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Neuroscience

व्यवहार मधुमक्खियों में दो Neuronal चरणों प्रसंस्करण पर एक साथ लंबे समय तक रिकॉर्डिंग

doi: 10.3791/51750 Published: July 21, 2014

Summary

दो अलग मस्तिष्क neuropiles या दो विभिन्न संरचनात्मक इलाकों से एक साथ बाह्य दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग मधुमक्खियों में स्थापित किए गए थे. ये रिकॉर्डिंग अलग मस्तिष्क क्षेत्रों न्यूरॉन में और साथ ही एक बर्ताव जानवर में कलाकारों की टुकड़ी के स्तर पर भर neuronal प्रसंस्करण की अस्थायी पहलुओं की जांच की अनुमति.

Abstract

स्तनधारियों और कीड़ों दोनों में neuronal जानकारी विभिन्न उच्च और निम्न क्रम मस्तिष्क केन्द्रों में कार्रवाई की है. इन केन्द्रों अभिसरण और आगे फ़ीड और प्रतिक्रिया तारों सहित अपसारी संरचनात्मक कनेक्शन के माध्यम से मिलकर कर रहे हैं. इसके अलावा, एक ही मूल के जानकारी आंशिक रूप से अलग और कभी कभी एक ही मस्तिष्क क्षेत्रों में करने के लिए समानांतर रास्ते के माध्यम से भेजा जाता है. इन तारों रणनीतियों और एक दूसरे पर विशेष रूप से उनके अस्थायी निर्भरता की विकासवादी लाभ के साथ ही कम्प्यूटेशनल फायदे को समझते हैं, यह उच्च अस्थायी समाधान पर ही तैयारी में विभिन्न इलाकों या neuropiles की एकल न्यूरॉन्स के लिए एक साथ उपयोग करना आवश्यक है. यहाँ हम दो बाद neuropiles 1, Antennal लोब (एएल), पहली घ्राण प्रसंस्करण मंच और मशरूम शरीर (एमबी), एक उच्च आदेश एकीकरण केन्द्र invo में बहु इकाई गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए एक अनूठा कोशिकी दीर्घकालिक पहुंच प्रदर्शन करके मधुमक्खियों पर ध्यान केंद्रितसीखने और स्मृति गठन, या MB के साथ अल जोड़ने दो समानांतर neuronal इलाकों 2 में lved. बाद के एक उदाहरण के रूप में चुना गया था और पूर्ण में वर्णित किया जाएगा. समर्थन वीडियो में निर्माण और लचीला बहु चैनल तार इलेक्ट्रोड की स्थायी प्रविष्टि प्रदर्शन किया है. सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड चैनलों के जोड़ो में अंतर प्रवर्धन काफी शोर कम कर देता है और संकेत के स्रोत बारीकी इलेक्ट्रोड टिप की स्थिति से संबंधित है कि पुष्टि करता है. इस्तेमाल किया तार इलेक्ट्रोड के यांत्रिक लचीलापन देता स्थिर आक्रामक दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग कई घंटे से अधिक पारंपरिक में अतिरिक्त और intracellular विवो रिकॉर्डिंग तकनीकों की तुलना में एक स्पष्ट लाभ है, जो दिन, अप करने के लिए.

Introduction

मधुमक्खियों के साथ ही सबसे अन्य कीड़ों भारी महक पर भरोसा करते हैं. दूसरों के बीच उन्हें अपने व्यवहार, संभोग, conspecifics साथ संचार, और foraging के लिए घ्राण संकेतों का उपयोग. उनकी अच्छी तरह से सविस्तार घ्राण प्रणाली पुष्प गंध उत्तेजनाओं से संबंधित सीखने व्यवहार का एक समृद्ध प्रदर्शनों की सूची के लिए योगदान देता है. (- 5 समीक्षा 3 देखने के लिए) इन कार्यों को आसानी से नियंत्रित प्रयोगशाला परिस्थितियों का अध्ययन किया जा सकता है. न्यूरॉन्स की उनकी अपेक्षाकृत कम संख्या के साथ अपने "मिनी दिमाग" (cp. 6) मधुप घ्राण कोडिंग का अध्ययन और तंत्रिका गतिविधि की निगरानी के दौरान सीखने के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल जीव बनाता है.

कीड़ों में और साथ ही स्तनधारियों में घ्राण प्रणाली (समीक्षा के लिए 7,8 देखें) काफी हद तक अनुरूप संगठन को दर्शाता है. मधुमक्खियों में एंटीना 10,11 साथ sensillae में स्थित लगभग 80,000 रिसेप्टर न्यूरॉन्स 9 एक neur में पर्यावरण गंध प्रोत्साहन अनुवादonal संकेत. घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स से axons हड्डीवाला घ्राण बल्ब के लिए तुलनीय एक glomerular संगठन है जो Antennal लोब (एएल), अंदर आना. अल बारे में 4,000 स्थानीय interneurons (एल एन) द्वारा एक दूसरे के साथ जुड़े के बारे में 164 glomeruli शामिल (समीक्षा के लिए 12 देखें). खासकर मधुप में यह LNS बद पार्श्व कनेक्टिविटी प्रदान और विभिन्न subpopulations मौलिक और configural घ्राण कोडिंग गुण 13,14 के अधिकारी उस कि हाल ही में दिखाया गया है. अल औसत दर्जे का है और पार्श्व Antennal लोब पथ (एम और एल एएलटी को जन्म देने के एक उदर और एक पृष्ठीय Hemi पालि में विभाजित किया जा दिखाया गया था, पूर्व में एम और औसत दर्जे का है और पार्श्व Antennal लोब protocerebral के लिए एल एपीटी करार दिया ) 15-17 पथ. यहाँ कीट मस्तिष्क का एक एकीकृत नामकरण के लिए हाल ही में एक प्रयास के द्वारा शुरू की एक नई पथ शब्दावली 18 का उपयोग किया जाएगा. दोनों alts (एल और एम एल टी) 410 (एल एल टी) या 510 (एम एल टी) uniglomerular proje या तो गठबंधनction न्यूरॉन्स (पीएन) क्रमश: 15,16,19. दोनों इलाकों के पीएन हाल ही में (समीक्षा के लिए 17,20 देखें) समानांतर 2 में कोड odors को दिखाया गया है, और दोनों इलाकों synaptically Kenyon कोशिकाओं (सी), मशरूम शरीर (एमबी) प्रिंसिपल न्यूरॉन्स के साथ मुक़्तलिफ़ कनेक्शन फार्म. 23 - प्रत्येक एमबी के बारे में 172,000 KCS 21 होता है. एमबीएस प्रोत्साहन एकीकरण, शिक्षा, और स्मृति गठन में शामिल होने के लिए जाना जाता है. वर्टिका या अल्फा पालि और क्षैतिज या बीटा पालि 22,24: KCS की AXO डेन्ड्राइट दो मुख्य उत्पादन क्षेत्रों है जो डंठल (मशरूम की स्टेम), के रूप में. एमबी का उत्पादन केवल 400 के बारे में बाह्य न्यूरॉन्स (एन) से 24 converges. घ्राण जानकारी के प्रसंस्करण के लिए जिम्मेदार ज्यादातर खड़ी पालि 22 के उदर पहलू अंदर आना सत्ता. हाल ही में, यह इस क्षेत्र में दर्ज की सत्ता गंध इनाम एसोसिएशन 25 सांकेतिक शब्दों में दिखाया गया है कि.

