Одновременные внеклеточных долгосрочной записи с двух разных neuropiles мозга или двух различных анатомических путей были созданы в пчел. Эти записи позволяют расследование временных аспектов нейронов обработки в различных областях мозга на одного нейрона, а также на ансамбль уровне в ведет себя животное.
В обоих млекопитающих и насекомых нейронов информация обрабатывается в разных центрах выше и более низкого порядка мозга. Эти центры связаны через конвергентных и дивергентных анатомических соединений, включая корма вперед и обратной проводки. Кроме того, информация из того же происхождения частично отправлены через параллельных путей в разные, и иногда в тех же областях мозга. Чтобы понять эволюционные преимущества, а также вычислительные преимущества этих стратегий проводки и особенно их временных зависимостей друг на друга, необходимо иметь одновременный доступ к отдельных нейронов различных путей или neuropiles в том же препарата при высоким временным разрешением. Здесь мы сосредоточимся на пчел, демонстрируя уникальную внеклеточный долгосрочный доступ для записи мульти блок деятельность на двух последующих neuropiles 1, антенной доле (AL), первой обонятельной стадии обработки и тела гриба (МБ), высшего порядка интеграции центральной инволюцииlved в процессе обучения и формирования памяти, или двух параллельных нейронных путей 2 смежных Л. с МБ. Последний был выбран в качестве примера и будут описаны в полном объеме. В опорной видео демонстрируется строительство и постоянное введение гибких многопроводная канал электродов. Парные дифференциального усиления микро проволочный электрод каналов резко снижает шум и проверяет, что источник сигнала тесно связано с положением концом электрода. Механическая гибкость используемых проволочных электродов позволяет стабильные инвазивные долгосрочной записи в течение многих часов до дней, что является явным преимуществом по сравнению с обычными дополнительных и внутриклеточных в технике звукозаписи естественных условиях.
Медоносные пчелы, как и большинство других насекомых во многом полагаются на обоняние. Среди прочего они используют обонятельные сигналы для ориентации, спаривания, общение с особями, и собирательством. Их хорошо разработаны обонятельная система способствует богатым репертуаром учебных поведения, связанных с цветочными запах раздражители. Такое поведение может быть легко изучены в контролируемых лабораторных условиях (см. обзор 3 – 5). Их "мини мозги" (ср. 6) с их относительно небольшого числа нейронов делает пчела хорошо подходит модельный организм для изучения обонятельной кодирование и обучения в ходе мониторинга нейронной активности.
Обонятельная система у насекомых, а также у млекопитающих показывает аналогичную организацию в значительной степени (см. обзор 7,8). В пчел около 80000 нейронов рецепторов 9, расположенные в сенсилл вдоль антенн 10,11 перевести стимул окружающей запах в Neurнальных сигнал. Аксоны от обонятельных рецепторных нейронов иннервируют антенной доле (AL), который имеет клубочковой организацию, сопоставимую с позвоночных обонятельной луковице. AL включает в себя около 164 клубочков, соединенные друг с другом около 4000 местных интернейронов (LN) (см. обзор 12). Особенно в медоносной пчелы было показано недавно, что LNs обеспечить пятнистый боковое подключение и что различные субпопуляции обладают элементарные и configural обонятельные свойства кодирования 13,14. А.Л. было показано, что подразделяется на вентральной и дорсальной геми доли, явившихся основанием медиальной и боковой антенной доле тракта (м-и л-ALT; ранее назвал м-и л-APT для медиальной-и боковой антенной доле protocerebral урочищу 15 – 17). Вот новая терминология тракта введен результате недавно проведенной работы по единой номенклатуре насекомых мозга будет использоваться 18. Оба АЛТ (л-и м-ALT) объединить либо 410 (л-ALT) или 510 (м-ALT) uniglomerular Projeие нейроны (PN), соответственно 15,16,19. ПШ обоих путей недавно было показано, что код запахов в параллельном 2 (см. обзор 17,20), и оба участки синаптически образуют расширяющееся связи с Kenyon клеток (КЦ), тело гриба (МБ) основных нейронов. Каждый Мб содержит около 172 000 крон 21 – 23. МБС, как известно, участвует в интеграции стимула, обучение, а также формирования памяти. ОВБ дендриты крон формируют цветонос (стволовых гриба), который имеет два основных вывода регионы: Vertica или альфа-лепестков, а по горизонтальной или бета-доля 22,24. Выход МБ сходится к всего около 400 внешних нейронов (EN) 24. Энс ответственность за обонятельной обработки информации в основном иннервируют вентральной части вертикальной доли 22. Недавно было показано, что ЕН записанные в этой области кодирования вознаграждение запах ассоциации 25.
Временная какpects внутри обонятельной системы насекомых, а также позвоночных стали важным и значимым аспектом в качестве потенциального принципе 26 кодирования – 29. Чтобы иметь возможность одновременно записывать несколько нейронов с разных сайтов с высоким временным разрешением, мы создали двойные многоканальный методы блок записи с помощью настраиваемых многопроводная канал электроды, введенные в различных целевых регионах в обонятельной системы пчелы. Такой подход позволяет анализировать и сравнивать временной обработки в системе обоняния пчел на уровне отдельных нейронов и популяций нейронов либо между параллельными обонятельных путей, двойной обонятельной пути 2 или между различными последующих neuropils 1. Недавно с подобным экспериментальным подходом в борьбе с саранчой обонятельной системы 30, используя другую конфигурацию электродов смогли проанализировать пространственно-временной механизм кодирования для фона-инвариантной признания запаха 31. Чтнам, установленные двойные записи позволяют собирать пространственную информацию о одновременных нейронных профилей деятельности.
По сравнению с более широком пространственном выборки, полученной из изображений кальция этот метод позволяет записывать полученные только из двух пятен. Однако преимущество по сравнению с методами визуализации кальция является высокая точность временной потенциала действия записей, которые не могут быть предоставлены либо в обычной ПЗС съемки изображения или приобретения 2-фотонов. В внеклеточные электроды, описанные здесь, постоянно имплантированы и фиксированной по отношению к мозгу и головной капсулы, избегая электрода дрейф. Это является явным преимуществом по сравнению с использованием острых внутриклеточных электродов. Еще одно преимущество по сравнению с внутриклеточных записей и изображений кальция является длительное время нейронная наблюдения от многих часов до суток. Это является важной предпосылкой для расследования нейронных коррелятов формирования обучения и памяти. Дополнительные мультиблок записи более подробно изложены в разделе обсуждения.
В этой методологической обзор изготовления процедура обычай проводов дизайн электродов будет показано, взято из 32,33 и подходит для долгосрочных нескольких единичных записей в медоносной пчелы мозга. Кроме того, пример того, как эти типы электродов постоянно имплантированы на двух различных участках записи в пределах пчел обонятельной системы для записи одновременно L-и M-ALT в течение длительных периодов времени, чтобы позволить множество протоколов стимуляции показан 2. Для проверки позиций записи в качестве примера и протокол для окрашивания и записи после визуализации записи сайтов предоставляется.
В этой статье показано производство и использование специально созданных многоканальных микро проволочных электродов. Описанные электроды подходят для записи как единое целое и активность населения, что особенно полезно для задержки измерений и других временных свойств реагирования различных нейронов и различных neuropils в пределах одного образца (подробнее см. 1,2,25). Кроме того, мы показали, как постоянно осуществлять микро проволочных электродов, чтобы стабильные долгосрочные записи в себя пчел, которые длятся в течение нескольких часов до суток.
Внеклеточные многоквартирных записи стал благоприятным инструментом для достижения высокой временное разрешение в сочетании с пространственной информацией. В нашем случае, это либо параллельные нейронные тракты 2 или два разных neuropils 1. Несколько нейроны могут быть записаны и проанализированы на одном уровне нейронов параллельно и на высоким временным разрешением. Нескольких аппаратов записьIngs были впервые применены в млекопитающих 38, а затем и у насекомых 39 – 41. Существенный прогресс был достигнут с развитием и совершенствованием внеклеточных методов записи многоканальных 42,43. Это, например, включает в себя разработку новых электродов 44 или новых шип сортировки и кластеризации алгоритмов 45. Общие методы внеклеточных методов записи многоквартирных хорошо описываются 46 – 48. С собственной встроенной электродам, показанным в этом видео дополнительно могут быть адаптированы, добавляя больше микропроводов на электроде или микро провода могут быть скручены, чтобы получить измеримых постоянные расстояния между кончиками. Обе процедуры, однако, привести к снижению гибкости и увеличением толщины электрода.
По сравнению с зондов кремния, обычно используемых для внеклеточных записи в гораздо больших насекомых, как ястреб моли, саранчи и тараканов 40,49 – </SUP> 51 описанные микро проволочные электроды имеют меньшие размеры, гибкий и легко могут справиться с потенциальными движений мозга и, таким образом, может быть надежно использован в малых социальных насекомых, таких как пчелы и муравьи, которые показывают намного более широкий поведенческий репертуар. Большинство силиконовые зонды имеют острые хвостовик как структуры режущих аксоны и нервную ткань вдоль их вставки канала, в то время как описанные микро провода круглые, гибкие и меньше и, следовательно, менее вредны для окружающей ткани, которая является явным преимуществом, если цель состоит в изучении долго срок пластичность в здоровом и ведет себя животное. Еще одно преимущество микро проволочных электродов является их низкая себестоимость и простота в использовании. Вместо того, чтобы тщательно очистки дорогой силиконовый зонд электродные проволоки свежесрезанных перед введением головного мозга и, следовательно, отсутствие проблем перегрузки. Кроме того, можно использовать более одного микро проволочного электрода в том же препарате или вставленной в различных neuropiles 1 Oг участки 2, как мы показываем здесь. Этот подход особенно благоприятен для анализа и сравнения временные аспекты, как задержки реагирования и взаимодействия при различных нервных уровней обработки.
Мы отдаем себе отчет в том, что внеклеточный записанный сигнал не отражает деятельность одной клетки сами по себе. Это всегда соединение активности напряжения вокруг наконечника электрода. Чтобы определить источник сигнала разность двух соседних микроканалов проволоки внутри одного электрода всегда компьютерной. Таким образом, источником для шип сигналов, используемых для извлечения блока деятельность одного всегда были очень близко к любой из них или другого канала электрода, в результате чего легко различимых шип сигналов. Сигналы от дальше, как мышечной активности или активности соседних neuropils, достигают оба электрода в то же время, напоминающей аналогичные формы и амплитуды и будет отброшен этой процедурой. Используя соответствующий шаблон технику Spike2,мы уверены, чтобы получить единичную активность, которая является не то же самое, но очень близко к одной нейронной активности. Тем не менее, вопрос о шип сортировки можно было бы избежать с помощью внутриклеточных методы записи.
Единичных клеток записи с либо резких электродов или патч-пипеток позволяют углубленное знание о физиологических свойств одного нейрона. Однако из-за небольшого размера нейронов насекомых и их невриты (например., Менее 1 мкм для пчел ПШ 52) только краткосрочные записи являются управляемыми. Кроме того, внутриклеточных записей может быть агрессивным и может повредить ячейки, которая, возможно, еще одна причина для временных ограничений. IN VIVO внутриклеточных записей в насекомых редко дольше одного часа. Временное окно, которое было достаточно для пионерской работы Мартина Молот 53, который записал внутриклеточные из одного идентифицированного нейрона, брюшной непарного maxilar нейрона # 1 (VUMmx1). Он мог лчернила свою деятельность непосредственно на вознаграждение пути. Юлиане Mauelshagen 54 зарегистрировано внутриклеточно активность идентифицированного тела гриба внешней нейрона, pedunculus внешняя нейрон № 1 (PE1) во время классического обусловливания. То же нейрон был в центре внимания Менцеля и Манц 55, когда они нашли LTP после электрической стимуляции Kenyon клеток. Тем не менее, Окада и его коллеги 56 может использовать внутри клетки хорошо охарактеризованы пики шаблон (двойные и тройные шипы) для идентификации PE1 во внеклеточных записи. Ведь сочетание обоих методов, внутриклеточных записей из выявленных нейронов и внеклеточных долгосрочных записей может быть мощным инструментом для дальнейших исследований.
Однако, используя острые электроды для записи нескольких ячеек (единиц) одновременно на различных уровнях обработки в течение многих часов до дней, чтобы проанализировать их временные соотношения реагирования и / или даже пластиковые изменений япрактически невозможно.
С первым визуализации кальция подходов в пчел 57,58 помощью кальция чувствительных красителей анализ пространственных структур ответов запаха были доступны 59 – 62. Тем не менее, во многих случаях кальция чувствительные красители должны быть введены в мозговой ткани через инвазивных манипуляций, которые снова ограничивают продолжительность жизни пчелы и внутренние свойства анализируемых клеток. Этот вопрос преодоления в других модельных организмов как fruitfly использованием генетически введенные датчики кальция 63,64. Однако, в общем, датчики кальция может вводить другие ограничения, поскольку они могут выступать в качестве буферов кальция, которые, вероятно, влияют на временные свойства реакций запах. Одновременные внутриклеточных записей в сочетании с изображениями кальция или вычислительных подходов может оказаться надлежащее временное разрешение изображений обрабатывает 65,66. Тем не менее, временное разрешение самого процесса формирования изображения является стремительныйг ограничено. Оптические системы сбора обычно используют ПЗС-изображений с временным разрешением 5-20 Гц 67, хотя 2-Фотон-Imaging могли бы приобрести более быстрые последовательности 68. Однако увеличение частоты дискретизации всегда идет вместе с потерей в пространственным разрешением. Кроме того кальциевые чувствительных красителей, используемых в медоносной пчелы пройти отбеливание, которая также сокращает время сбора 69.
По сравнению с другими физиологическими методами записи в насекомых наши гибкие многоканальные микро-проволочные электроды гарантируют долгий времени доступ к одной единице и нейронной активности населения в себя пчел.
Мы показали, как использовать два из этих электродов на различных этапах обработки в того же животного, что облегчает анализ временных аспектов кодирования между различными сайтов записи. В зависимости от задачи исследования и модели насекомых основного метода электрода здания продемонстрировали здесь легко расширитьсостоянии и / или могут быть адаптированы. Например, это возможно использовать более трех отдельных проводов производить многоканальные электродов. Кроме того, количество сайтов записи может быть продлен и наблюдая временные аспекты более двух путей или neuropils возможно. Мы надеемся, что этот метод будет вдохновлять многих ученых и внесет позитивный вклад в понимание сложной нейронной обработки в небольших мозгов.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |