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Neuroscience

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

doi: 10.3791/51750 Published: July 21, 2014

Summary

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

Abstract

포유 동물과 곤충 모두에서 신경 세포의 정보는 다른 더 낮은 순서 뇌 센터에서 처리됩니다. 이 센터는 수렴 및 피드 포워드와 피드백 배선을 포함하여 분기 해부학 적 연결을 통해 연결되어있다. 또한, 같은 기원의 정보는 부분적으로 다른 때로는 같은 뇌 영역에 평행 경로를 통해 전송됩니다. 이러한 배선 전략과 서로에 대한, 특히 자신의 시간 종속성의 진화 혜택뿐만 아니라 전산 장점을 이해하기 위해서는 높은 시간 해상도에서 같은 준비에 다른 책자 또는 neuropiles의 단일 신경 세포에 대한 동시 접근이 필요하다. 여기에서 우리는 두 개의 연속 neuropiles 1, 더듬이 로브 (AL), 제 후각 처리 단계와 버섯 몸 (MB), 고차 통합 센터 invo에 멀티 유닛 활동을 기록하기 위해 고유의 세포 장기 접근을 보여줌으로써 꿀벌에 집중학습 및 기억 형성 또는 MB와 AL 연결이 병렬의 연결이 책자에 lved. 후자의 예로서 선택하고, 완전하게 설명 될 것이다. 지원 비디오에서 건설 및 유연한 멀티 채널 와이어 전극의 영구 삽입을 보여줍니다. 마이크로 와이어 전극 채널의 인접 쌍 차동 증폭 비약적 노이즈를 감소시키고 신호의 소스가 밀접 전극 팁의 위치와 관련되어 있음을 확인한다. 사용 와이어 전극의 기계적 유연성을 허용 안정적인 침략 장기 녹음 많은 시간 동안 기존에있는 여분의 세포 내 생체에 기록하는 기술에 비해 분명한 장점 일까지.

Introduction

꿀벌뿐만 아니라 다른 대부분의 곤충은 주로 후각에 의존하고 있습니다. 다른 사람의 사이에 그들은 방향, 짝짓기, 동종와의 통신 및 채집을 위해 후각 신호를 사용합니다. 그들의 잘 정교 후각 시스템은 꽃 냄새 자극에 관련된 학습 행동의 풍부한 레퍼토리에 기여한다. (- 5 리뷰가 3 참조) 이러한 문제가 쉽게 제어 실험실 조건에서 공부하실 수 있습니다. 뉴런의 상대적으로 작은 숫자와 그들의 "미니 두뇌"(info 참조 6) 꿀벌의 후각 코딩을 공부하고 신경 활동의 모니터링 기간 동안 학습을위한 적합 모델 생물한다.

곤충뿐만 아니라 포유 동물의 후각 시스템 (검토를 위해 7,8 참조) 훌륭한 정도 유사한 구성을 보여줍니다. 꿀벌의 안테나 (10, 11)을 따라 sensillae에 위치한 약 80,000 수용체 뉴런 9 neur에 환경 냄새 자극을 번역ONAL 신호. 후각 수용체 뉴런의 축색 돌기는 척추 동물의 후각 망울에 비해 사구체 조직이 더듬이 로브 (AL)를 신경을 분포시키다. AL은 약 4,000 지역의 interneurons (LN)에 의해 서로 상호 연결에 대한 164 사구체를 포함한다 (검토를 위해 12 참조). 특히 꿀벌로는 림프절 누덕 누덕 기운 측면 연결을 제공하고 다른 모집단이 원소와 configural 후각 코딩 특성 (13, 14)을 가지고 있다는 것이 최근에 밝혀졌다. AL은 내측과 외측 더듬이 로브 기관 (M-및 L-ALT 상승을주는 복부와 지느러미 헤미 로브로 분할되는 것으로 도시되었다 이전에 M-및 내측 및 외측 더듬이 로브 protocerebral에 대한 L-APT 되나 ) 17 - 15 기관. 여기에 곤충 뇌의 통합 명칭에 대한 최근의 노력에 의해 도입 된 새로운 기관 용어 (18)이 사용됩니다. 두 ALTS는 (L-및 m-ALT) 410 (L-ALT) 또는 510 (M-ALT) uniglomerular proje 하나를 결합ction의 뉴런 (PN), 각각 15,16,19. 두 책자의 PN이 최근 (검토를 위해 17, 20 참조) 병렬 2의 코드 냄새로 표시되었습니다, 두 책자는 시냅스 케년 세포 (KC), 버섯 몸 (MB)가 교장 뉴런 분기 연결을 형성한다. 23 - 각 MB는 약 172,000 관세청 (21)를 포함하고 있습니다. 매크로 블럭은 자극 통합, 학습 및 기억 형성에 관여하는 것으로 알려져있다. Vertica의 또는 알파 - 로브 수평 또는 베타 - 로브 (22, 24) : 관세청의 AXO의 수상 돌기는 두 가지 출력 영역이 꽃자루 (버섯의 줄기)를 형성한다. MB의 출력은 약 400 외인성 뉴런 (EN) (24)에 수렴한다. 후각 정보 처리에 대해 책임이 대부분 수직 돌출부 (22)의 복부 측면에 분포 ENS. 최근에는이 지역에서 기록 EN들이 냄새 보상 협회 (25)를 인코딩하는 것으로 나타났습니다.

같은 시간29 - 곤충뿐만 아니라 척추 동물의 후각 시스템 내에서 pects는 잠재적 인 코딩의 원리 (26)와 같은 중요하고 중요한 부분이되었다. 동시에 높은 시간 해상도에서 다른 사이트에서 여러 개의 뉴런을 기록 할 수 있으려면, 우리는 꿀벌과, 후각 시스템에서 다른 대상 지역에 도입 된 사용자 정의 멀티 채널 와이어 전극을 사용하여 이중 멀티 유닛에 기록하는 기술을 설립했다. 이 방법은 하나의 뉴런과 평행선 후각, 이중 후각 통로 2 또는 다른 후속 neuropils 1 사이 신경 세포의 집단의 수준에서 꿀벌의 후각 시스템에서 시간 처리를 분석하고 비교하는 가능하게한다. 최근 전극의 다른 구성을 사용하는 로커스트 후각 시스템 (30)에서와 유사한 방식으로 실험 배경 불변 악취 인식 (31)을위한 시공간 부호화 메커니즘을 분석 할 수 있었다. 일우리, 기존 듀얼 레코딩 동시 연결 활동 프로파일에 대한 공간 정보를 수집 수 있습니다.

칼슘 이미징에서 얻은 넓은 공간 샘플링에 비해이 방법은 두 가지 지점에서 녹음을 할 수 있습니다. 그러나, 칼슘 이미징 기술에 비해 장점은 종래의 CCD 촬상 또는 2 광자 촬상 취득 하나에 의해 제공 될 수없는 활동 전위 기록의 높은 시간 정밀도이다. 여기에 설명 된 세포 전극은 영구적으로 이식 된 전극 드리프트를 방지 뇌와 머리 캡슐에 상대적으로 고정되어 있습니다. 이것은 날카로운 세포 내 전극의 사용에 비해 명확한 이점이다. 세포 내 기록과 칼슘 이미징에 비해 또 다른 장점은 많은 시간의 일에 이르는 확장 된 신경 관측 시간입니다. 이것은 학습과 기억 형성의 신경 상관 관계를 조사하는 중요한 전제 조건입니다. 다중의 추가 혜택단위 기록은 더 토론 섹션에 설명되어 있습니다.

이 방법론 개요에서는 사용자 정의 디자인 와이어 전극의 제조 과정이 표시됩니다 (32, 33)에서 적응과 꿀벌의 뇌의 장기 멀티 유닛 녹음에 적합. 또한, 전극의 이러한 유형은 영구적 동시에 기록하는 꿀벌 후각 시스템 내의 두 개의 다른 기록 사이트에서 주입되는 방법 예 L-많은 자극 프로토콜을 허용하는 긴 기간 동안 m-ALT는 2를 나타낸다. 기록 위치의 확인을 위해 기록 사이트의 염색 및 후 기록 시각화에 대한 예제 및 프로토콜이 제공된다.

Protocol

1. 전극 건물 (그림 1)

  1. 상업적 멀티 채널 앰프 시스템 1,2,25의 전극 인터페이스 보드를 적합하다 전극 어댑터의 제조.
    1. 18 핀 커넥터베이스에 붙어있는 작은 플렉시 글라스 판을 사용합니다.
    2. 플렉시 글라스 판에 나사 3 별도의 납땜 러그에 절연 전선 3 짧은 조각 (그림 1 A1-A3)와베이스를 연결합니다.
    3. 유리 모세관 쉽게 이동할 수 있으며, 나사에 의해 고정 할 수있는 플렉시 글라스 판에 홈 (그림 1 B1)를 삽입합니다.
    4. minutien 핀을 사용하여 5mm에 대한 유리 모세관을 확장합니다.
    5. 안정화 및 지원을 보장하기 위해 minutien 핀과 유리 모세관을 따라 미세 전극 와이어를 연결합니다.
  2. 다중 채널 마이크로 와이어 생산 (Ryuichy 오카다 (32, 33)에서 채택)
    1. 스팬 3 마이크로 와이어 (폴리 우레탄 코팅 된 구리 와이어, 15그들은 서로 옆에 배치하는 방법 (그림 1 B2) μm의 직경).
    2. (전극의 끝) (그림 1 B3)들을 함께 접착제로 부분적으로 전선을 따라 저 융점 치과 왁스의 박막 (50 °의 C)를 확산하기 위해 12 V 납땜 바늘을 사용합니다. 이 섹션이 전극 어댑터 마이크로 와이어를 연결하기 위해 나중에 사용됩니다 같은 것은 unglued 몇 센티미터 (전극의 끝을한다).
  3. 전극 어댑터에 멀티 채널 마이크로 와이어를 연결합니다
    1. 홀더에서 유리 모세관을 제거하고 전극의 끝 부분에 minutien의 핀으로 연결합니다. 마이크로 전극 (그림 1의 B3)에 평행 한 위치로 가져 오십시오.
    2. 저 융점 치과 왁스를 사용하여 minutien 핀에 전극의 끝 부분을 접착제와 (작은 화살표가 1 B3 그림) minutien 핀에서 전극의 끝 부분 2 ~ 3 센티미터 돌출 끝에 마이크로 전극을 잘라.
    3. 모세관 SL 슬립ightly 다시 전극 어댑터에. (그림 1 B4) 고정 나사를 사용합니다.
    4. 절연의 용융 (그림 1 B4)을 보장하기 위해 약 360 ° C의 온도와 납땜 총을 사용하여 납땜 러그에 3 개의 와이어의 느슨한 끝을 납땜. 납땜 한 후, 적절한 전기 접점 (~ 300 옴)이있는 것을 확인합니다.
    5. headstage의 전극 인터페이스 보드에 전극 (마스터) 중 하나를 장착하고 별도의 어댑터의 다른 멀티 채널 전극 (슬레이브)를 고정합니다. 마스터 전극 (그림 1 C1)에 슬레이브의 채널을 연결합니다. 또한, 마스터 전극베이스에 기준뿐만 아니라 근육 전극 (도 1 C2)를 납땜.

2. 비 준비 (그림 2)

이러한 설명 실험에서, 무척추 동물 인 꿀벌 (아피스의 mellifera)따라서 사용에 대한 구체적인 윤리 허가, 사용을 필요로하지 않습니다.

  1. 다른 사람 (34, 35)에 의해 그림과 같이 아침에 벌집 입구에서 꿀벌 일벌 (A.의 mellifera)을 잡아라.
  2. 고정 (5 ~ 10 분)까지 짓 눌린 된 얼음에 꿀벌을 차리고 머리가 노출되는 방법 (그림 2)에서 표준 플렉시 유리 홀더 또는 금속 튜브를 고정합니다. 최소화하기위한 머리의 움직임은 저 융점 치과 왁스 (~ 50 ℃) 사용 및 그 화합물 눈과 목의 기초 주위의 홀더에 조심스럽게 머리를 고정합니다.
  3. 편모를 건드리지 않고 머리 캡슐 (그림 2 B)에 안테나의 SCAPI을 흥분하는 저 융점 왁스를 사용합니다. 안테나의 편모는 앞으로 지적 할 필요가있다. 꿀벌 자유롭게 그것의 코를 이동할 수 있는지 확인합니다.
  4. 방해받지 않고보기와 머리의 정상에 접근을 보장하기 위해 머리 캡슐을 면도.
  5. saturati까지 30 % 자당 용액을 벌 피드뇌 조직과 동물의 좋은 생존 (그림 2 C)의 충분한 가습을 보장하기에.
  6. 수직 복합 눈의 국경을 따라 수평으로 더듬이 기초 위에뿐만 아니라 ocelli 아래주의 절개를 확인하고 표피의 느슨해 조각 (그림 2 D)를 제거합니다.
  7. 조심스럽게 인후 분비를 따로 설정하고 밝은 전망 그리고 삽입 (그림 2E, 2F)를 전극 이전에 뇌에 대한 접근을 보장하기 위해 기관을 제거합니다.

3. 전극 삽입

도 2에 도시 된 예시적인 경우에서, 하나의 전극은 L-ALT, m-ALT 2에 조준되는 다른 하나의 목표 위치된다. 특정 마크를 사용하여, 다른 대상 영역은 예를 AL 및 MB 출력 영역 1,도 가능하다.

  1. (관심 영역에 미세 조작기를 이용하여 전극의 위치를 3A). M-ALT 장소에게 AL 및 내측 MB의 수직 로브에서의 전극을 대상으로. 내 외측 ALT PN의의 분기점 이상되는 삽입 부위를 확인합니다. 약 180 μm의 (그림 2E)의 깊이와 뇌에 전극을 돌출. 전극 수직 로브와 AL의 중간의 측면 사이에 가상의 선을 중간에 가로 protocerebrum (LH) 아래 L-ALT PN 기록 장소. 약 300 μm의 (그림 2E)의 깊이에 전극을 삽입
  2. 표피에 작은 상처를 통해 동측 화합물 눈에 참조 (실버 와이어, 약 25 μm의 직경)를 삽입합니다. 측면 ocelli 아래의 근육 투사 영역에 다른 실버 와이어를 삽입합니다. 참고 : 필요한 경우 꿀벌의 학습 행동은 나는 관여하는 근육 M17을 기록하여 높은 시간 정밀도로 모니터링 할 수 있습니다N 꿀벌 (36)의 코 확장 응답 (PER)은 같은 25에 설명.
  3. 단단하게, 뇌와 머리 캡슐 내에서 전극을 고정 건조에서 머리를 방지 할 두 개의 구성 요소 실리콘 (그림 2H)와 두뇌 위의 전체 공간을 커버합니다. 참고 : 녹음이 일까지 시간 동안 지속 할 수 있으며, 꿀벌, 예를 들어 고전적인 조절 절차 (그림 2H) 동안 기록 할 수 또는 다른 냄새의 큰 패널을 자극 할 수 있습니다.

4. 데이터 수집 및 전처리

  1. 다음과 같은 요구 사항을 충족하는 적절한 수집 소프트웨어 사용 분 25 kHz에서의 샘플링 속도를; 아날로그 1.25 또는 전극 채널 간의 디지털 2 교차 분화; 밴드는 스파이크 이벤트를 추출하는 8,000 Hz로 300 Hz에서에서 필터를 통과한다.
  2. 관음사 예를 들어, 하나의 단위 활동을 추출하기 위해 사용 가능한 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여Spike2 소프트웨어 (그림 3)에 포함되어있는 매칭 기술을 먹었다.
  3. 추가 분석을 위해 (그림 4) 또는 주성분 분석 (PCA)에 인구 벡터를 계산하기 위해 (그림 5) 상용 소프트웨어를 사용하여 냄새의 응답을 평균 한 단위를 계산하기 위해 추출 단위의 타임 스탬프를 사용합니다. 또한 하나의 단위 인구 응답 지연을 분석하는 것은 최근의 간행물에게 1,2,25을 비교한다.

5. 상대 전극 위치의 시각화 (그림 4)

  1. 알렉사 568 또는 알렉사 전에 기록 실험 0.5 M 염화 칼륨 용액에 용해되어 488 드라 자이드 5 %를 하이 드라 자이드 5 % 하나의 용액 중에 전극 팁을 찍어.
  2. 꿀벌 링거액과 함께 뇌를 씻어, 실험 후 조심스럽게 전극과 커버 실리콘을 제거, 동맥 및 기관을 제거하고 tetramethylrhodami의 작은 결정을 삽입N 덱스 트란 또는 anterogradely 알츠 레이블을 AL에 1.0 M 칼륨 아세테이트에 해결 5 % 용액을 삽입합니다. 어둠 속에서 다음 단계를 수행합니다.
  3. 염료가 흡수하고 또 다른 30 ~ 45 분 동안 벌 링거 용액으로 3 회 뇌를 세척하기 전에, 자신의 축삭 책자 (30 ~ 45 분) (그림 4A)를 따라 투영 뉴런에 의해 수송 될 수 있습니다.
  4. 고정 될 때까지 얼음에 꿀벌을 차리고 조심스럽게 머리 캡슐에서 뇌를 제거합니다. 4 %의 포름 알데히드를 함유하는 0.1 M PBS 용액으로 세척하여 뇌를 흥분하고 4 ℃에서 하룻밤 보관
  5. 0.1 M PBS (10 분마다)으로 뇌를 두 번 세척하기 전에 최소한 12 시간을 기다립니다.
  6. 0.2 %의 20 분 동안 뇌 3X 흘려 트리톤 오름차순 주류 시리즈 (30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 3 X 100 % 에탄올, 20 분에 탈수 전에 0.1 M PBS에 희석 X-100 각 단계).
  7. 현미경 슬라이드와 s에 Methylsalicylate의 탈수 뇌를 포함커버를 슬라이드로 평가 보증 등급 (EAL).
  8. 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 고조파 화합물 계획 고차 색지움 목표 (10X 0.4 NA 침수)를 사용하여 모든 2-5 μm의 광 섹션으로 뇌를 스캔 할 수 있습니다. 568 nm의 tetramethylrhodamin 덱스 트란에 대한 파장과 전극의 위치에 대한 488 ㎚의 파장을 이용하여 조직을 자극.
  9. 복원 소프트웨어 (예. AMIRA 또는 피지) (그림 4)와 3 차원 이미지 스택에서 스테인드 뇌 구조와 전극 경로를 재구성.

Representative Results

"이 의정서는 개별 꿀벌 내에서 두 개의 서로 다른 처리 단계에서 동시 녹음을 할 수 있으며 또한 예를 통해 학습과 기억의 기본 메커니즘을 테스트 할 수 있습니다., 구속 꿀벌 내 에어컨 PER." 이것은 신경 처리의 시간적 측면을 분석하기위한 필수 조건이다. 다른 과학적인 접근 방식은 꿀벌의 후각 시스템의 신경 네트워크를 해명하는 방법은 쉽게 적응할 수있다. 예를 들어이 방법은 꿀벌의 이중 후각 경로, L과 M-ALT PN을 (그림 5)에서 PN에의 시간 처리를 분석하기 위해 (i)를 사용합니다. 그림 (a)에 동시에 M-ALT의 PN로 기록 된 L-ALT PN의 한 예는 열 시험 평균으로 제공되며 색상 코드 열 플롯과 같은 다섯 가지의 악취 농도에 대한 자신의 반응 강도와 대기 시간을 보여줍니다된다. 11리터-13 엄마와 함께 일곱 벌의 평균LT 개의 PN (도 5B, 5C)는 응답의 강도뿐만 아니라, 응답 지연이 모두, 어느 정도, 악취 물질 농도를 반영하는 것을 나타낸다. 증가하는 악취 물질 농도가 자신의 응답 대기 시간 (그림 5B, 5C)를 거부하면서 이에이 예에서 PN에 자신의 반응 강도를 증가시킨다. 이 결과는 다소 제한 및 분석 악취 물질에 대해서만 유효하지만, 여전히 AL (37)의 최근 계산 모델과 일치한다. 꿀벌의 AL의 악취 농도 코딩은 비선형 계산의 기초가 다른 코딩 특성이 여전히 미래에 분석 할 필요가 기초 여부. 또한 방법 (II)이 후속 처리 단계, 및 AL-MB - 출력 (도 6)에서 인구 활동에 시간적 측면과 비교하는데 사용될 수있다. 주성분 분석 (PCA)는 악취 연산이 장기화와 PN 수준에서 전체 악취 프레젠테이션보다 더 오래되었는지 나타낸다 반면 EN 소재세트 온 오프 만의 냄새가 인구 활동 (그림 6)으로 표현 하였다들. PN 활동 정지 (info 참조 영화 1)을 현상 할 때 이에 EN 인구 시점에서 이미 최대 활성에 도달.

그림 1
... 그림 1과 3 채널 마이크로 와이어 전극을 제조 A1) 3 개의 와이어의 끝은 위치에 11, 13, 16 A2) 네 납땜 러그는 플렉시 유리, 플라스틱 기판에 나사 결합 IC 핀 커넥터에 납땜; minutien 핀이어서 플라스틱 판. A3) 플라스틱 판은 IC 핀 커넥터와 각각의 와이어의 자유 단부의 상부에 접착되어 부착되어 유리 모세관의 끝 부분에 삽입은 베스트 납땜 중 하나에 납땜 러그. <미세 구리 철사를 가진 전극 홀더의 장착을 위해 강한> B1), 모세관 홀더의베이스는 다음 장치를 정렬 주문품에 고정) 한 번 더. B2를 수행해야합니다. . 세 구리 마이크로 와이어 B3) 병렬 마이크로 와이어가 치과 왁스로 접착하고 모세 혈관이 장소 (긴 화살표)에 다시 넣어 각 끝 부분에있는 홈을 따라 정렬 및 접착 테이프로 고정; 접착 마이크로 와이어는 다음 구리 와이어의 세 느슨한 끝이 따라서 전기적 접촉을 데리고 3 대 납땜 러그에 납땜 치과 왁스의 끝이 (짧은 화살표)가 차단됩니다. B4)와 모세관에 연결되어 IC 핀 커넥터. C1) 개의 완전히 조립 된 전극은, 이러한 목적을위한 단일 headstage. C2)와 함께 사용 하나의 전극 (왼쪽, 슬레이브)의 핀이 오른쪽 (다른 쪽의 전극에 절연 전선을 통해 연결되어 서로 연결될 수있다 마스트) ER, 이는 헤드 스테이지에 접속되고; headstage 연결된 전극은 근육 (M17)과 기준 전극 (참조)에서 입력을 수집 할 수 있습니다.

그림 2
그림 2. 준비 및 꿀벌의 뇌에 영구적 인 전극 삽입.) 꿀벌은 얼음에 고정 후 플렉시 글라스 홀더에 삽입됩니다. 편모 (FL) 및 Scapus (SC)와 안테나는 머리는) B. 표시되며, 안테나는 치과 왁스를 사용하여 고정되어 있습니다. C) 헤드 캡슐 면도 및 꿀벌) 설탕 물. D가 공급되는 헤드 캡슐이 열립니다. E) 뇌의 상부로부터 분비 및 기관지를 제거한 후, 다른 neuropiles 주요 마크 쉽게 구별 될 수있다. ALTS의 궤적은 서로와 함께 표시됩니다전극이 삽입 된 마크. (MB : 버섯 몸, AL : 더듬이 로브, OL : 광 엽, α : 알파 엽 또는 수직 로브, ALT : 더듬이 로브 기관, E1 : M-ALT의 레코딩을위한 전극 삽입 측, E2 : L-ALT에 대한 전극 삽입 측 녹음). F) 참조 (참조)와 근육 전극 (M17)는 후 표피 또는 복안. G) 와이어 전극이 해당 사이트. H의 뇌에 삽입)에있는 작은 구멍을 통해 머리 캡슐에 삽입 두 개의 구성 요소 실리콘을 사용하는 장소에 전극을 고정, 꿀벌은 여전히 PER을 보여주고 가동 할 수있다 (예를 들면., 설탕 물을 사용).

그림 3
두 신경 책자 및 하나의 단위 추출 (스파이크 정렬).에서 그림 3. 세포 외 기록 B) 농도의 수용액에 꿀 500 밀리 냄새 자극에 모두 책자에 흥분 반응을 나타내는 L과 M-ALT PN을 (녹색과 보라색 흔적)에서 동시 녹음 1:100에서 33 ° C 각 플롯 라인은 A. 바에서 전극의 납땜 러그의 색상 코드 레이블과 차별화 된 채널을 나타냅니다 : 하나의 활동 전위가 정렬과 색상 코딩 된 50 μV C) 스파이크 정렬 절차 후.. 정렬 단위의 오버레이 파형의 분리를 보여줍니다. D) 스파이크 간격 히스토그램은 적절한 스파이크 정렬의 증거로 정렬 단위의 분리의 품질을 나타냅니다. 기기의 내화물 기간 내에 스파이크가없는합니다. E) 두 가지보기 (E1, E2)에서서로 정렬 된 단위의 거리를 나타내는 주성분 분석으로 정렬 된 단위의 3 차원 클러스터링. 원형 공간에서 SD를 닮아) 색상으로 구분 단위가 하나의 기관 녹화에서 세 채널의 확대에 보이는 활동 전위를 묘사 주성분 공간 F에서 클러스터의 중요한 차별화를 나타내는 2.5 배 마할 라 노비스 거리를 나타냅니다. 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 4
도 4. 포스트 레코딩 시각화 및 기록 위치의 3D 재구성. 전후면의 최대 강도의 정렬 된 Z-축을 따라 오르토 - 조각) 프로젝션보기그리고 MB와 LH에 AL에서 돌출 uniglomerular 투사 뉴런의 역행 메우기. 세포 내 트레이서 Microruby (tetramethylrhodamin 덱스 트란)을 기록 실험 후에 AL에 삽입 하였다. 알렉사와 두 전극의 염색에서 최대 강도의 정렬 된 Z-축을 따라 오르 조각의 AL 증거 적절한 PN 염색. B) 프로젝션 내부보기 스테인드 사구체는 M-ALT (E1, 화살표의 전극 위치를 나타내는 488 하이 드라 지드 ) 및 L-ALT (E2, 화살표). 트레이서 알렉사 하이 드라 지드 488은 전극 주변 조직에 마이그레이션 및 전극 삽입 부위 얼룩. AL에서 눈에 띄는 얼룩이 함께 꿀벌의 후각 시스템 (의 개략적 인 개요와 표면 가공품 스테인드 표적 세포 (PN)로 중. C) 3D 재건 및 A, B (오른쪽에서 전극 삽입 부위)이며, 주 왼쪽 L과 M-ALT 궤적의 표시로 측). 만 uniglomer, 주신경근 PN 책자가 표시됩니다. : 더듬이 신경, AL : 더듬이 로브, LH : 측면 경적, MB : 버섯 몸, E1, E2 : 전극 삽입 사이트, M-ALT : 중간 더듬이 로브 기관, L-ALT : 측면 더듬이 로브 기관, C : 꼬리, R : 주동이, M : 중간, L :. 측면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
악취 농도 코딩의 그림 5. 예 이중 후각 통로에서.) 열 그래프는 하나의 L-ALT (녹색의 반응을 설명) 및 단일 M-ALT PN은 (보라색) 악취 물질에 대한 응답으로 개별 꿀벌에서 동시에 취득 (: 10-6 1 내지 1:100) 악취 농도 증가시 헥산. 각 행 10 시험 STIM의 평균입니다ulation. 발사 속도는 7 기록 꿀벌 11 L-13 M-ALT PN의의. B) 인구 응답 대기 시간을 뺀 자발적인 활동과 관련하여 발사 속도입니다 상대 강도의 변화로 표시됩니다. 각 꿀벌의 두 책자의 PN을 동시에 기록했다. 인구 응답 지연은 모두 책자에서 PN의 악취 농도가 증가함에 따라 감소하는 대기 시간을 나타낸다. 99 밀리 초에서 안테나의 냄새 응답 발병은 electroantennograms를 통해 기록하고 PN 응답 대기 시간에서 차감됩니다. 응답 지연 시간 측정을 위해 너무 약하고, 따라서 반응 강도가 증가하고 증가하는 악취 농도 B.와 동일한의 PN 속도를 발사. C) 인구 응답이 제외 된 가장 낮은 농도에서 그합니다. L-ALT는 강한 반응 강도를 보여줍니다. B에서 C 평균과 SD가 제공됩니다.

그림 6 그림 6. 꿀벌의 후각 통로를 따라 두 개의 후속 처리 단계에서 인구의 활동을 비교. 데이터는 1 - 헥산 올, 2 - 옥타.)로 자극 된 20 마리의 동물에 기록 된 각 행은 거짓 색으로 구분 한 투사의 평균 발사 속도를 나타냅니다 신경 세포 (PN)은 1 - 헥산 올 10 냄​​새 반복을 통해 계산. 냄새 프리젠 테이션 시간이 0에서 시작 3 초. B를 지속)에서와 동일하게 표시)하지만 버섯 몸 외부의 뉴런 (EN)에 대한. 에 나타낸 매트릭스) -1 - 헥산 올과 악취 자극 동안 PN 인구 벡터로 볼 수있다. 우리는 2 - 옥타 논으로 악취 자극 중에 인구 벡터의 동일한 종류를 계산하여 시간적 차원. C 유지 주성분 분석에서 두 벡터 (PCA)를 사용) 처음 세 개의 주요 구성 요소 (PC1, 2, 3)이었다더듬이 로브 출력에서​​ PN 앙상블 활동 악취 분리를 설명하기 위해 서로에 대하여 플롯. 냄새의 발병하기 전에 시간은 검은 색으로 표시됩니다. 1 - 헥산 올과 자극의 3 초 동안에는 활동은 파란색으로 표시됩니다. 2-옥탄 올과 자극 동안 활동이 빨간색으로 표시됩니다. 또한, 우리는 1 - 헥산 올 (밝은 파란색)과 (핑크) 2 octanonen 세트의 냄새 후 활동의 1.5 초 (포스트)를 보여줍니다. PN 앙상블 수준에서 매우 독특한 궤적을 불러 일으키는 두 냄새가 "고정 점"보다 오래 지속 전체 냄새 자극의 기간에 정착합니다. 냄새 오프셋 후에 만 궤적은 냄새 자극없이 기본 활동으로 이동합니다. D) 같은 분석은 버섯 몸의 출력에서의 활동을 나타내는 EN 앙상블 수준에서 이루어졌다. PN 활동에 비해 냄새가 덜 별개의 궤도를 보여주고 있습니다. 또한 "고정 점"는 관찰되지 않습니다. 처음에 냄새를 유발 궤적 INTE냄새가 여전히 존재하지만, 기본 활동과 rmingle. 오프셋 만 냄새는 추가 궤도를 유발.

. 영화 1 시간 PN-인구 벡터 (왼쪽)와 EN 인구 벡터의 주성분 분석 후 냄새 유도 궤도의 평가를 해결했습니다. (. 권리를, CP 그림 6) 상부는 처음 세 개의 주요 구성 요소 (PC1을 포함 2, 3)은 서로에 대해 도시. 하부 패널은 한동안 PC1, 2 및 3의 평가를 나타낸다. 냄새의 자극은 회색 막대로 표시됩니다. 모든 패널은 동기화되었다. EN 인구 활동이 PN 인구 활동하기 전에 약간 시작합니다, contraintuitive 것 같다하지만 현상은 연결 및 이전 버전의 경우 1 설명하는 참여 층의 속성에 의해 설명 될 수있다.

Discussion

이 문서는 생산 및 맞춤 설계 다중 채널 마이크로 와이어 전극의 사용 방법을 보여줍니다. 설명 전극을 하나의 단위 및 (자세한 내용은 1,2,25 참조를 위해) 하나의 표본 내에서 지연 시간 측정과 다른 뉴런과 다른 neuropils의 다른 시간 응답 특성에 특히 유용 인구 활동을 모두 기록하기에 적합하다. 또한 우리는 영구적 일까지 시간 동안 지속 꿀벌을 행동에 안정적인 장기 녹음을 할 수 있도록 마이크로 와이어 전극을 구현하는 방법을 보여 주었다.

세포 외 멀티 유닛 녹음은 공간 정보와 결합 된 높은 시간 해상도를 달성하기 위해 유리한 도구가되었다. 우리의 경우에, 이러한 병렬 신경원 소책자 또는 2 개의 상이한 neuropils 어느 하나이다. 다수의 뉴런 병렬 단일 뉴런 수준 및 높은 시간 해상도로 기록하고 분석 할 수있다. 다중 단위 기록41 - INGS 먼저 곤충 39 나중에 포유 동물 (38)에 적용 하였다. 실질적인 진전은 세포 외 멀티 채널 기록하는 기술 42,43의 개발 및 개선을 달성 하였다. 이것은, 예를 들어, 새로운 전극 (44) 또는 신규 스파이크 정렬 및 클러스터링 알고리즘 (45)의 개발을 포함한다. 48 - 세포 외 여러 장치에 기록하는 기술의 일반적인 방법이 아니라 46에 설명되어 있습니다. 이 비디오에 표시된 자체 내장 된 전극을 추가로 더 전극 당 microwires 또는 마이크로 와이어가 팁 사이에 측정 가능한 일정한 거리를 얻기 위해 트위스트 수를 추가하여 적용 할 수 있습니다. 두 절차는, 그러나, 유연성을 감소시키고, 전극의 두께를 증가로 이어질 것이다.

일반적으로 매 나방, 메뚜기와 바퀴벌레 40,49 같은 훨씬 더 큰 곤충 세포 레코딩에 사용되는 실리콘 프로브에 비해 - (51) 기술 마이크로 와이어 전극, 유연 작은 잠재적 인 뇌의 움직임에 쉽게 대응할 수 있고, 따라서, 안정적으로 훨씬 광범위한 행동 레퍼토리를 보여 꿀벌과 개미 같은 작은 곤충 사회에서 사용할 수 있습니다. 설명 마이크로 와이어, 라운드 유연하고 작고 목표는 오래 공부하면 분명 장점이 주위 조직에 따라서 덜 해로운 동안 대부분의 실리콘 프로브는, 자신의 삽입 채널을 따라 축삭과 신경 조직을 절단 구조와 같은 날카로운 생크가 손상 및 행동 동물의 장기 소성. 마이크로 와이어 전극의 또 다른 장점은 저비용 제조 및 취급이 용이하다. 대신 정중 비싼 실리콘 프로브 세정 전극 와이어는 갓 그러므로, 혼잡의 결여 문제를 종래의 뇌에 삽입 컷된다. 또한 그것은 하나를 다른 하나 neuropiles O 삽입 동일한 제제에 하나 이상의 마이크로 와이어 전극을 사용하는 것이 가능하다R 책자 2 우리는 여기에서 보여준다. 이 방법은 다른 신경 처리 수준에서 응답 대기 시간 및 상호 작용 같은 시간적 측면을 분석하고 비교하는 것이 특히 바람직하다.

우리는 세포 외 기록 된 신호가 그 자체로 단일 세포 활성을 반영하지 않는다는 사실을 인식하고있다. 항상 전극 팁 주위 전압 활성 화합물이다. 하나의 전극 사이 인접한 두 마이크로 와이어 채널의 차이가 항상 계산 신호의 소스를 정확하게. 따라서 단일 유닛 활동을 추출하는 데 스파이크 신호 소스는 항상 하나 또는 쉽게 구별 스파이크 파형 발생 다른 전극 채널 중 하나에 매우 근접했다. 멀리에서 신호는 이웃 neuropils의 근육 활동 또는 활동과 같이 비슷한 모양과 진폭을 불러 일으키는 동시에 두 전극에 도달하고이 절차에 의해 삭제됩니다. Spike2의 템플릿 정합 기법을 사용우리는 동일하지 않습니다 하나의 유닛 활동을 얻기 위해 매우 확신하지만, 하나의 신경 세포의 활동에 매우 가깝습니다. 그러나, 스파이크의 정렬 문제는 세포 내 레코딩 기술을 사용하여 회피 될 수있다.

날카로운 전극 또는 패치 피펫 하나 단일 세포 기록은 단일 신경 세포의 생리적 특성에 대한 심층적 인 지식을 할 수 있습니다. 그러나, 작은 곤충 뉴런의 크기와 자신의 신경 돌기 (꿀벌 PN이 52 예. 미만 1 μm의)에만 단기 녹음 관리 할 수 있습니다. 또한, 내 휴대 전화 기록은 침략있을 가능성이 시간 제한에 대한 또 다른 이유는 세포에 손상을 줄 수있는. 곤충의 생체 세포 내 기록은 거의 한 시간보다 더 오래 갈 수 없습니다. 단일 식별 신경, 복부 짝 maxilar 신경 # 1 (VUMmx1)에서 세포를 기록 마틴 해머 (53)의 선구적인 작업을위한 충분있는 시간이 길어집니다. 그는 내가 할 수직접 보상 경로에 잉크의 활동. 율리아 Mauelshagen (54)는 세포 내에서 식별 된 버섯 신체 외부의 신경 세포의 활동을 등록, 고전적 조건 중 한 Pedunculus 외인성 신경 # 1 (PE1). 그들은 케년 세포의 전기 자극 후 LTP를 발견했을 때 동일한 신경 세포는 멘젤과 만츠 (55)의 초점이었다. 그러나 오카다와 동료 (56)는 세포 외 녹음하는 동안 PE1의 식별을 위해 세포 내에서 잘 특성화 급상승 패턴 (더블, 트리플 스파이크)를 사용할 수 있습니다. 두 가지 방법을 모두 조합 한 후, 확인 된 신경 세포와 세포 외 장기 녹음에서 세포 내 기록은 미래의 연구를위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

그러나, 그들의 시간 반응 관계 및 / 또는 플라스틱의 변화를 분석하는 일까지 많은 시간 동안 다른 처리 레벨에서 동시에 여러 개의 셀 (단위)를 기록하는 날카로운 전극을 사용하여 전거의 불가능하다.

62 - 제 칼슘 이미징 칼슘 민감 염료를 사용하여 꿀벌에서 57,58 접근과 악취 응답의 공간 패턴의 분석은 59 접근되었습니다. 그러나, 많은 경우에 칼슘 민감 염료 다시 꿀벌의 수명 및 분석 세포의 본질적인 특성을 제한 침습 조작을 통해 뇌 조직에 도입되어야한다. 이 문제는 유전자 도입 칼슘 센서 63, 64을 사용하여 초파리와 같은 다른 모델 생물 극복된다. 그들은 가능​​성 악취 응답의 시간적 특성에 영향을 미치는 칼슘 버퍼로서 작용할 수로하지만, 일반적으로, 칼슘 센서는 다른 제한을 도입 할 수 있습니다. 칼슘 이미징 또는 계산 방법과 함께 동시 세포 내 기록은 영상의 적절한 시간 해상도는 65, 66를 처리 증명할 수 있습니다. 그러나, 화상 형성 공정 자체의 시간 해상도는 신속한이다R 제한. 2 광자 이미징 빠른 시퀀스 (68)를 획득 할 수있을 수도 있지만 광학 수집 시스템은 보통 5 ~ 20 Hz에서 67 시간 분해능으로 CCD 이미징을 사용합니다. 그러나, 증가 샘플링 속도는 항상 공간 해상도의 손실과 함께 간다. 또한 꿀벌에 사용 칼슘 민감 염료는 획득 시간 (69)을 감소 표백을 겪는다.

곤충의 다른 생리 학적 기록 기술에 비해 유연한 멀티 채널 마이크로 와이어 전극을 하나의 단위와 꿀벌 행동 인구의 연결 활동에 오랜 시간 접속을 보장합니다.

우리는 서로 다른 기록 사이트 간의 시간적 부호화 양태의 분석을 용이하게 동일 동물에서 상이한 처리 단계에서 이들 두 전극을 사용하는 방법을 설명했다. 연구 문제와 여기에 설명 전극 건물의 기본 방법 곤충 모델에 따라 쉽게 확장된다수 및 / 또는 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 다 채널 전극을 생성하기 위해 세 번의 와이어 이상을 사용하도록 고려된다. 또한, 기록 위치의 숫자는 연장 이상의 소책자 또는 neuropils의 시간적 측면을 관찰하는 것은 가능하다 할 수있다. 우리의 희망은이 방법은 많은 과학자를 격려하고 작은 두뇌의 복잡한 신경 처리의 이해에 긍정적으로 기여할 것입니다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Fluka 76235
Odors Sigma Aldrich 
PBS pH 7.2
4% Formaldehyde ThermoScientific 28908 Methanol free
Triton X BioChemica A1388
Methylsalicylate Roth 4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) Invitrogen D7162 keep dark
Alexa 488 hydrazide Invitrogen A-10436 keep dark
Alexa 568 hydrazide Invitrogen A-10437 keep dark
Bee Ringer Solution see Brill et al.2
Polyurethane-coated copper wire Elektrisola 15 µm diameter & P155 insulation
Dental Wax  Densply Detrey 64103015S1 moderate melting point
Dental Wax Flexaponal  124-202-00 low melting Wax
KWIK SIl WPI 03L
18 Pin Socket Conrad Electronic 189634-62
Hot melting glue Conrad Electronic 827673
Soldering needle Conrad Electronics 830283 12 V
Soldering terminal lug  Conrad Electronic 531901
Glaselectrodes WPI 1B100F-3
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 V2A 0.2 x 12 mm
Switchable headstage Tucer Davis Technologies SH16
Headstage connection module NPI INT-03M
Amplifier Module NPI PDA-2F
Data Acquisition boards National Instruments NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software National Instruments Lab View 8.2 custom design
Spike-Sorting  CED  Spike 2 v7.11
Matlab Mathworks R2008B
Micromanipulator Leitz manual
AG-wires WPI AGT05100
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP2 AOBS
AMIRA Mercury Computer Systems  2/5/2000

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References

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행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음
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Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).More

Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).

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