Enregistrements à long terme extracellulaires simultanée de deux neuropiles différentes du cerveau ou deux voies anatomiques différents ont été établis dans les abeilles. Ces enregistrements permettent l'enquête des aspects temporels de traitement neuronal dans différentes zones du cerveau à l'unique neurone ainsi que sur le plan d'ensemble dans un animal se comporter.
Dans les deux mammifères et les insectes informations neuronale est traitée dans les différents centres d'ordre supérieur et inférieur cerveau. Ces centres sont couplés par convergentes et divergentes connexions anatomiques y compris l'alimentation et le câblage avant de rétroaction. En outre, les informations de la même origine est partiellement envoyé par des voies parallèles pour différentes et parfois dans les mêmes zones du cerveau. Pour comprendre les avantages évolutifs ainsi que les avantages de calcul de ces stratégies de câblage et surtout leurs dépendances temporelles sur l'autre, il est nécessaire d'avoir un accès simultané à neurones individuels de différents secteurs ou neuropiles dans la même préparation à haute résolution temporelle. Ici, nous nous concentrons sur les abeilles en démontrant un accès à long terme extracellulaire unique à enregistrer l'activité de l'unité multiple à deux neuropiles ultérieures 1, le lobe antennaire (AL), la première étape de traitement olfactif et le corps de champignon (MB), un ordre plus élevé centre d'intégration involved dans l'apprentissage et la formation de la mémoire, ou deux voies neuronales parallèles 2 reliant l'AL avec le MB. Ce dernier a été choisi à titre d'exemple et sera décrite dans son intégralité. Dans la vidéo soutenant la construction et de l'insertion permanente d'électrodes de fil de canal multi-flexibles est démontrée. Amplification différentielle par paire des micro-canaux d'électrode de fil permet de réduire considérablement le bruit et vérifie que la source du signal est étroitement liée à la position de la pointe de l'électrode. La flexibilité mécanique des fils-électrodes utilisées permet des enregistrements à long terme envahissantes stables pendant de nombreuses heures à jour, ce qui est un net avantage par rapport aux techniques classiques d'enregistrement in vivo supplémentaires et intracellulaires.
Les abeilles ainsi que la plupart des autres insectes comptent beaucoup sur l'olfaction. Parmi d'autres, ils utilisent des indices olfactifs pour l'orientation, l'accouplement, la communication avec leurs congénères, et la recherche de nourriture. Leur système olfactif bien élaboré contribue à un riche répertoire de comportements d'apprentissage liés à des stimuli d'odeurs florales. Ces comportements peuvent être facilement étudiés dans des conditions contrôlées en laboratoire (pour revue voir 3 – 5). Leurs "mini cerveau" (cf. 6) avec leur nombre relativement restreint de neurones fait l'abeille un organisme modèle bien adapté à l'étude de codage olfactif et l'apprentissage lors de la surveillance de l'activité neuronale.
Le système olfactif des insectes ainsi que chez les mammifères montre organisme analogue dans une large mesure (pour revue, voir 7,8). Dans abeilles environ 80.000 neurones récepteurs situés dans 9 sensilles sur les antennes 10,11 traduisent la relance de l'odeur de l'environnement dans un neursignal de onal. Les axones des neurones récepteurs olfactifs innervent le lobe antennaire (AL), qui a une organisation comparable à glomérulaire du bulbe olfactif des vertébrés. L'AL comprend environ 164 glomérules interconnectés les uns aux autres par environ 4.000 interneurones locaux (LN) (pour revue, voir 12). Surtout chez l'abeille, il a été récemment montré que LN offrent une connectivité latérale inégale et que les différentes sous-populations possèdent des propriétés olfactives de codage élémentaires et configural 13,14. L'AL a été montré pour être subdivisé en un lobe ventral et un hémi dorsale donnant lieu à l'interne et les voies de lobe antennaire latérale (m-et l-ALT; anciennement appelé m-et l-APT pour médial et latéral antennaire lobe protocerebral tracter 15 – 17). Voici une nouvelle terminologie des voies introduite par un effort récent pour une nomenclature unifiée du cerveau de l'insecte sera utilisé 18. Les offres anormalement basses (l et m-ALT) combinent soit 410 (l-ALT) ou 510 (m-ALT) proje uniglomerularneurones ction (PN), respectivement 15,16,19. Unités de raccordement des deux voies ont été récemment démontré que les odeurs de code en parallèle 2 (pour revue, voir 17,20), et deux voies divergentes former des synapses connexions avec des cellules de Kenyon (KC), le corps de champignon (MB) neurones principaux. Chaque Mo contient environ 172 000 KC 21 – 23. Les MB sont connus pour être impliqués dans l'intégration de relance, l'apprentissage et la formation de la mémoire. Les dendrites axo de KCs forment le pédoncule (la tige du champignon), qui a deux principales régions de production: la vertica ou alpha-lobe et l'22,24 horizontale ou bêta-lobe. La sortie de la MB converge à seulement environ 400 neurones extrinsèques (FR) 24. ENS responsable de traitement de l'information olfactive surtout innervent la face ventrale du lobe vertical 22. Récemment, il a été montré que les EN enregistrées à cette zone codent pour l'association odeur de récompense 25.
Temporelle commeaspects du système olfactif des insectes ainsi que les vertébrés sont devenus un aspect important et significatif en tant que principe potentiel de codage 26-29. Pour être en mesure d'enregistrer simultanément plusieurs neurones de différents sites à haute résolution temporelle, nous avons établi doubles techniques d'enregistrement de l'unité multi-électrodes à l'aide de fil multicanal personnalisés introduites à différentes régions cibles dans le système olfactif de l'abeille. Cette approche nous permet d'analyser et de comparer le traitement temporel dans le système olfactif des abeilles au niveau des neurones et des populations de neurones, soit entre voies olfactives parallèles, la double voie olfactive 2 ou entre les différents neuropils ultérieures 1 simple. Récemment, avec une approche expérimentale similaire dans le système olfactif acridienne 30 en utilisant une configuration différente des électrodes étaient en mesure d'analyser le mécanisme de codage spatio-temporel pour la reconnaissance des odeurs fond invariant 31. Thnous, les deux enregistrements établis permettent de recueillir de l'information spatiale sur les profils d'activité neuronales simultanées.
Par rapport à l'échantillonnage spatial plus large obtenu à partir de l'imagerie calcique cette méthode permet l'enregistrement de deux points seulement. Cependant, l'avantage par rapport aux techniques d'imagerie de calcium est la précision de la mesure temporelle des enregistrements potentiels qui ne peuvent pas être fournis soit par l'imagerie CCD classique ou acquisition d'imagerie à 2 photons. Les électrodes décrites ici extracellulaires sont implantés de manière permanente et fixe par rapport au cerveau et de la capsule de la tête en évitant la dérive de l'électrode. Il s'agit d'un net avantage par rapport à l'utilisation d'électrodes intracellulaires pointus. Un autre avantage par rapport aux enregistrements intracellulaires et l'imagerie du calcium est le temps d'observation de neurones étendue allant de plusieurs heures à jour. Il s'agit d'une condition préalable importante pour étudier les corrélats neuronaux de l'apprentissage et de formation de la mémoire. Les autres avantages de plusieursenregistrements unitaires sont en outre décrits dans la section discussion.
Dans cet aperçu méthodologique de la procédure de fabrication de fils-électrodes de conception personnalisée sera affiché, adapté de 32,33 et adapté pour les enregistrements à logements multiples à long terme dans le cerveau des abeilles. En outre, par exemple, la façon dont ces types d'électrodes sont implantées de façon permanente dans deux sites d'enregistrement différents dans le système olfactif d'abeilles pour enregistrer simultanément le l-et le m-ALT sur de longues périodes de temps pour permettre à de nombreux protocoles de stimulation est disponible en deux. Pour la vérification des positions d'enregistrement, par exemple, et le protocole pour la coloration et l'enregistrement de poste visualisation des sites d'enregistrement est fourni.
Cet article démontre la production et l'utilisation de la voie micro fils-électrodes multiples conçus sur mesure. Les électrodes décrites sont adaptés pour l'enregistrement des deux seule unité et l'activité de la population qui est particulièrement utile pour les mesures de latence et d'autres propriétés de réponse temporelle de différents neurones et différentes neuropils dans un seul échantillon (pour plus de détails voir 1,2,25). En outre, nous avons montré comment mettre en œuvre de façon permanente les fils-électrodes micro pour permettre des enregistrements stables à long terme en se comportant abeilles qui durent pendant des heures jusqu'à jours.
Enregistrements multi-unitaires extracellulaires sont devenus un outil favorable pour atteindre une haute résolution temporelle combinée avec l'information spatiale. Dans notre cas, ce sont des voies neuronales parallèles 2 ou deux neuropils différentes 1. Neurones multiples peuvent être enregistrés et analysés au niveau du neurone unique en parallèle et à haute résolution temporelle. Dossier Multi-unitréunions ont été appliquées en premier chez les mammifères 38 et plus tard aussi chez les insectes 39-41. Progrès considérables ont été accomplis dans le développement et l'amélioration des techniques d'enregistrement multi-canaux extracellulaires 42,43. C'est, par exemple, comprend le développement de nouvelles électrodes 44 ou de nouvelles pointes de tri et de regroupement des algorithmes 45. Méthodes générales de techniques d'enregistrement multi-unitaires extracellulaires sont bien décrites 46-48. Les électrodes auto construit présentés dans cette vidéo peuvent en outre être adaptées en ajoutant plus de microfils par électrode ou les micro fils peuvent être tordus pour gagner des distances constantes mesurables entre les pointes. Les deux procédures seraient, toutefois, conduire à la diminution de la flexibilité et augmentation de l'épaisseur de l'électrode.
Par rapport à des sondes de silicium couramment utilisés pour les enregistrements extracellulaires chez les insectes beaucoup plus comme la mite de faucon, criquets et blattes 40,49 – </sup> 51 micro-électrodes métalliques décrits sont plus petites, flexibles et peuvent facilement faire face à des mouvements du cerveau potentiels et, par conséquent, peuvent être utilisés de manière fiable dans les petits insectes sociaux comme les abeilles et les fourmis qui montrent un répertoire comportemental beaucoup plus large. La plupart des sondes en silicone ont tige pointue comme structures de coupe axones et les tissus nerveux le long de leur chaîne d'insertion, tandis que les fils micro décrites sont ronds, souples et plus petites et sont donc moins nocifs pour le tissu environnant qui est un avantage évident si l'objectif est d'étudier à long plasticité terme dans un animal intact et de se comporter. Un autre avantage de micro électrodes à fil est leur production à faible coût et la facilité de manipulation. Au lieu de nettoyer soigneusement une sonde de silicone cher les fils d'électrode sont fraîchement coupés avant l'insertion du cerveau et, par conséquent, les problèmes de manque de congestion. En outre, il est possible d'utiliser plus d'un micro fil-électrode dans la même préparation, soit inséré dans différentes neuropiles 1 osecteurs de r 2 que nous montrent ici. Cette approche est particulièrement favorable pour analyser et comparer les aspects temporels comme les latences et les interactions réponse à différents niveaux de traitement neural.
Nous sommes conscients du fait qu'un signal enregistré extracellulaire ne reflète pas l'activité de la cellule unique en soi. Il est toujours d'un composé de l'activité de tension autour de la pointe de l'électrode. Pour localiser la source du signal de la différence de deux micro-canaux voisins de fil à l'intérieur une électrode est toujours calculée. Ainsi, la source pour les signaux de pointes utilisées pour extraire l'activité d'une seule unité était toujours très proche de l'un ou l'autre canal d'électrode résultant en des formes d'onde de pic faciles à distinguer. Signaux de plus loin, comme l'activité musculaire ou l'activité de neuropils voisins, atteignent les deux électrodes en même temps évoquant des formes et des amplitudes comparables et seront rejetées par cette procédure. En utilisant la technique modèle correspondant de Spike2,nous sommes très confiants d'obtenir une activité d'une seule unité, ce qui n'est pas la même, mais très proche de l'activité des neurones unique. Cependant, la question de la pointe tri pourrait être évité en utilisant des techniques d'enregistrement intracellulaire.
Enregistrements de cellules uniques soit avec des électrodes pointus ou pipettes de patch permettent une connaissance approfondie sur les propriétés physiologiques d'un seul neurone. Toutefois, en raison de la petite taille des neurones d'insectes et de leurs axones (p. ex., Moins de 1 um pour abeilles unités de raccordement 52) Enregistrements seulement à court terme sont gérables. En outre, les enregistrements intracellulaires pourraient être invasive et pourraient nuire à la cellule qui est peut-être une autre raison pour les limitations temporelles. In vivo des enregistrements intracellulaires chez les insectes survivent rarement une heure. Une fenêtre de temps qui était suffisant pour le travail de pionnier de Martin Marteau 53 qui a enregistré intracellulaire à partir d'un seul neurone identifié, la ventrale non apparié maxilar neurone n ° 1 (VUMmx1). Il ne pouvait lson activité encre directement à la voie de la récompense. Juliane Mauelshagen 54 inscrit intracellulaire de l'activité d'un champignon corps extrinsèque neurone identifié, le pédicule neurone extrinsèque # 1 (PE1) pendant le conditionnement classique. Le même neurone était dans le centre de Menzel et Manz 55 quand ils ont trouvé LTP après stimulation électrique des cellules de Kenyon. Cependant, Okada et ses collègues 56 peuvent utiliser le modèle de dopage intracellulaire bien caractérisée (des pointes doubles et triples) pour l'identification de la PE1 pendant les enregistrements extracellulaires. Après tout une combinaison des deux méthodes, des enregistrements intracellulaires de neurones identifiés et des enregistrements extracellulaires à long terme pourraient être un outil puissant pour les enquêtes futures.
Cependant, en utilisant des électrodes pointus pour enregistrer plusieurs cellules (unités) simultanément à différents niveaux de traitement plus longues heures jusqu'à jours pour analyser leurs relations temporelles de réponse et / ou même des changements plastique is presque impossible.
Avec la première imagerie calcique approches de l'abeille 57,58 utilisant des colorants sensibles au calcium de l'analyse de la répartition spatiale des réponses d'odeurs étaient accessibles 59-62. Cependant, dans de nombreux cas, les colorants sensibles de calcium doivent être introduites dans le tissu de cerveau par des manipulations envahissantes qui limitent encore la durée de vie de l'abeille et les propriétés intrinsèques des cellules analysées. Ce problème est résolu dans d'autres organismes modèles comme la drosophile en utilisant des capteurs de calcium génétiquement introduites 63,64. Cependant, en général, des capteurs de calcium peuvent introduire d'autres limitations, car ils peuvent agir comme des tampons de calcium susceptibles d'influer sur les propriétés temporelles de réponses d'odeurs. Enregistrements intracellulaires simultanés combinés avec l'imagerie de calcium ou approches informatiques peuvent prouver la bonne résolution temporelle de l'imagerie traite 65,66. Cependant, la résolution temporelle du processus de formation d'image lui-même est rather limitée. Systèmes d'acquisition optiques utilisent généralement CCD-imagerie avec une résolution temporelle de 5-20 Hz 67, bien que 2-Photon Imaging pourrait être en mesure d'acquérir des séquences rapides 68. Cependant, le taux d'échantillonnage de plus en plus va toujours avec une perte de résolution spatiale. En outre, les colorants sensibles au calcium utilisés dans l'abeille à un blanchiment, ce qui réduit également le temps d'acquisition 69.
Comparé à d'autres techniques d'enregistrement physiologiques chez les insectes nos électrodes souples micro-fil multi-canal d'assurer l'accès de longue date à l'unité unique et de la population de l'activité neuronale en comporter abeilles.
Nous avons démontré l'utilisation de deux de ces électrodes à différents étages de traitement dans le même animal, ce qui facilite l'analyse des aspects de codage temporelles entre les différents sites d'enregistrement. En fonction de la problématique de recherche et le modèle d'insecte la méthode de base de la construction de l'électrode démontré ici est facilement s'étendentmesure et / ou qui peut être adapté. Par exemple, il est concevable d'utiliser plus de trois fils isolés pour produire des électrodes à canaux multiples. En outre, le nombre de sites d'enregistrement peut être étendu et en observant les aspects temporels de plus de deux voies ou neuropils est réalisable. Notre espoir est que cette méthode va inspirer de nombreux scientifiques et contribuera positivement à la compréhension du traitement neuronal sophistiqué petits cerveaux.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |