Gravações de longo prazo simultâneos extracelulares de duas neuropiles cerebrais diferentes ou dois setores anatômicas diferentes foram estabelecidos em abelhas. Essas gravações permitem a investigação de aspectos temporais de processamento neuronal em diferentes áreas do cérebro, no único neurônio, bem como a nível conjunto em um animal se comportar.
Em ambos os mamíferos e insetos informação neuronal é processada em diferentes centros de ordem superior e inferior do cérebro. Estes centros são acoplados via convergentes e divergentes conexões anatômicas incluindo alimentação para frente e fiação feedback. Além disso, a informação da mesma origem é parcialmente enviado através de vias paralelas ao diferente e, por vezes, nas mesmas áreas do cérebro. Para compreender os benefícios evolutivos, bem como as vantagens computacionais dessas estratégias de fiação e, especialmente, as suas dependências temporais à outra, é necessário ter acesso simultâneo a neurónios individuais de diferentes extensões ou neuropiles na mesma preparação a alta resolução temporal. Aqui nós nos concentramos em abelhas, demonstrando um acesso exclusivo extracelular longo prazo para gravar a atividade da unidade de multi em dois neuropiles seguintes 1, o lobo antenal (AL), o primeiro estágio de processamento olfativo eo corpo de cogumelos (MB), uma ordem superior centro de integração involved na aprendizagem e na formação da memória, ou dois setores neuronais paralelos 2 ligam a AL com a MB. O último foi escolhido como um exemplo, e será descrita em pormenor. No vídeo apoiando a construção e inserção permanente de eletrodos de fio multicanal flexíveis é demonstrada. Amplificação diferencial Pairwise dos canais de eléctrodos de fio de micro reduz drasticamente o ruído e verifica-se que a fonte do sinal está intimamente relacionada com a posição da ponta do eléctrodo. A flexibilidade mecânica dos eletrodos de fio utilizados permite gravações estáveis invasivas a longo prazo ao longo de muitas horas, até dias, o que é uma clara vantagem em relação às técnicas extra e intracelulares em convencionais de gravação in vivo.
As abelhas, assim como a maioria dos outros insetos dependem fortemente de olfato. Entre outros que utilizam sinais olfativos para a orientação, o acasalamento, a comunicação com membros da mesma espécie, e forrageamento. Seu sistema olfativo bem elaborado contribui para um rico repertório de comportamentos de aprendizagem relacionados a estímulos odor florais. Esses comportamentos podem ser facilmente estudados sob condições controladas de laboratório (para revisão ver 3-5). Seus cérebros "mini" (cf. 6) com seus números relativamente pequenos de neurônios faz a abelha um organismo modelo adequado para o estudo de codificação olfativo e aprender durante o monitoramento da atividade neural.
O sistema olfactivo em insectos, bem como em mamíferos mostra organização semelhante a uma grande extensão (para revisão ver 7,8). Em abelhas cerca de 80.000 neurônios receptores situados em 9 sensilas ao longo da antenas 10,11 traduzir o estímulo odor ambiental em um neursinal onal. Axónios de neurónios dos receptores olfactivos inervam o lobo antenal (AL), o qual tem uma organização glomerular comparável ao bolbo olfactivo de vertebrados. A AL compreende cerca de 164 glomérulos interligados uns com os outros por cerca de 4.000 interneurônios locais (LN) (para revisão ver 12). Especialmente no abelha foi recentemente mostrado que LNs fornecer conectividade laterais parciais e que possuem propriedades diferentes subpopulações de codificação olfactivos elementares e configural 13,14. A AL foi mostrado para ser subdividida em um lóbulo ventral e uma hemi dorsal dando origem ao medial eo trato lobo antenal lateral (m-e l-ALT; anteriormente denominada m-e l-APT para laterais protocerebrais lobo antenal-medial e trato 15-17). Aqui uma nova terminologia trato introduzido por um esforço recente para uma nomenclatura unificada do inseto cérebro será utilizado 18. Ambos ALTs (l-e m-ALT) combinam ou 410 (l-ALT) ou 510 (m-ALT) proje uniglomerularneurônios ction (PN), respectivamente 15,16,19. PNs de ambas as áreas foram recentemente mostrado aos odores de código em paralelo 2 (para revisão ver 17,20), e ambos os trechos sinapticamente formar conexões divergentes com células de Kenyon (KC), o corpo de cogumelos (MB) principais neurônios. Cada MB contém cerca de 172.000 KCs 21-23. Os MBs são conhecidos por estar envolvido na integração de estímulo, aprendizado e formação da memória. As dendrites axo de KCs formar o pedúnculo (haste do cogumelo), que tem duas regiões de produção principais: a vertica ou alfa-lobo ea horizontal ou beta-lobo 22,24. A saída do MB converge para apenas cerca de 400 neurónios extrínsecos (PT) 24. Ens responsável pelo processamento de informação olfativa inervam principalmente o aspecto ventral do lobo verticais 22. Recentemente, tem sido mostrado que a ENS gravados nesta área codificar a associação odor recompensa 25.
Temporal comoaspectos dentro do sistema olfactivo dos insectos, bem como vertebrados tornaram-se um aspecto importante e significativo como um princípio de codificação potencial 26-29. Para ser capaz de gravar simultaneamente vários neurônios a partir de diferentes locais em alta resolução temporal, estabelecemos as técnicas de gravação da unidade de multi duplas utilizando eletrodos de fio multicanais personalizadas introduzidas para diferentes regiões-alvo no sistema olfativo da abelha. Essa abordagem nos permite analisar e comparar o processamento temporal no sistema olfativo das abelhas no nível dos neurônios individuais e populações de neurônios ou entre caminhos olfativos paralelas, o caminho olfativo dupla 2 ou entre diferentes neuropils seguintes 1. Recentemente, com uma abordagem experimental semelhante no sistema olfativo gafanhoto 30 utilizando uma configuração diferente de eletrodos foram capazes de analisar mecanismo de codificação espaço-temporal para o reconhecimento de odores fundo invariante 31. Thnós, as gravações duplas estabelecidos permitem a coleta de informações espaciais sobre perfis de actividade neuronal simultâneos.
Em comparação com a amostragem espacial mais amplo por meio de imagem de cálcio este método permite a gravação de apenas dois pontos. No entanto, a vantagem em comparação com técnicas de imagem de cálcio é a alta precisão temporal de ação possíveis gravações, as quais não podem ser fornecidos por qualquer imagem CCD convencional ou aquisição de imagens 2-fótons. Os eletrodos extracelulares aqui descritas são permanentemente implantados e fixa em relação ao cérebro e cápsula cabeça evitando eletrodo deriva. Isto é uma clara vantagem em comparação com a utilização de eléctrodos intracelulares afiadas. Outra vantagem em relação a gravações intracelulares e de imagem de cálcio é o tempo de observação neural estendida variando de muitas horas até dias. Este é um pré-requisito importante para investigar correlatos neurais da formação de aprendizagem e memória. Os benefícios adicionais de váriosgravações de unidade são ainda descritas na seção de discussão.
Nesta visão metodológica do processo de eletrodos de fio de design personalizado fabricação será mostrado, adaptado de 32,33 e adequado para gravações de unidades múltiplas a longo prazo no cérebro das abelhas. Além disso, um exemplo de como estes tipos de eléctrodos são permanentemente implantado em dois sítios diferentes de gravação no sistema olfactivo abelha para gravar, simultaneamente, a l-e o m-ALT durante longos períodos de tempo, para permitir que muitos protocolos de estimulação é mostrado 2. Para a verificação das posições de gravação é fornecido um exemplo e um protocolo para a coloração e gravação pós visualização dos locais de gravação.
Este artigo demonstra a produção e uso de design personalizado canal micro fio-eletrodos múltiplos. Os eletrodos descritos são adequados para gravação tanto única unidade e da população, que é especialmente útil para medidas de latência e outras propriedades de resposta temporal de diferentes neurônios e diferentes neuropils dentro de um único espécime (para detalhes, ver 1,2,25). Além disso, temos mostrado como implementar permanentemente os eletrodos micro fio para permitir gravações estáveis a longo prazo no comportamento das abelhas que duram horas até dias.
Gravações multi-unit extracelulares se tornou uma ferramenta favorável para atingir alta resolução temporal combinado com informação espacial. No nosso caso, estes são ou extensões neuronais paralelos 2 ou dois neuropils diferentes 1. Vários neurônios podem ser gravados e analisados ao nível do neurônio único em paralelo e em alta resolução temporal. Registro Multi-unitmentos foram aplicados pela primeira vez em 38 de mamíferos e mais tarde também em insetos 39-41. Um progresso substancial foi alcançado com o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas de gravação extracelulares multicanal 42,43. Este, por exemplo, inclui o desenvolvimento de novos eletrodos 44 ou novos pico de classificação e agrupamento algoritmos 45. Métodos gerais de técnicas extracelulares de gravação multi-unidades estão bem descritas 46-48. Os eletrodos auto construído mostrados neste vídeo também pode ser adaptado adicionando mais microfios por eletrodo ou os micro fios pode ser torcido para ganhar distâncias constantes mensuráveis entre as pontas. Ambos os procedimentos que, no entanto, levar a diminuição da flexibilidade e aumento da espessura do eletrodo.
Em comparação com sondas de silício normalmente usados para gravações extracelular em insetos muito maiores, como o falcão traça, gafanhotos e baratas 40,49 – </sup> 51 micro fio-eletrodos descritos são menores, flexível e pode lidar facilmente com os movimentos potenciais do cérebro e, portanto, pode ser usado de forma confiável em pequenos insetos sociais, como abelhas e formigas que mostram um repertório comportamental muito mais amplo. A maioria das sondas de silicone têm haste afiada como estruturas de corte axônios e tecido neural ao longo de seu canal de inserção, enquanto as micro fios descritos são redondos, flexível e menor e, portanto, são menos prejudiciais para os tecidos circundantes, que é uma clara vantagem se o objetivo é estudar a longo plasticidade prazo de um animal intacto e de se comportar. Outra vantagem de eletrodos micro fio é o seu baixo custo de produção eo fácil manuseio. Em vez de limpar cuidadosamente uma sonda de silicone caro os fios de eletrodos são recém-cortada antes da inserção do cérebro e, portanto, os problemas de falta de congestionamento. Além disso, é possível utilizar mais do que um eléctrodo de fio de micro na mesma preparação, quer inserido em diferentes neuropiles 1 oextensões de r 2 como mostramos aqui. Esta abordagem é especialmente favorável para analisar e comparar aspectos temporais como latências de resposta e interações em diferentes níveis de processamento neural.
Estamos conscientes do fato de que um sinal gravado extracelular não reflete a atividade das células único per se. É sempre um composto de atividade tensão em torno da ponta do eletrodo. Para identificar a origem do sinal da diferença de dois canais de fios de micro vizinhos dentro de um eletrodo é sempre calculado. Assim, a fonte para os sinais de pico usados para extrair atividade única unidade foram sempre muito próximo de um ou outro canal de eletrodos, resultando em formas de onda de pico facilmente distinguíveis. Os sinais de mais longe, tal como a actividade muscular ou actividade de neuropils vizinhos, atingir os dois eléctrodos, ao mesmo tempo evoca formas e amplitudes comparáveis e será descartado por este procedimento. Usando a técnica de casamento de modelos de Spike2,estamos muito confiantes para obter atividade única unidade, o que não é o mesmo, mas muito perto de atividade do neurônio único. No entanto, a emissão de pico de triagem pode ser evitado pelo uso de técnicas de gravação intracelulares.
Gravações de células individuais com tanto eletrodos pontiagudos ou pipetas de patch permitir o conhecimento aprofundado sobre as propriedades fisiológicas de um único neurônio. No entanto, devido ao pequeno tamanho dos neurônios do inseto e suas neurites (por exemplo., Menos de 1 mm para abelhas PNs 52) gravações apenas de curto prazo são gerenciáveis. Além disso, as gravações intracelulares pode ser invasivo e pode prejudicar a célula que é, possivelmente, uma outra razão para as limitações temporais. In vivo gravações intracelulares em insetos raramente durar mais que uma hora. A janela de tempo que foi suficiente para o trabalho pioneiro de Martin Martelo 53 que gravou intracelular a partir de um único neurônio identificado, o ventral não pareado maxilar neurônio # 1 (VUMmx1). Ele poderia ltinta sua atividade diretamente ao caminho da recompensa. Juliane Mauelshagen 54 registrado intracelularmente a atividade de um cogumelo corpo extrínseco neurônio identificado, o pedúnculo neurônio extrínseca # 1 (PE1), durante o condicionamento clássico. O mesmo neurônio estava no foco de Menzel e Manz 55 quando encontraram LTP após a estimulação elétrica de Kenyon Cells. No entanto, Okada e colegas 56 pode usar o padrão spiking intracelularmente bem caracterizado (picos duplos e triplos) para a identificação do PE1 durante gravações extracelulares. Afinal uma combinação de ambos os métodos, as gravações intracelular de neurônios identificados e gravações extracelular a longo prazo pode ser uma ferramenta poderosa para futuras investigações.
No entanto, usando eletrodos afiadas para gravar várias células (unidades), simultaneamente, em diferentes níveis de processamento de mais de muitas horas até dias para analisar as suas relações temporais de resposta e / ou até mesmo mudanças de plástico ié quase impossível.
Com a primeira imagem de cálcio se aproxima na abelha 57,58 utilizando corantes sensíveis ao cálcio da análise de padrões espaciais de respostas odor eram acessíveis 59-62. No entanto, em muitos casos, os corantes sensíveis cálcio tem que ser introduzido no tecido cerebral através de manipulações invasivos que novamente limitam a vida útil do abelha e propriedades intrínsecas das células analisadas. Este problema é superado em outros organismos modelo, como a mosca da fruta através de sensores de cálcio geneticamente introduzidas 63,64. No entanto, em geral, os sensores de cálcio pode introduzir outras limitações que podem actuar como tampões de cálcio que provavelmente influenciam as propriedades temporais de respostas de odor. Gravações intracelulares simultâneos combinados com imagens de cálcio ou de abordagens computacionais pode provar a resolução temporal adequada de imagem processa 65,66. No entanto, a resolução temporal do processo de imagem em si é rather limitada. Sistemas de aquisição ópticos normalmente usam CCD-imagem com uma resolução temporal de 67 Hz 5-20, embora 2-Photon-Imaging pode ser capaz de adquirir as sequências mais rápidas 68. No entanto, o aumento da taxa de amostragem sempre vai junto com uma perda de resolução espacial. Além disso, os corantes sensíveis ao cálcio utilizados na abelha sofrer branqueamento, o que também reduz o tempo de aquisição 69.
Em comparação com outras técnicas de gravação fisiológicas em insetos nossos eletrodos micro-fio multi-canal flexíveis garantir o acesso de longo prazo a única unidade e atividade neuronal população em comportar abelhas.
Nós demonstramos como usar dois desses eletrodos em diferentes estágios de processamento no mesmo animal, o que facilita a análise de aspectos de codificação temporais entre os diferentes locais de gravação. Dependendo do problema de pesquisa eo modelo de inseto o método básico de construção do eletrodo demonstrado aqui é facilmente estendercapaz e / ou pode ser adaptado. Por exemplo, é concebível utilizar mais do que as três fios simples para a produção de eléctrodos de multi-canal. Além disso, o número de locais de gravação pode ser estendido e observando aspectos temporais de mais de duas vias ou neuropils é viável. Nossa esperança é que este método irá inspirar muitos cientistas e contribuirá positivamente para a compreensão do processamento neuronal sofisticado em pequenos cérebros.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |