en significante aspect als een mogelijke codering principe 26 geworden. In staat zijn om tegelijkertijd op te nemen meerdere neuronen van verschillende sites op hoge temporele resolutie, hebben we dubbele multi-unit opnametechnieken met behulp van aangepaste multi channel draadelektroden ingevoerd om verschillende doelgebieden in olfactorische systeem van de bij. Deze aanpak stelt ons in de honingbij reuksysteem te analyseren en vergelijken temporele verwerking in het niveau van afzonderlijke neuronen en populaties van neuronen hetzij tussen parallelle olfactorische paden, de dubbele olfactorische pad 2 of tussen verschillende latere neuropils 1. Onlangs met een vergelijkbare experimentele benadering voor de sprinkhaan olfactorische systeem 30 met een andere configuratie van elektroden konden spatiotemporal codering mechanisme voor achtergrond-invariant geur herkenning 31 analyseren. Thons, de gevestigde dubbele opnames maken het mogelijk het verzamelen van ruimtelijke informatie over gelijktijdige neuronale activiteit profielen.
In vergelijking met de bredere ruimtelijke bemonstering verkregen uit calcium imaging deze methode kunt opnemen met slechts twee plekken. Echter, het voordeel ten opzichte van calcium beeldvorming is de hoge temporele precisie van actiepotentiaal opnamen die niet kan worden geleverd door een conventionele CCD of 2-foton beeldopname. Het extracellulaire elektroden beschreven permanent geïmplanteerd in verhouding tot de hersenen en het hoofd capsule vermijden elektrode drift vastgesteld. Dit is een duidelijk voordeel ten opzichte van het gebruik van scherpe intracellulaire elektroden. Een ander voordeel ten opzichte van intracellulaire opnames en calcium beeldvorming is de verlengde neurale observatietijd variërend van vele uren tot dagen. Dit is een belangrijke voorwaarde om neurale correlaten van leren en geheugen vorming te onderzoeken. Extra voordelen van multiunit registraties worden verder beschreven in het hoofdstuk discussie.
In deze methodologische overzicht het fabricageproces van aangepaste ontwerp draadelektroden zal worden getoond, aangepast van 32,33 en geschikt voor lange termijn multi-unit registraties in de honingbij hersenen. Bovendien wordt een voorbeeld hoe dit soort elektroden permanent geïmplanteerd op twee verschillende plaatsen in het opname honingbij reuksysteem simultaan de l-en m-ALT gedurende lange tijd veel stimulatieprotocollen toestaan weergegeven 2. Ter verificatie van de opname posities een voorbeeld en protocol voor kleuring en na opname visualisatie van de opname locaties wordt verstrekt.
Dit artikel legt de productie en het gebruik van op maat ontworpen multi channel micro draad-elektroden. De beschreven elektroden zijn geschikt voor het opnemen van zowel de eenheid en de bevolking activiteit die is vooral handig voor latency metingen en andere tijdelijke respons eigenschappen van verschillende neuronen en verschillende neuropils binnen een enkel exemplaar (voor details zie 1,2,25). Daarnaast hebben we laten zien hoe de micro draadelektroden permanent implementeren om stabiele lange-termijn-opnames in gedragen honingbijen die laatste uren tot dagen mogelijk te maken.
Extracellulaire multi-unit opnames werd een gunstig hulpmiddel om hoge temporele resolutie gecombineerd met ruimtelijke informatie te bereiken. In ons geval zijn dit hetzij parallel neuronale stukken of 2 twee verschillende neuropils 1. Meerdere neuronen kunnen worden opgenomen en geanalyseerd op het enkel neuron niveau parallel aan en op hoge temporele resolutie. Multi-unit opnemengen werden voor het eerst toegepast bij zoogdieren 38 en later ook bij insecten 39-41. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met de ontwikkeling en verbetering van extracellulaire multi-channel opnametechnieken 42,43. Dit, bijvoorbeeld, omvat de ontwikkeling van nieuwe elektroden 44 of nieuwe spike sorteren en clustering algoritmes 45. Algemene methoden van extracellulaire multi-unit opnametechnieken zijn goed beschreven 46-48. De zelfgebouwde elektroden getoond in deze video kan bovendien worden aangepast door het toevoegen van meer microwires per elektrode of de micro draden kunnen worden gedraaid om meetbare constante afstanden tussen de tips te krijgen. Beide procedures zou echter leiden tot afnemende flexibiliteit en toenemende dikte van de elektrode.
In vergelijking met silicium sondes gebruikt voor extracellulaire registraties in veel grotere insecten zoals de havik mot, sprinkhanen en kakkerlakken 40,49 – </sup> 51 beschreven micro draad-elektroden kleiner, flexibel en kan gemakkelijk omgaan met eventuele veranderingen hersenen en dus betrouwbaar kan worden gebruikt in kleine sociale insecten zoals bijen en mieren die een veel bredere gedragsrepertoire vertonen. De meeste siliconen sondes hebben scherpe schacht achtige structuren snijden axonen en zenuwweefsel langs hun inbrengen kanaal, terwijl de beschreven micro draden zijn rond, flexibel en kleiner en zijn dus minder schadelijk voor het omringende weefsel dat is een duidelijk voordeel als het doel is lang om te studeren termijn plasticiteit in een intact en gedraagt dier. Een ander voordeel van micro draadelektroden is hun lage kosten productie en de eenvoudige bediening. In plaats van zorgvuldige reiniging een dure siliconen sonde elektrode draden vers gesneden vóór hersenen inbrengen en dus gebrek congestieproblemen. Verder is het mogelijk om meer dan een micro draadelektrode gebruiken dezelfde preparaat ofwel ingevoegd in verschillende neuropiles 1 or traktaten 2 als we hier laten zien. Deze aanpak is vooral gunstig voor temporele aspecten zoals reactietijden en interacties op verschillende neurale verwerking niveaus te analyseren en te vergelijken.
Wij weten dat een extracellulair opgenomen signaal geeft niet cel-activiteit zodanig. Het is altijd een verbinding met de spanning activiteit rond de elektrode tip. Om de bron van het signaal het verschil van twee naburige micro draad kanalen binnen een elektrode wordt altijd berekend lokaliseren. Dus de bron van de steker signalen gebruikt om enkele eenheid activiteit extract waren altijd dichtbij een of de andere elektrode kanaal waardoor gemakkelijk te onderscheiden spike golfvormen. Signalen van verder weg, zoals spieractiviteit of activiteit van naburige neuropils bereiken beide elektroden tegelijk oproepen vergelijkbare vormen en amplitudes en volgens deze werkwijze worden verwijderd. Met behulp van de template matching techniek van Spike2,zijn wij zeer zeker om enkele eenheid activiteit, die niet hetzelfde is te verkrijgen, maar zeer dicht bij enkele neuron activiteit. Echter, de afgifte spike sortering worden voorkomen door intracellulaire meettechnieken.
Enkele cel opnames met ofwel scherpe elektroden of patch pipetten toestaan diepgaande kennis over de fysiologische eigenschappen van een enkel neuron. Echter, vanwege de geringe omvang van insecten neuronen en hun neurites (bv., Minder dan 1 micrometer voor honingbij PN 52) alleen op korte termijn opnames zijn beheersbaar. Bovendien zou intra cellulaire opnames invasief zijn en zou de cel die mogelijk een andere reden voor de tijdelijke beperkingen schaden. In vivo intracellulaire opnames bij insecten zelden overleven een uur. Een tijdvenster die voldoende is voor het baanbrekende werk van Martin Hammer 53 die intracellulair opgenomen van een enkel geïdentificeerd neuron, het ventrale ongepaarde maxilar neuron # 1 (VUMmx1) was. Hij kon linkt zijn activiteit rechtstreeks aan de beloning weg. Juliane Mauelshagen 54 intracellulair registreerde de activiteit van een geïdentificeerde paddestoel lichaam extrinsieke neuron, de Pedunculus extrinsieke neuron # 1 (PE1) tijdens klassieke conditionering. Dezelfde neuron was de focus van Menzel en Manz 55 toen ze LTP na elektrische stimulatie van Kenyon cellen. Echter, Okada en collega's 56 kon de intracellulair goed gekarakteriseerde stekelige patroon (twee-en driepersoonskamers spikes) gebruiken voor de identificatie van de PE1 tijdens extracellulaire opnames. Immers een combinatie van beide methoden kan intracellulaire opnames van geïdentificeerde neuronen en extracellulaire langdurige opnames een krachtig hulpmiddel voor toekomstige onderzoeken zijn.
Echter, het gebruik van scherpe elektroden op meerdere cellen (eenheden) tegelijkertijd op te nemen op verschillende niveaus verwerking gedurende vele uren tot dagen aan hun tijdelijke respons relaties en / of zelfs plastic veranderingen analyseren ibijna onmogelijk.
Met de eerste calcium beeldvorming benaderingen in de honingbij 57,58 behulp van calcium-gevoelige kleurstoffen de analyse van ruimtelijke patronen van geur reacties waren toegankelijk 59-62. In veel gevallen calcium gevoelige kleurstoffen moeten worden ingevoerd om het hersenweefsel via invasieve manipulaties die de bij de levensduur en de intrinsieke eigenschappen van de geanalyseerde cellen weer beperken. Dit probleem wordt ondervangen in andere model organismen zoals de fruitvlieg met behulp van genetisch geïntroduceerd calcium sensoren 63,64. In het algemeen, calcium sensoren kunnen andere beperkingen invoeren als ze kunnen optreden als calcium buffers die waarschijnlijk invloed hebben op de temporele eigenschappen van geur reacties. Gelijktijdige intracellulaire opnames in combinatie met calcium imaging of computationele benaderingen kunnen bewijzen dat de juiste temporele resolutie van beeldvormende processen 65,66. Echter, de temporele resolutie van de beeldvorming proces zelf is rather beperkt. Optische acquisitie systemen gebruiken meestal CCD-beeldvorming met een temporele resolutie van 5-20 Hz 67, hoewel 2-Photon-Imaging zou kunnen sneller sequenties 68 te verwerven. Echter, het verhogen van sampling rate gaat altijd samen met een verlies aan ruimtelijke resolutie. Verder is de calcium-gevoelige kleurstoffen dat bij de honingbij ondergaan bleken, waardoor ook acquisitietijd 69.
Vergeleken met andere fysiologische opnametechnieken bij insecten onze flexibele multi-channel micro-draadelektroden garanderen een lange-time toegang tot eenheid en de bevolking neuronale activiteit in gedragen bijen.
We zien hoe twee van deze elektroden gebruikt in verschillende bewerkingsstappen in hetzelfde dier, waarbij de analyse van temporele codering aspecten van de verschillende opname-gebieden vergemakkelijkt. Afhankelijk van de probleemstelling en het model insect de basismethode van de elektrode gebouw hier aangetoond is gemakkelijk uit te breidenstaat en / of kan worden aangepast. Zo is het denkbaar dat meer dan drie afzonderlijke aders om meerkanaals elektroden produceren. Bovendien kan het aantal opnamen locaties worden uitgebreid en observeren temporele aspecten van meer dan twee stukken of neuropils haalbaar. Onze hoop is dat deze methode veel wetenschappers zal inspireren en zal een positieve bijdrage leveren aan het begrip van geavanceerde neuronale verwerking in kleine hersenen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |