Simultáneas grabaciones extracelulares de largo plazo a partir de dos neuropiles cerebrales diferentes o dos extensiones anatómicas diferentes se establecieron en las abejas. Estas grabaciones permiten la investigación de los aspectos temporales de procesamiento neuronal a través de diferentes áreas cerebrales en la única neurona, así como a nivel de conjunto en un animal de comportarse.
En ambos mamíferos e insectos de información neuronal se procesa en diferentes centros de orden superior e inferior del cerebro. Estos centros están acoplados a través de convergentes y divergentes conexiones anatómicas entre ellos alimentación hacia adelante y el cableado de la retroalimentación. Además, la información del mismo origen se envía parcialmente a través de vías paralelas para diferentes ya veces en las mismas áreas del cerebro. Para entender los beneficios evolutivos, así como las ventajas computacionales de estas estrategias de cableado y especialmente sus dependencias temporales de cada otro, es necesario tener acceso simultáneo a las neuronas individuales de diferentes extensiones o neuropiles en la misma preparación a alta resolución temporal. Aquí nos concentramos en las abejas mediante la demostración de un acceso único extracelular largo plazo para registrar la actividad de múltiples unidades en dos neuropiles posteriores 1, el lóbulo antenal (AL), la primera etapa de procesamiento olfativo y el cuerpo de hongo (MB), un orden superior invo centro de integraciónlved en el aprendizaje y la formación de la memoria, o dos tractos neuronales paralelos 2 que conectan la Liga Americana con el MB. Este último fue elegido como un ejemplo y se describe en su totalidad. En el video se demuestra el apoyo a la construcción y la inserción permanente de electrodos flexibles de múltiples hilos de canal. Amplificación diferencial por pares de los canales de electrodos de alambre micro reduce drásticamente el ruido y verifica que la fuente de la señal está estrechamente relacionada con la posición de la punta del electrodo. La flexibilidad mecánica de los electrodos de alambre utilizados permite grabaciones estables invasivos de uso prolongado durante muchas horas hasta días, lo cual es una clara ventaja en comparación con técnicas adicionales e intracelulares en convencionales de grabación in vivo.
Las abejas, así como la mayoría de otros insectos dependen en gran medida el olfato. Entre otros que utilizan señales olfativas para la orientación, el apareamiento, la comunicación con sus congéneres, y búsqueda de alimento. Su sistema olfativo bien elaborada contribuye a un rico repertorio de comportamientos de aprendizaje relacionadas con los estímulos de olor florales. Estos comportamientos se pueden estudiar fácilmente bajo condiciones controladas de laboratorio (para revisión ver 3-5). Sus cerebros "mini" (cp. 6) con su número relativamente pequeño de neuronas hace que la abeja melífera en un organismo modelo muy adecuado para el estudio de la codificación olfativo y el aprendizaje durante el monitoreo de la actividad neuronal.
El sistema olfativo en los insectos como en mamíferos muestra organización análoga en gran medida (para revisión ver 7,8). En las abejas alrededor de 80.000 neuronas receptoras 9 situadas en sensilas lo largo de las antenas 10,11 traducen el olor estímulo ambiental en un neurseñal onal. Los axones de las neuronas olfativas del receptor inervan el lóbulo antenal (AL), que tiene una organización glomerular comparable a el bulbo olfatorio de los vertebrados. El AL comprende alrededor de 164 glomérulos interconectados entre sí por unos 4.000 interneuronas locales (LN) (para una revisión ver 12). Especialmente en la abeja se ha demostrado recientemente que los LN proporcionan conectividad lateral irregular y que las diferentes subpoblaciones poseen propiedades olfativas de codificación elementales y configuracionales 13,14. El AL ha demostrado ser subdividido en un lóbulo ventral y dorsal de un hemi dando lugar a la medial y el lóbulo antenal tracto lateral (m-y l-ALT, anteriormente denominado m-y l-APT para medial y lateral protocerebral lóbulo antenal Tracto 15-17). Aquí una nueva terminología del tracto introducido por un esfuerzo reciente por una nomenclatura unificada del cerebro del insecto se utilizará 18. Ambos ALTs (l-y m-ALT) se combinan ya sea 410 (l-ALT) o 510 (m-ALT) proye uniglomerularneuronas cción (PN), respectivamente 15,16,19. PN de ambas vías han sido recientemente demostrado que los olores de código en paralelo 2 (para revisión ver 17,20), y las dos extensiones formar sinápticamente conexiones divergentes con células Kenyon (KC), el cuerpo de hongo (MB) neuronas principales. Cada MB contiene alrededor de 172.000 KC 21-23. El MBS se sabe que están implicados en la integración de estímulos, el aprendizaje y la formación de la memoria. Las dendritas axo de los KC forman el pedúnculo (tallo de la seta), que tiene dos regiones principales de salida: la vertica o alfa-lóbulo y la horizontal o beta-lóbulo 22,24. La salida de la MB converge a sólo alrededor de 400 neuronas extrínsecas (ES) 24. ENS responsable del procesamiento de la información olfativa inervan principalmente la cara ventral del lóbulo vertical 22. Recientemente, se ha demostrado que las EN grabados en esta área codifican la asociación olor recompensa 25.
Temporal comoaspectos dentro del sistema olfativo de los insectos, así como los vertebrados se han convertido en un aspecto importante y significativo como un principio potencial de codificación 26 a 29. Para ser capaz de grabar simultáneamente múltiples neuronas de diferentes sitios con alta resolución temporal, establecimos las técnicas de grabación de múltiples unidades dobles utilizando personalizadas varios electrodos de alambre canal introducidos a diferentes regiones de destino en el sistema olfativo de las abejas. Este enfoque nos permite analizar y comparar el procesamiento temporal en el sistema olfativo de abejas a nivel de las neuronas individuales y poblaciones de neuronas, ya sea entre las vías olfativas paralelas, la doble vía olfativa 2 o entre diferentes neuropils posteriores 1. Recientemente, con un enfoque experimental similar en el sistema olfativo de langostas 30 utilizando una configuración diferente de electrodos fueron capaces de analizar el mecanismo de codificación espacio-temporal de fondo-invariante olor reconocimiento 31. Thnosotros, las grabaciones duales establecidos permiten la recopilación de información espacial sobre los perfiles de actividad neuronal simultánea.
En comparación con el muestreo espacial más amplia obtenida a partir de imágenes de calcio este método permite la grabación de sólo dos puntos. Sin embargo, la ventaja en comparación con las técnicas de imagen de calcio es la alta precisión temporal del potencial de acción grabaciones, que no pueden ser provistos por cualquiera de imagen CCD convencional o de adquisición de imágenes 2-fotón. Los electrodos extracelulares que se describen aquí se implantan y se fijaron en relación con el cerebro y la cápsula de la cabeza evitando deriva de la sonda de forma permanente. Esta es una clara ventaja en comparación con el uso de electrodos intracelulares afilados. Otra de las ventajas en comparación con los registros intracelulares y de imágenes de calcio es el tiempo de observación neuronal extendida desde muchas horas hasta días. Este es un requisito previo importante para investigar correlatos neurales de aprendizaje y formación de la memoria. Los beneficios adicionales de múltiplesgrabaciones de la unidad se detallará en la sección de discusión.
En este panorama metodológico se muestra el procedimiento de fabricación de electrodos de alambre diseño personalizado, adaptado a partir de 32,33 y adecuado para las grabaciones de unidades múltiples a largo plazo en el cerebro de la abeja. Además, un ejemplo de cómo estos tipos de electrodos se implantan permanentemente en dos sitios diferentes de grabación dentro del sistema olfativo abeja para registrar simultáneamente la se muestra L-y el m-ALT durante largos períodos de tiempo para permitir que muchos protocolos de estimulación 2. Para la verificación de las posiciones de registro se proporciona un ejemplo y un protocolo para la tinción y grabación posterior visualización de los sitios de registro.
En este artículo se demuestra la producción y el uso de micro canal de cable-electrodos múltiples de diseño personalizado. Los electrodos descritos son adecuados para la grabación tanto de una sola unidad y la población que es especialmente útil para las mediciones de latencia y otras propiedades de respuesta temporales de diferentes neuronas y diferentes neuropils dentro de un único espécimen (para más detalles véase 1,2,25). Además hemos demostrado cómo implementar de forma permanente los electrodos micro alambre para permitir grabaciones estables a largo plazo en comportarse abejas que duran horas hasta días.
Grabaciones de varias unidades extracelulares se convirtieron en una herramienta favorable para lograr alta resolución temporal se combina con la información espacial. En nuestro caso, se trata de cualquiera de los tractos neuronales paralelos 2 o dos neuropils diferentes 1. Neuronas múltiples pueden ser registrados y analizados a nivel de la neurona individual en paralelo y con una alta resolución temporal. Record Multi-unitnes se aplicaron por primera vez en 38 mamíferos y más tarde también en los insectos 39-41. Progresos sustanciales se logró con el desarrollo y mejora de las técnicas de grabación de múltiples canales extracelulares 42,43. Esto, por ejemplo, incluye el desarrollo de nuevos electrodos 44 o novedosas de clasificación y clustering algoritmos espiga 45. Métodos generales de las técnicas de grabación extracelulares de múltiples unidades están bien descritos 46 – 48. Los auto construido electrodos que se muestran en este video, además, se pueden adaptar añadiendo más microhilos por electrodos o los cables micro se pueden torcer para ganar distancias constantes medibles entre las puntas. Ambos procedimientos serían, sin embargo, conducir a la disminución de la flexibilidad y el aumento del espesor del electrodo.
En comparación con las sondas de silicona de uso general para las grabaciones extracelulares en los insectos mucho más grandes, como la polilla halcón, langostas y cucarachas 40,49 – </sup> 51 los cables-electrodos micro descritos son más pequeñas, flexibles y pueden fácilmente hacer frente a los posibles movimientos del cerebro y, por lo tanto, pueden ser utilizados de forma fiable en pequeños insectos sociales como las abejas y las hormigas que muestran un repertorio conductual más amplio. La mayoría de las sondas de silicona tienen agudo vástago como las estructuras de corte axones y tejido neural a lo largo de su canal de inserción, mientras que los cables de micro descritos son redondos, flexible y más pequeño y por lo tanto son menos perjudiciales para el tejido circundante que es una clara ventaja si el objetivo es estudiar a largo plasticidad plazo en un animal intacto y de comportarse. Otra ventaja de los electrodos micro alambre es su producción de bajo costo y fácil manejo. En lugar de limpiar cuidadosamente una sonda de silicona caro los hilos de los electrodos están recién cortados antes de la inserción del cerebro y, por lo tanto, los problemas de falta de congestión. Además es posible utilizar más de un micro electrodo de alambre en la misma preparación, ya sea insertado en diferentes neuropiles 1 Otractos r 2, como se muestra aquí. Este enfoque es especialmente favorable para analizar y comparar los aspectos temporales como las latencias de respuesta y de las interacciones de diferentes niveles de procesamiento neural.
Somos conscientes del hecho de que una señal grabada extracelular no refleja la actividad de células individuales per se. Siempre es un compuesto de la actividad de tensión alrededor de la punta del electrodo. Para identificar la fuente de la señal de la diferencia de dos canales de cable micro vecinos, dentro de un electrodo se calcula siempre. Así, la fuente de las señales de espiga se utilizan para extraer la actividad de una sola unidad era siempre muy cerca de uno u otro canal de electrodo que resulta en formas de onda de pico fácilmente distinguibles. Las señales procedentes de más lejos, al igual que la actividad muscular o la actividad de neuropils vecinos, alcanzan ambos electrodos al mismo tiempo que evoca formas y amplitudes comparables y serán descartados por este procedimiento. Utilizando la técnica de emparejamiento de plantillas de Spike2,estamos muy seguros de obtener la actividad de una sola unidad, lo que no es el mismo, pero muy cerca de la actividad neuronal única. Sin embargo, la cuestión de la clasificación pico podría evitarse mediante el uso de técnicas de grabación intracelulares.