के रूप में लौकिक29 - कीड़े के साथ ही रीढ़ की घ्राण प्रणाली के भीतर pects एक संभावित कोडन सिद्धांत 26 के रूप में एक महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण पहलू बन गए हैं. एक साथ उच्च अस्थायी समाधान पर विभिन्न साइटों से कई न्यूरॉन्स रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के लिए, हम मधुमक्खी की घ्राण प्रणाली में अलग लक्ष्य क्षेत्रों के लिए पेश अनुकूलित बहु चैनल तार इलेक्ट्रोड का उपयोग डबल बहु इकाई रिकॉर्डिंग तकनीकों की स्थापना की. यह दृष्टिकोण एकल न्यूरॉन्स और या तो समानांतर घ्राण रास्ते, दोहरी घ्राण मार्ग 2 या विभिन्न बाद neuropils 1 के बीच बीच में न्यूरॉन्स की आबादी के स्तर पर मधुप घ्राण प्रणाली में अस्थायी प्रसंस्करण का विश्लेषण और तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है. हाल ही में इलेक्ट्रोड की एक अलग विन्यास का उपयोग कर टिड्डी घ्राण प्रणाली 30 में एक ऐसी ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ पृष्ठभूमि अपरिवर्तनीय गंध मान्यता 31 के लिए spatiotemporal कोडिंग तंत्र का विश्लेषण करने में सक्षम थे. गुहमें, की स्थापना की दोहरी रिकॉर्डिंग एक साथ neuronal गतिविधि प्रोफाइल के बारे में स्थानिक जानकारी एकत्र कर सकें.

कैल्शियम इमेजिंग से प्राप्त व्यापक स्थानिक नमूने की तुलना में इस विधि केवल दो स्थानों से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है. हालांकि, कैल्शियम इमेजिंग तकनीकों की तुलना में लाभ पारंपरिक सीसीडी इमेजिंग या 2 फोटॉन इमेजिंग अधिग्रहण या तो द्वारा प्रदान नहीं किया जा सकता जो कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग के उच्च अस्थायी सटीक है. यहाँ वर्णित कोशिकी इलेक्ट्रोड स्थायी रूप से प्रत्यारोपित किया और इलेक्ट्रोड बहाव से बचने के मस्तिष्क और सिर कैप्सूल के सापेक्ष तय कर रहे हैं. इस तेज intracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग की तुलना में एक स्पष्ट लाभ है. Intracellular रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग की तुलना में एक अन्य लाभ यह है कि कई घंटे से दिन को लेकर विस्तारित तंत्रिका अवलोकन समय है. यह सीखने और स्मृति गठन के तंत्रिका संबद्ध की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. बहु का अतिरिक्त लाभइकाई रिकॉर्डिंग आगे चर्चा खंड में रेखांकित कर रहे हैं.

इस पद्धति अवलोकन में कस्टम डिजाइन तार इलेक्ट्रोड के विनिर्माण प्रक्रिया, दिखाया जाएगा 32,33 से अनुकूलित और शहद की मक्खी के मस्तिष्क में लंबी अवधि के बहु इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूल. इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोड के इन प्रकार के स्थायी रूप से एक साथ रिकॉर्ड करने के लिए शहद की मक्खी घ्राण प्रणाली के भीतर दो अलग रिकॉर्डिंग स्थलों पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं कि कैसे एक उदाहरण के एल और कई उत्तेजना प्रोटोकॉल अनुमति देने के लिए समय की लंबी अवधि में एम एल टी 2 में दिखाया गया है. रिकॉर्डिंग पदों के सत्यापन के लिए रिकॉर्डिंग साइटों के धुंधला हो जाना और बाद रिकॉर्डिंग दृश्य के लिए एक उदाहरण है और प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है.

Protocol

1. इलेक्ट्रोड बिल्डिंग (चित्रा 1)

  1. वाणिज्यिक मल्टी चैनल एम्पलीफायर प्रणाली 1,2,25 के इलेक्ट्रोड अंतरफलक बोर्ड फिट बैठता है कि एक इलेक्ट्रोड अनुकूलक का उत्पादन.
    1. एक 18 पिन कनेक्टर आधार से चिपके एक छोटे Plexiglas प्लेट का प्रयोग करें.
    2. Plexiglas प्लेट पर दबाव डाला 3 अलग सोल्डर लग्स को अछूता तार के 3 छोटे टुकड़े (चित्रा 1 ए 1-A3) के साथ बेस से कनेक्ट करें.
    3. एक गिलास केशिका आसानी से स्थानांतरित कर सकते हैं और एक पेंच द्वारा जगह में आयोजित किया जिसमें Plexiglas थाली में एक नाली (चित्रा 1 बी 1) डालें.
    4. एक minutien पिन का उपयोग 5 मिमी के बारे में गिलास केशिका बढ़ाएँ.
    5. स्थिरीकरण और समर्थन की गारंटी के लिए minutien पिन और गिलास केशिका साथ सूक्ष्म इलेक्ट्रोड तारों देते हैं.
  2. मल्टी चैनल सूक्ष्म तार उत्पादन (Ryuichy ओकादा 32,33 से अपनाया)
    1. स्पैन 3 सूक्ष्म तार (polyurethane लेपित तांबे के तार, 15वे एक दूसरे के बगल रखा जाता है कि एक तरह से (चित्रा 1 बी 2) में माइक्रोन व्यास).
    2. (इलेक्ट्रोड टिप) (चित्रा 1 बी 3) उन्हें एक साथ गोंद करने के लिए आंशिक रूप से तारों के साथ कम पिघलने दंत मोम की एक पतली फिल्म (50 डिग्री सेल्सियस) प्रसार करने के लिए एक 12 वी सोल्डर सुई का प्रयोग करें. इस खंड इलेक्ट्रोड एडाप्टर के साथ सूक्ष्म तारों को जोड़ने के लिए बाद में इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में unglued कुछ सेंटीमीटर (इलेक्ट्रोड अंत) को छोड़ दें.
  3. इलेक्ट्रोड एडाप्टर के लिए मल्टी चैनल सूक्ष्म तार कनेक्ट
    1. धारक से गिलास केशिका निकालें और इलेक्ट्रोड टिप करने minutien पिन के साथ देते हैं. सूक्ष्म इलेक्ट्रोड (Figure1 बी 3) करने की स्थिति समानांतर में लाना.
    2. कम पिघलने दंत मोम का उपयोग minutien पिन करने के लिए इलेक्ट्रोड टिप गोंद और (छोटे तीर 1 बी 3 चित्रा) minutien पिन से और इलेक्ट्रोड अंत में 2-3 सेमी फैला हुआ, नोक पर सूक्ष्म इलेक्ट्रोड काटा.
    3. केशिका SL स्लिपightly वापस इलेक्ट्रोड अनुकूलक में. (चित्रा 1 बी 4) यह तय करने के लिए पेंच का प्रयोग करें.
    4. इन्सुलेशन के पिघलने (चित्रा 1 बी 4) सुनिश्चित करने के लिए चारों ओर 360 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक टांका बंदूक का इस्तेमाल सोल्डर लग्स के लिए तीन तारों की बिखरी मिलाप. टांका लगाने के बाद, पर्याप्त बिजली के संपर्क (~ 300 kOhm) सुनिश्चित करते हैं कि.
    5. Headstage के इलेक्ट्रोड अंतरफलक बोर्ड को इलेक्ट्रोड (गुरु) में से एक माउंट और एक अलग एडाप्टर पर अन्य मल्टी चैनल इलेक्ट्रोड (दास) को ठीक. मास्टर इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 सी 1) को गुलाम के चैनलों से कनेक्ट करें. इसके अतिरिक्त, मास्टर इलेक्ट्रोड आधार करने के लिए संदर्भ के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशियों इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 सी 2) मिलाप.

2. बी तैयारी (चित्रा 2)

इन वर्णित प्रयोगों में, एक दब्बू जानवर है जो मधुप (एपीआई mellifera),और इसलिए उपयोग के लिए विशिष्ट नैतिक परमिट, प्रयोग किया जाता है की आवश्यकता नहीं है.

  1. दूसरों 34,35 द्वारा दिखाया के रूप में सुबह में छत्ता द्वार पर मधुप foragers (ए mellifera) पकड़ो.
  2. स्थिरीकरण (5 से 10 मिनट) तक कुचल बर्फ पर मधुमक्खियों ठंडा होगा और सिर अवगत कराया है कि एक तरह से (चित्रा 2 ए) में एक मानक Plexiglas धारक या धातु ट्यूब में एक तय कर लो. न्यूनतम करने के लिए सिर आंदोलनों कम पिघलने दंत मोम (~ 50 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करें और यौगिक आंखों और गर्दन के आधार के आसपास धारक को ध्यान से सिर को ठीक.
  3. कशाभिका छू बिना सिर कैप्सूल (चित्रा 2 बी) पर एंटीना की scapi fixate को कम पिघलने मोम का प्रयोग करें. एंटीना की कशाभिका आगे बताया जाना चाहिए. मधुमक्खी स्वतंत्र रूप से अपनी सूंड स्थानांतरित कर सकते हैं सुनिश्चित करें.
  4. एक undisturbed देखें और सिर के ऊपर तक पहुंच सुनिश्चित करने के लिए सिर कैप्सूल दाढ़ी.
  5. Saturati तक एक 30% sucrose के समाधान के साथ मधुमक्खी फ़ीडमस्तिष्क के ऊतकों और जानवर का अच्छा व्यवहार्यता (चित्रा 2 सी) के लिए पर्याप्त moistening सुनिश्चित करने के लिए पर.
  6. खड़ी मिश्रित आंखों की सीमाओं पर और क्षैतिज स्पर्शतंतु अड्डों से ऊपर के साथ ही ocelli नीचे सावधान चीरों बनाओ और छल्ली का ढीला टुकड़ा (चित्रा 2 डी) को हटा दें.
  7. ध्यान hypopharyngeal ग्रंथियों अलग सेट और एक स्पष्ट दृष्टिकोण और सम्मिलन (आंकड़े 2 ई, 2 एफ) इलेक्ट्रोड के लिए पहले मस्तिष्क के लिए उपयोग सुनिश्चित करने के लिए ट्रेकिआ हटा दें.

3. इलेक्ट्रोड निवेशन

चित्रा 2 में सचित्र उदाहरण मामले में, एक इलेक्ट्रोड एल एल टी, एम एल टी 2 पर लक्ष्य कर एक दूसरे पर निशाना तैनात है. विशेष स्थलों का प्रयोग, अन्य लक्ष्य क्षेत्रों उदाहरण AL और एमबी उत्पादन क्षेत्रों 1 के लिए, के रूप में अच्छी तरह से संभव हो रहे हैं.

  1. (ब्याज के क्षेत्र में micromanipulators का उपयोग कर इलेक्ट्रोड स्थित करें 3 ए). एम एएलटी जगह AL और मध्यवर्ती एमबी की खड़ी पालि से बीच में इलेक्ट्रोड को लक्षित करने के लिए. Mediolateral एएलटी पीएन की शाखाओं में बंटी बिंदु से ऊपर जा रहा प्रविष्टि साइट सुनिश्चित करें. लगभग 180 माइक्रोन (चित्रा 2 ई) की गहराई के साथ दिमाग में इलेक्ट्रोड फैलाना. इलेक्ट्रोड खड़ी पालि और अल के बीच के पार्श्व पक्ष के बीच एक काल्पनिक रेखा के बीच में पार्श्व protocerebrum (एलएच) नीचे एल एएलटी पी.एन. रिकॉर्डिंग जगह के लिए. के बारे में 300 माइक्रोन (चित्रा 2 ई) की गहराई के साथ इलेक्ट्रोड डालने
  2. छल्ली में एक छोटे से कट के माध्यम से ipsilateral यौगिक आंख में संदर्भ (चांदी के तार, के बारे में 25 माइक्रोन व्यास) डालें. पार्श्व ocelli नीचे मांसपेशियों प्रक्षेपण क्षेत्र में एक और चांदी के तार डालें. नोट: यदि आवश्यक हो मधुमक्खी की सीख व्यवहार मैं शामिल है जो मांसपेशियों M17, रिकॉर्डिंग से उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ नजर रखी जा सकतीn मधुमक्खी 36 की सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) के रूप में 25 में वर्णित है.
  3. मजबूत, मस्तिष्क और सिर कैप्सूल के भीतर इलेक्ट्रोड लंगर बाहर सुखाने से मस्तिष्क को रोकने जाएगा जो दो घटक सिलिकॉन (चित्रा 2H), के साथ मस्तिष्क के ऊपर पूरे स्थान को कवर करने के लिए. नोट: रिकॉर्डिंग दिनों के लिए घंटे के लिए पिछले कर सकते हैं, और मधुमक्खियों उदाहरण के लिए एक शास्त्रीय कंडीशनिंग प्रक्रिया (चित्रा 2H) के दौरान दर्ज किया या अलग odors की एक बड़ी पैनल के साथ प्रेरित कर सकते हैं.

4. डाटा अधिग्रहण और Preprocessing

  1. निम्न आवश्यकताओं को पूरा करती है कि उचित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें: न्यूनतम 25 kHz के नमूना दर; एनालॉग 1,25 या इलेक्ट्रोड चैनलों के बीच डिजिटल 2 पार भेदभाव; बैंड कील घटनाओं को निकालने के लिए 8,000 हर्ट्ज के लिए 300 हर्ट्ज से फिल्टर गुजरती हैं.
  2. Templ उदाहरण के लिए, एक इकाई गतिविधि को निकालने के लिए उपलब्ध स्पाइक छँटाई सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंSpike2 सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) में शामिल के रूप में मिलान तकनीक खा लिया.
  3. आगे के विश्लेषण के लिए (चित्रा 4) या प्रधानाचार्य घटक विश्लेषण (पीसीए) के लिए जनसंख्या वैक्टर गणना करने के लिए (चित्रा 5) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गंध प्रतिक्रियाओं औसतन एक इकाई की गणना करने के लिए निकाला इकाइयों के समय टिकटों का उपयोग करें. आगे एक इकाई और जनसंख्या प्रतिक्रिया विलंबता का विश्लेषण करने के लिए हाल के प्रकाशनों 1,2,25 तुलना करें.

5. सापेक्ष इलेक्ट्रोड स्थिति के दृश्य (चित्रा 4)

  1. एलेक्सा 568 या एलेक्सा पूर्व रिकॉर्डिंग प्रयोगों के लिए 0.5 एम पोटेशियम क्लोराइड समाधान में भंग कर रहा है जो 488 hydrazide 5% hydrazide 5% या तो की एक समाधान में इलेक्ट्रोड सुझावों डुबकी.
  2. मधुमक्खी घंटी समाधान के साथ मस्तिष्क कुल्ला, प्रयोगों के बाद सावधानी से इलेक्ट्रोड और कवर सिलिकॉन निकालें, ग्रंथियों और ट्रेकिआ हटाने और tetramethylrhodami के छोटे क्रिस्टल डालनेn dextran या anterogradely alts लेबल करने के लिए अल में 1.0 एम पोटेशियम एसीटेट में हल एक 5% समाधान डालें. अंधेरे में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.
  3. डाई हाथ में लिया और एक और 30-45 मिनट के लिए मधुमक्खी घंटी समाधान के साथ तीन बार मस्तिष्क धोने से पहले, उनके axonal इलाकों (30-45 मिनट) (चित्रा -4 ए) के साथ प्रक्षेपण न्यूरॉन्स द्वारा जाया जा करने की अनुमति दें.
  4. स्थिरीकरण जब तक बर्फ पर मधुमक्खी ठंडा होगा और ध्यान से सिर कैप्सूल से मस्तिष्क को हटा दें. 4% formaldehyde युक्त एक 0.1 एम पीबीएस समाधान में यह rinsing द्वारा मस्तिष्क fixate और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इसे रखना
  5. 0.1 एम पीबीएस (10 मिनट प्रत्येक) में मस्तिष्क दो बार धोने से पहले कम से कम 12 घंटे तक प्रतीक्षा करें.
  6. 0.2% में 20 मिनट के लिए मस्तिष्क 3x धो ट्राइटन एक आरोही शराब श्रृंखला (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% इथेनॉल, 20 मिनट में यह dehydrating से पहले 0.1 एम पीबीएस में पतला एक्स 100 हर कदम).
  7. एक खुर्दबीन स्लाइड और एस पर Methylsalicylate में निर्जलित मस्तिष्क शामिल करेंएक कवर स्लाइड के साथ यह eal.
  8. एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का प्रयोग करें और एक सुरीले यौगिक योजना Apochromat उद्देश्य (10X 0.4 एनए विसर्जन) का उपयोग कर हर 2-5 माइक्रोन ऑप्टिकल वर्गों के रूप में मस्तिष्क स्कैन. 568 एनएम tetramethylrhodamin dextran के लिए तरंगदैर्ध्य और इलेक्ट्रोड स्थिति के लिए 488 एनएम के तरंग दैर्ध्य का उपयोग ऊतक उत्तेजित.
  9. पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर (जैसे. AMIRA या फिजी) (चित्रा 4) के साथ 3 डी में छवि के ढेर से सना हुआ मस्तिष्क संरचना और इलेक्ट्रोड रास्तों पुनर्निर्माण किया.

Representative Results

"वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत मधुमक्खियों के भीतर दो अलग अलग चरणों प्रसंस्करण पर एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है और साथ ही जैसे के माध्यम से सीखने और स्मृति की अंतर्निहित तंत्र का परीक्षण करने की अनुमति देता है., संयमित मधुमक्खियों के भीतर सेफ प्रति." इस neuronal प्रसंस्करण की अस्थायी पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए एक शर्त है. विभिन्न वैज्ञानिक दृष्टिकोण मधुमक्खी की घ्राण प्रणाली के neuronal नेटवर्क जानने के लिए विधि आसानी से अनुकूल है. उदाहरण के लिए इस विधि मधुप की दोहरी घ्राण मार्ग, एल और एम एएलटी पीएन (चित्रा 5) के भीतर पीएन के अस्थायी प्रसंस्करण का विश्लेषण करने के लिए (मैं) किया जाता है. चित्रा 5A में एक साथ एम एल टी की एक पी.एन. के साथ दर्ज एक एल एएलटी पी.एन. का एक उदाहरण दस परीक्षण औसत के रूप में दिया जाता है और रंग कोडित गर्मी साजिश के रूप में पांच अलग गंध सांद्रता के संबंध में उनकी प्रतिक्रिया ताकत और विलंबता दिखाता है. 11 एल और 13 मा के साथ सात मधुमक्खियों के एक औसत मेंएलटी पीएन (आंकड़े 5 ब, 5C) प्रतिक्रिया ताकत के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया विलंबता दोनों, एक निश्चित सीमा तक, odorant एकाग्रता को दर्शाता है कि दिखाता है. बढ़ती odorant एकाग्रता के साथ उनकी प्रतिक्रिया विलंबता (आंकड़े 5 ब, 5C) गिरावट आई है, जिससे इस उदाहरण में पीएन उनकी प्रतिक्रिया शक्ति में वृद्धि. इस परिणाम बल्कि सीमित है और विश्लेषण odorant के लिए ही मान्य है, लेकिन अभी भी अल 37 की हाल ही में कम्प्यूटेशनल मॉडल के साथ संगत है. मधुमक्खी के अल में गंध एकाग्रता कोडिंग गैर रेखीय संगणना underlies या अन्य कोडन गुण अभी भी भविष्य में विश्लेषण किए जाने की जरूरत underlies है या नहीं. इसके अलावा विधि (द्वितीय) दो बाद के प्रसंस्करण चरणों, अल और MB-निर्गम (चित्रा 6) में जनसंख्या गतिविधि में अस्थायी पहलुओं की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) गंध अभिकलन लंबे समय तक और पी.एन. स्तर पर पूरे गंध प्रस्तुति खत्म कर रहा है जो दिखाता है, जबकि एन मेंसेट पर और बंद ही गंध आबादी गतिविधि (चित्रा 6) में प्रतिनिधित्व कर रहे थे. पी.एन. गतिविधि अभी भी (cp. मूवी 1) विकसित कर रहा है, जब इस प्रकार एन आबादी एक समय बिंदु पर पहले से ही उनके अधिक से अधिक गतिविधि पर पहुंच गया.

चित्रा 1
... चित्रा 1 तीन चैनल सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड विनिर्माण A1) के तीन तारों का अंत पदों में 11, 13 और 16 ए 2) चार सोल्डर लग्स एक Plexiglas प्लास्टिक बेस प्लेट पर खराब कर रहे हैं एक आईसी पिन कनेक्टर को soldered हैं; एक minutien पिन तो प्लास्टिक की प्लेट. A3) प्लास्टिक प्लेट एक आईसी पिन कनेक्टर और प्रत्येक तार के मुक्त अंत के शीर्ष पर चिपके से जुड़ा हुआ है जो एक गिलास केशिका की नोक में डाला जाता है शीर्ष सोल्डर में से एक के लिए soldered है लग्स. <ठीक तांबे के तारों के साथ इलेक्ट्रोड धारक से लैस करने के लिए मजबूत> बी 1), केशिका धारक के आधार तो डिवाइस aligning बनाया एक कस्टम में तय हो गई है) एक बार फिर. बी 2 बाहर रखा जाना है. . तीन तांबे सूक्ष्म तार बी 3) समानांतर सूक्ष्म तार दंत मोम के साथ साथ चिपका रहे हैं और केशिका जगह (लंबी तीर) में वापस रख दिया जाता है प्रत्येक के अंत में नाली के साथ गठबंधन किया और चिपकने वाला टेप के साथ तय कर रहे हैं; चिपके सूक्ष्म तार तो तांबे के तारों की तीन बिखरी इस प्रकार के साथ बिजली के संपर्क में लाने के लिए तीन शीर्ष सोल्डर लग्स के लिए soldered हैं दंत मोम और इसके समाप्त होता है (कम तीर) काट रहे हैं. बी 4) के साथ केशिका से जुड़े होते हैं आईसी पिन कनेक्टर. सी 1) दो पूरी तरह से इकट्ठे इलेक्ट्रोड, इस उद्देश्य के लिए एक एकल headstage. सी 2) के साथ प्रयोग के एक इलेक्ट्रोड (बाएं, दास) के पिन अधिकार (दूसरे इलेक्ट्रोड को पृथक की तारों के माध्यम से जुड़े हुए हैं के लिए एक दूसरे से जोड़ा जा सकता है मस्तूल) एर, जो सिर मंच से जुड़ा है; headstage जुड़े इलेक्ट्रोड भी एक मांसपेशी (M17) और संदर्भ इलेक्ट्रोड (रेफरी) से इनपुट एकत्र कर सकते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. तैयारी और मधुमक्खी मस्तिष्क में स्थायी इलेक्ट्रोड प्रविष्टि. ए) एक मधुमक्खी बर्फ पर स्थिरीकरण के बाद एक Plexiglas धारक में डाला जाता है. कशाभिका (सीए) और Scapus (अनुसूचित जाति) के साथ एंटीना सिर) बी. संकेत कर रहे हैं और एंटीना दंत मोम का उपयोग कर तय कर रहे हैं. सी) सिर कैप्सूल मुंडा है और मधुमक्खी) चीनी पानी. डी के साथ खिलाया जाता है सिर कैप्सूल खोला है. ई) मस्तिष्क के ऊपर से ग्रंथियों और ट्रेकिआ हटाने के बाद, अलग neuropiles और प्रमुख स्थलों को आसानी से पहचाना जा सकता है. alts के trajectories साथ साथ संकेत कर रहे हैंइलेक्ट्रोड डाला जाता है जहां एक निशान. (MB: मशरूम शरीर, अल: Antennal लोब, राजभाषा: ऑप्टिकल पालि, α: अल्फा पालि या खड़ी पालि, alt: Antennal लोब पथ, E1: M-एएलटी रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड प्रविष्टि ओर, E2: एल एल टी के लिए इलेक्ट्रोड प्रविष्टि पक्ष रिकॉर्डिंग). एफ) संदर्भ (रेफरी) और मांसपेशियों में इलेक्ट्रोड (M17) करने के बाद छल्ली या यौगिक आँख. जी) तार इलेक्ट्रोड उपयुक्त साइटों. एच में मस्तिष्क में डाला जाता है) में छोटे छेद के माध्यम से सिर कैप्सूल में डाला जाता है दो घटक सिलिकॉन का उपयोग जगह में इलेक्ट्रोड फिक्सिंग, मधुमक्खी अभी भी प्रति से पता चलता है और वातानुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए., चीनी पानी का उपयोग करते हुए).

चित्रा 3
दो तंत्रिका इलाकों और एकल यूनिट निष्कर्षण (कील छँटाई). एक पर चित्रा 3. कोशिकी रिकॉर्डिंग बी) एक एकाग्रता में पानी के घोल में शहद की एक 500 मिसे गंध उत्तेजना को दोनों इलाकों पर उत्तेजक प्रतिक्रियाओं दिखा एल और एम एएलटी पीएन (हरे और बैंगनी रंग के निशान) से एक साथ रिकॉर्डिंग 1:100 का कम से 33 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक साजिश रची लाइन ए बार में इलेक्ट्रोड सोल्डर लग्स से रंग कोडित लेबल के रूप में विभेदित चैनलों का प्रतिनिधित्व करता है: एकल कार्रवाई क्षमता क्रमबद्ध और रंग कोडित रहे हैं 50 μV सी) कील छँटाई प्रक्रियाओं के बाद.. छांटी गई इकाइयों की ओवरले waveforms के जुदाई को दिखाता है. डी) स्पाईक अंतराल हिस्टोग्राम पर्याप्त कील छँटाई के सबूत के रूप में हल इकाइयों की जुदाई गुणवत्ता को इंगित करता है. इकाई की दुर्दम्य अवधि के भीतर कोई कील नहीं है ध्यान दें. ई) दो दृश्य (E1, E2) सेएक दूसरे को करने के लिए हल इकाइयों की दूरी को इंगित करता है जो प्रमुख घटक विश्लेषण के साथ हल इकाई की एक 3 डी क्लस्टरिंग. सर्किलों अंतरिक्ष में एसडी जैसा दिखता है और) रंग कोडित इकाइयों एक पथ रिकॉर्डिंग से तीन चैनलों के एक बढ़ाई में दिखाई कार्रवाई क्षमता को दर्शाती प्रमुख घटक अंतरिक्ष एफ में समूहों की एक महत्वपूर्ण भेदभाव को इंगित करता है जो 2.5 गुना महालनोबिस दूरी से संकेत मिलता है. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 4
चित्रा 4. पोस्ट रिकॉर्डिंग दृश्य और रिकॉर्डिंग स्थिति की 3 डी पुनर्निर्माण. एक Antero की अधिकतम तीव्रता संरेखण के साथ Z-axes साथ ऑर्थो-स्लाइस की एक) प्रोजेक्शन देखेंऔर एमबी और एलएच को अल से पेश uniglomerular प्रक्षेपण न्यूरॉन्स की प्रतिगामी backfilling. intracellular ट्रेसर Microruby (tetramethylrhodamin dextran) रिकॉर्डिंग प्रयोगों के बाद अल में डाला गया था. एलेक्सा साथ दो इलेक्ट्रोड की एक धुंधला से अधिकतम तीव्रता संरेखण के साथ Z-axes साथ ऑर्थो स्लाइस की अल प्रमाण उचित पी.एन. धुंधला हो जाना. बी) प्रोजेक्शन देखें अंदर सना हुआ glomeruli एम एल टी (E1, तीर के लिए इलेक्ट्रोड नियुक्ति का संकेत 488 hydrazide ) और एल एएलटी (E2, तीर). ट्रेसर एलेक्सा Hydrazide 488 इलेक्ट्रोड आसपास के ऊतकों को उत्प्रवासित और इलेक्ट्रोड प्रविष्टि साइट दाग. अल में प्रमुख धुंधला हो जाना एक साथ मधुप घ्राण प्रणाली (के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन के साथ एक सतही मूर्ति दाग लक्ष्य कोशिकाओं (पीएन) के. सी) 3D पुनर्निर्माण और ए, बी (दाएं से इलेक्ट्रोड प्रविष्टि साइट) है, नोट छोड़ा एल और एम एएलटी trajectories के संकेत के साथ कंधे). केवल uniglomer, नोटular पी.एन. इलाकों दिखाए जाते हैं. ए.एन.: स्पर्शतंतु तंत्रिका, अल: स्पर्शतंतु पालि, एलएच: पार्श्व सींग, एमबी: मशरूम शरीर, E1, E2: इलेक्ट्रोड प्रविष्टि साइटों, M-alt: औसत दर्जे का Antennal लोब पथ, L-alt: पार्श्व Antennal लोब पथ, C: दुम, आर: विजय - स्तम्भ, एम: औसत दर्जे का, एल. पार्श्व इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
गंध एकाग्रता कोडिंग की चित्रा 5. उदाहरण दोहरी घ्राण मार्ग के भीतर. ए) हीट भूखंडों एक एकल एल एल टी (हरी की प्रतिक्रिया को वर्णन) और एकल एम एल टी पी.एन. (बैंगनी) odorant के जवाब में एक व्यक्ति मधुप से एक साथ हासिल कर ली (: 10 -6 1:100 1 से) गंध सांद्रता बढ़ाने के hexanal. प्रत्येक पंक्ति दस परीक्षण stim के एक औसत हैआबादी. फायरिंग दर 7 रिकॉर्ड मधुमक्खियों से 11 एल और 13 एम एल टी पीएन की. बी) जनसंख्या प्रतिक्रिया विलंबता घटाया सहज गतिविधि के संबंध में फायरिंग दर है जो रिश्तेदार तीव्रता परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है. प्रत्येक मधुमक्खी में दोनों इलाकों से पीएन एक साथ दर्ज किए गए. जनसंख्या प्रतिक्रिया विलंबता दोनों इलाकों से पीएन में गंध एकाग्रता बढ़ाने के साथ एक कम विलंबता से पता चलता है. 99 मिसे पर एंटीना पर गंध प्रतिक्रिया शुरुआत electroantennograms के माध्यम से दर्ज की गई थी और पी.एन. प्रतिक्रिया सुप्तावस्था से घटाया जाता है. प्रतिक्रियाओं विलंबता माप के लिए बहुत कमजोर हैं और इसलिए, प्रतिक्रिया ताकत बढ़ती जा रही है बढ़ती गंध एकाग्रता के साथ बी के रूप में ही पीएन से दर फायरिंग. सी) जनसंख्या प्रतिक्रिया निकाल दिए गए थे सबसे कम सांद्रता में ध्यान दें. एल एएलटी एक मजबूत प्रतिक्रिया ताकत को दर्शाता है. बी, सी मतलब और एसडी दिया जाता है.

चित्रा 6 चित्रा 6. मधुप की घ्राण मार्ग के साथ दो बाद के प्रसंस्करण चरणों में जनसंख्या गतिविधि की तुलना. डाटा 1-HEXANOL और 2 octanone. ए) के साथ प्रेरित किया गया जो 20 पशुओं में दर्ज किए गए प्रत्येक पंक्ति झूठी रंग कोडित एक प्रक्षेपण का मतलब फायरिंग दर का प्रतिनिधित्व करता है न्यूरॉन (पीएन) 1-HEXANOL की 10 गंध पुनरावृत्ति भर की गणना. गंध प्रस्तुति 0 समय पर शुरू होता है और तीन सेकंड. बी चली) एक के रूप में ही पता चलता है) लेकिन मशरूम शरीर बाह्य न्यूरॉन्स (एन) के लिए. एक में दिखाया मैट्रिक्स) 1-HEXANOL साथ गंध उत्तेजना के दौरान एक पी.एन. आबादी वेक्टर के रूप में देखा जा सकता है. हम 2 octanone साथ गंध उत्तेजना के दौरान जनसंख्या वेक्टर की इसी तरह की गणना की और अस्थायी आयाम. सी रखने के एक प्रमुख घटक विश्लेषण में दोनों वैक्टर (पीसीए) का इस्तेमाल किया) पहले तीन प्रमुख घटक (PC1, 2 और 3) थेAntennal लोब उत्पादन में पी.एन. पहनावा गतिविधि में गंध जुदाई वर्णन करने के लिए एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची है. गंध शुरुआत से पहले समय काले रंग में चिह्नित है. 1-HEXANOL साथ उत्तेजना के तीन सेकंड के दौरान गतिविधि नीले रंग में दिखाया गया है. 2 octanol साथ उत्तेजना के दौरान गतिविधि लाल रंग में दिखाया गया है. इसके अलावा, हम 1-HEXANOL (हल्के नीले) और (गुलाबी) 2 octanonen के सेट की गंध के बाद गतिविधि का 1.5 सेकंड (पद) दिखा. पी.एन. पहनावा स्तर पर, बहुत अलग trajectories evoking दोनों odors को एक "नियत बिन्दु" जो outlasts पूरे गंध उत्तेजना अवधि में बसने ध्यान दें. गंध ऑफसेट के बाद ही trajectories गंध उत्तेजना के बिना वापस आधारभूत गतिविधि के लिए कदम. डी) एक ही विश्लेषण मशरूम शरीर उत्पादन में गतिविधि का प्रतिनिधित्व एन पहनावा स्तर पर किया गया था. पी.एन. गतिविधि की तुलना में odors को एक कम अलग प्रक्षेपवक्र आह्वान. इसके अलावा एक "नियत बिन्दु" नमूदार नहीं है. शुरू में गंध प्रेरित trajectories inteगंध अभी भी मौजूद है, हालांकि आधारभूत गतिविधि के साथ rmingle. ऑफसेट केवल गंध एक अतिरिक्त प्रक्षेपवक्र पैदा की.

. मूवी 1 समय एक पी.एन. आबादी वेक्टर (बाएं) और एक एन आबादी वेक्टर के प्रमुख घटक विश्लेषण के बाद एक गंध प्रेरित प्रक्षेपवक्र के मूल्यांकन का संकल्प लिया. (. सही, सी.पी. आंकड़ा 6) ऊपरी भागों पहले तीन प्रमुख घटक (PC1, शामिल 2 और 3) एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची है. कम पैनल समय के साथ PC1, 2 और 3 के मूल्यांकन के उदाहरण देकर स्पष्ट करना. गंध उत्तेजना ग्रे पट्टी से चिह्नित है. सभी पैनलों सिंक्रनाइज़ थे. एन आबादी गतिविधि पी.एन. आबादी गतिविधि से पहले थोड़ा शुरू होता है ध्यान दें कि, contraintuitive हो रहा है, लेकिन जो एक घटना कनेक्टिविटी और पहले 1 चर्चा की है जो इसमें शामिल परतों के गुणों से समझाया जा सकता है.

Discussion

इस अनुच्छेद के उत्पादन और कस्टम डिजाइन मल्टी चैनल सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड के उपयोग को दर्शाता है. वर्णित इलेक्ट्रोड एक इकाई और (विवरण 1,2,25 देखने के लिए) एक भी नमूना भीतर विलंबता माप और विभिन्न न्यूरॉन्स और विभिन्न neuropils के अन्य अस्थायी प्रतिक्रिया गुणों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो आबादी गतिविधि दोनों की रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा हम स्थायी रूप से दिनों के लिए घंटे के लिए पिछले है कि मधुमक्खियों बर्ताव में स्थिर दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग अनुमति देने के लिए सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड को लागू करने के लिए कैसे पता चला है.

कोशिकी बहु - इकाई रिकॉर्डिंग स्थानिक जानकारी के साथ संयुक्त उच्च अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए एक अनुकूल उपकरण बन गया. हमारे मामले में, इन समानांतर neuronal इलाकों 2 या दो अलग neuropils 1 या तो कर रहे हैं. कई न्यूरॉन्स समानांतर में न्यूरॉन के स्तर पर और उच्च अस्थायी समाधान पर दर्ज की गई और विश्लेषण किया जा सकता है. बहु इकाई रिकॉर्ड41 - बैठकों पहले कीड़े 39 में भी बाद में स्तनधारियों 38 में आवेदन किया है और कर रहे थे. काफी प्रगति कोशिकी मल्टी चैनल रिकॉर्डिंग तकनीकों 42,43 के विकास और सुधार के साथ हासिल की थी. यह, उदाहरण के लिए, नए इलेक्ट्रोड 44 या उपन्यास कील छँटाई और क्लस्टरिंग एल्गोरिदम 45 का विकास भी शामिल है. 48 - बाह्य बहु - इकाई रिकॉर्डिंग तकनीकों के सामान्य तरीकों अच्छी तरह से 46 से वर्णित हैं. इस वीडियो में दिखाया गया है स्वयं बनाया इलेक्ट्रोड इसके अतिरिक्त अधिक इलेक्ट्रोड प्रति microwires या सूक्ष्म तार सुझावों के बीच measureable लगातार दूरी हासिल करने के लिए मरोड़ा जा सकता है जोड़कर अनुकूलित किया जा सकता. दोनों प्रक्रियाओं, हालांकि, लचीलापन कम है और इलेक्ट्रोड की मोटाई में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व करेंगे.

सामान्यतः हॉक कीट, टिड्डी और तिलचट्टा 40,49 तरह बहुत बड़े कीड़े में कोशिकी रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया सिलिकॉन जांच की तुलना में - 51 वर्णित सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड, लचीला छोटे होते हैं और संभावित मस्तिष्क आंदोलनों के साथ आसानी से सामना कर सकते हैं, और इस प्रकार मज़बूती से एक बहुत व्यापक व्यवहार प्रदर्शनों की सूची चलता है कि मधुमक्खियों और चींटियों की तरह छोटे सामाजिक कीड़ों में इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्णित सूक्ष्म तार, दौर लचीला और छोटे होते हैं और लक्ष्य को लंबे समय तक अध्ययन करने के लिए है, तो एक स्पष्ट लाभ है जो आसपास के ऊतकों को इसलिए कम हानिकारक हैं, जबकि अधिकांश सिलिकॉन जांच, उनके प्रविष्टि चैनल के साथ axons और तंत्रिका ऊतक काटने संरचनाओं की तरह तेज टांग है एक अक्षुण्ण और बर्ताव जानवर में अवधि के plasticity. सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड का एक अन्य लाभ यह है कि उनकी कम लागत उत्पादन और आसान से निपटने है. इसके बजाय ध्यान से एक महंगी सिलिकॉन जांच की सफाई के इलेक्ट्रोड तारों हौसले, इसलिए, भीड़ की कमी की समस्याओं से पहले मस्तिष्क प्रविष्टि करने की कटौती और कर रहे हैं. इसके अलावा यह या तो अलग neuropiles 1 ओ में डाला ही तैयारी में एक से अधिक सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड का उपयोग करना संभव हैआर इलाकों 2 हम यहाँ दिखाने के रूप में. यह दृष्टिकोण अलग तंत्रिका प्रसंस्करण स्तरों पर प्रतिक्रिया सुप्तावस्था और बातचीत की तरह अस्थायी पहलुओं का विश्लेषण और तुलना करने के लिए विशेष रूप से अनुकूल है.

हम एक बाह्य दर्ज संकेत से प्रति एकल कक्ष गतिविधि प्रतिबिंबित नहीं करता कि इस तथ्य से वाकिफ हैं. यह हमेशा इलेक्ट्रोड टिप के आसपास वोल्टेज गतिविधि का एक यौगिक है. एक इलेक्ट्रोड के भीतर दो पड़ोसी सूक्ष्म तार चैनलों का अंतर हमेशा गणना संकेत के स्रोत तुच्छ. इस प्रकार एकल यूनिट गतिविधि निकालने के लिए किया स्पाइक संकेतों के लिए स्रोत हमेशा एक या एक से आसानी से अलग पहचाना कील waveforms में जिसके परिणामस्वरूप अन्य इलेक्ट्रोड चैनल या तो बहुत करीब थे. दूर दूर से सिग्नल, पड़ोसी neuropils की मांसपेशी गतिविधि या गतिविधि की तरह, तुलनीय आकार और आयाम evoking एक ही समय में दोनों इलेक्ट्रोड तक पहुँचने और इस प्रक्रिया से खारिज कर दिया जाएगा. Spike2 के टेम्पलेट मिलान तकनीक का उपयोग करना,हम ही नहीं है जो एक इकाई गतिविधि, प्राप्त करने के लिए बहुत भरोसा है, लेकिन एक न्यूरॉन गतिविधि के बहुत करीब हैं. हालांकि, स्पाइक छँटाई के मुद्दे intracellular रिकॉर्डिंग तकनीकों का उपयोग करके बचा जा सकता है.

तेज इलेक्ट्रोड या पैच pipettes किसी के साथ एकल कक्ष रिकॉर्डिंग एक न्यूरॉन के शारीरिक गुणों के बारे में गहराई से ज्ञान देते हैं. हालांकि, छोटे कीट न्यूरॉन्स के आकार और उनके neurites (मधुप पीएन 52 के लिए जैसे., कम से कम 1 माइक्रोन) को केवल अल्पावधि रिकॉर्डिंग प्रबंध कर रहे हैं. इसके अलावा, अंतर सेलुलर रिकॉर्डिंग आक्रामक हो सकता है और संभवतः लौकिक सीमाओं के लिए एक और कारण है जो सेल को नुकसान पहुँचा सकता है. कीड़ों में vivo intracellular रिकॉर्डिंग शायद ही कभी एक घंटे खत्म. एक ही पहचान न्यूरॉन, उदर unpaired maxilar न्यूरॉन # 1 (VUMmx1) से intracellular दर्ज की गई, जो मार्टिन हैमर 53 की अग्रणी काम के लिए पर्याप्त था, जो एक समय खिड़की. उन्होंने एल सकासीधे इनाम मार्ग को स्याही अपनी गतिविधि. जुलियन Mauelshagen 54 intracellularly एक पहचान मशरूम शरीर बाह्य न्यूरॉन गतिविधि पंजीकृत, शास्त्रीय कंडीशनिंग के दौरान pedunculus बाह्य न्यूरॉन # 1 (PE1). वे Kenyon प्रकोष्ठों की बिजली की उत्तेजना के बाद एलटीपी पाया जब एक ही न्यूरॉन मेंजेल और Manz 55 के ध्यान में था. हालांकि, ओकादा और उनके सहयोगियों ने 56 कोशिकी रिकॉर्डिंग के दौरान PE1 की पहचान के लिए intracellularly अच्छी तरह से विशेषता spiking पैटर्न (डबल और ट्रिपल spikes) इस्तेमाल कर सकते हैं. दोनों तरीकों के सभी एक संयोजन के बाद पहचान की न्यूरॉन्स और बाह्य दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग से intracellular रिकॉर्डिंग भविष्य जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया जा सकता है.

हालांकि, उनके अस्थायी प्रतिक्रिया रिश्ते और / या प्लास्टिक परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए दिनों के लिए कई घंटे से अधिक विभिन्न प्रसंस्करण स्तरों पर एक साथ कई कोशिकाओं (यूनिट) दर्ज करने के लिए तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग मैंलगभग असंभव है.

62 - पहली कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों का उपयोग मधुप 57,58 में दृष्टिकोण के साथ गंध प्रतिक्रियाओं के स्थानिक पैटर्न के विश्लेषण के 59 सुलभ थे. हालांकि, कई मामलों में कैल्शियम संवेदनशील रंगों फिर मधुमक्खी के जीवन काल और विश्लेषण कोशिकाओं के आंतरिक गुणों को सीमित कि आक्रामक जोड़तोड़ के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए पेश किया जाना है. यह समस्या आनुवंशिक रूप से पेश कैल्शियम सेंसर 63,64 का उपयोग fruitfly जैसे अन्य मॉडल जीवों में दूर है. वे संभावना गंध प्रतिक्रियाओं के अस्थायी गुणों को प्रभावित करने वाले कैल्शियम buffers के रूप में कार्य कर सकते हैं लेकिन, जैसा कि सामान्य रूप में, कैल्शियम सेंसर अन्य सीमाओं को पेश हो सकता है. कैल्शियम इमेजिंग या कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण के साथ संयुक्त एक साथ intracellular रिकॉर्डिंग इमेजिंग की उचित अस्थायी समाधान 65,66 प्रक्रियाओं साबित हो सकता है. हालांकि, इमेजिंग प्रक्रिया खुद का अस्थायी समाधान अधिक तत्पर हैआर सीमित. 2 फोटॉन इमेजिंग तेजी दृश्यों 68 प्राप्त करने में सक्षम हो सकता है, हालांकि ऑप्टिकल अधिग्रहण प्रणाली आमतौर पर, 5-20 हर्ट्ज 67 की एक अस्थायी समाधान के साथ सीसीडी इमेजिंग का उपयोग करें. हालांकि, बढ़ती नमूना दर हमेशा स्थानिक संकल्प में एक हानि के साथ साथ चला जाता है. इसके अलावा मधुप में इस्तेमाल कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों भी अधिग्रहण के समय 69 कम कर देता है जो विरंजन, गुज़रना पड़ता है.

कीड़ों में अन्य शारीरिक रिकॉर्डिंग तकनीक की तुलना में हमारे लचीला मल्टी चैनल सूक्ष्म तार इलेक्ट्रोड एक इकाई और मधुमक्खियों बर्ताव में जनसंख्या neuronal गतिविधि के लिए लंबे समय का उपयोग किया जाता है.

हम अलग रिकॉर्डिंग साइटों के बीच अस्थायी कोडिंग पहलुओं के विश्लेषण की सुविधा है, जो एक ही पशु, में विभिन्न प्रसंस्करण चरणों में इन इलेक्ट्रोड से दो का इस्तेमाल करने के लिए कैसे प्रदर्शन किया. अनुसंधान समस्या और यहां प्रदर्शन किया इलेक्ट्रोड निर्माण के बुनियादी विधि कीट मॉडल पर निर्भर आसानी से विस्तार कर रहा हैसक्षम और / या अनुकूलित किया जा सकता. उदाहरण के लिए यह मल्टी चैनल इलेक्ट्रोड का उत्पादन तीन एकल तारों से अधिक उपयोग करने के लिए बोधगम्य है. इसके अलावा, रिकॉर्डिंग साइटों की संख्या बढ़ा दी है और दो से अधिक इलाकों या neuropils के अस्थायी पहलुओं को देख संभव है किया जा सकता है. हमें उम्मीद है कि इस विधि के कई वैज्ञानिकों को प्रेरित करेगा और छोटे दिमाग में परिष्कृत neuronal प्रसंस्करण की समझ के लिए सकारात्मक योगदान होगा.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Fluka 76235
Odors Sigma Aldrich 
PBS pH 7.2
4% Formaldehyde ThermoScientific 28908 Methanol free
Triton X BioChemica A1388
Methylsalicylate Roth 4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) Invitrogen D7162 keep dark
Alexa 488 hydrazide Invitrogen A-10436 keep dark
Alexa 568 hydrazide Invitrogen A-10437 keep dark
Bee Ringer Solution see Brill et al.2
Polyurethane-coated copper wire Elektrisola 15 µm diameter & P155 insulation
Dental Wax  Densply Detrey 64103015S1 moderate melting point
Dental Wax Flexaponal  124-202-00 low melting Wax
KWIK SIl WPI 03L
18 Pin Socket Conrad Electronic 189634-62
Hot melting glue Conrad Electronic 827673
Soldering needle Conrad Electronics 830283 12 V
Soldering terminal lug  Conrad Electronic 531901
Glaselectrodes WPI 1B100F-3
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 V2A 0.2 x 12 mm
Switchable headstage Tucer Davis Technologies SH16
Headstage connection module NPI INT-03M
Amplifier Module NPI PDA-2F
Data Acquisition boards National Instruments NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software National Instruments Lab View 8.2 custom design
Spike-Sorting  CED  Spike 2 v7.11
Matlab Mathworks R2008B
Micromanipulator Leitz manual
AG-wires WPI AGT05100
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP2 AOBS
AMIRA Mercury Computer Systems  2/5/2000

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References

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व्यवहार मधुमक्खियों में दो Neuronal चरणों प्रसंस्करण पर एक साथ लंबे समय तक रिकॉर्डिंग
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Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).More

Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).

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