Registros de células individuales, ya sea con electrodos afilados o pipetas de parche permiten profundo conocimiento acerca de las propiedades fisiológicas de una sola neurona. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de las neuronas del insecto y sus neuritas (p. ej., A menos de 1 m para la abeja PN 52) grabaciones sólo a corto plazo son manejables. Además, las grabaciones intracelulares podrían ser invasiva y podría dañar a la célula que es, posiblemente, otra de las razones para las limitaciones temporales. En vivo registros intracelulares en insectos rara vez duran más de una hora. Una ventana de tiempo que fue suficiente para que el trabajo pionero de Martin Hammer 53 que grabó intracelular de una sola neurona identificado, el ventral no apareado neurona maxilar # 1 (VUMmx1). Podía ltinta su actividad directamente al circuito de recompensa. Juliane Mauelshagen 54 registrado intracelularmente la actividad de una seta cuerpo extrínseca neurona identificado, la Pedunculus neurona extrínseca # 1 (PE1) durante el condicionamiento clásico. La misma neurona estaba en el foco de Menzel y Manz 55 cuando encontraron LTP después de la estimulación eléctrica de las células de Kenyon. Sin embargo, Okada y sus colegas 56 podrían utilizar el patrón de clavar intracelularmente bien caracterizado (picos dobles y triples) para la identificación de la PE1 durante las grabaciones extracelulares. Después de todo, una combinación de ambos métodos, registros intracelulares de las neuronas identificadas y grabaciones extracelulares de largo plazo podrían ser una poderosa herramienta para las investigaciones futuras.
Sin embargo, el uso de electrodos afilados para grabar varias celdas (unidades) de manera simultánea en los diferentes niveles de procesamiento de más de varias horas hasta días para analizar sus relaciones de respuesta temporal y / o incluso cambios plásticos is casi imposible.
Con la primera imagen de calcio se acerca en la abeja 57,58 usando colorantes sensibles al calcio el análisis de los patrones espaciales de las respuestas de olor eran accesibles 59-62. Sin embargo, en muchos casos, los colorantes sensibles al calcio tienen que ser introducido en el tejido cerebral a través de manipulaciones invasivas que de nuevo limitan duración de la vida de las abejas y las propiedades intrínsecas de las células analizadas. Este problema se soluciona en otros organismos modelo como la mosca de la fruta utilizando sensores de calcio introducidas genéticamente 63,64. Sin embargo, en general, sensores de calcio pueden introducir otras limitaciones, ya que pueden actuar como tampones de calcio que probablemente influyen en las propiedades temporales de las respuestas de olor. Registros intracelulares simultáneos combinados con imágenes de calcio o enfoques computacionales pueden probar la resolución temporal adecuada de imágenes procesa 65,66. Sin embargo, la resolución temporal del proceso de formación de imágenes en sí es RatheR limitada. Sistemas de adquisición ópticos suelen utilizar CCD de imágenes con una resolución temporal de 5-20 Hz 67, aunque 2-Photon-Imaging podría ser capaz de adquirir las secuencias más rápidas 68. Sin embargo, el aumento de la frecuencia de muestreo siempre va de la mano con una pérdida de resolución espacial. Además, los colorantes sensibles al calcio utilizados en la abeja se someten a la decoloración, que también reduce el tiempo de adquisición 69.
En comparación con otras técnicas de grabación fisiológicos en los insectos nuestros multicanal electrodos micro hilos flexibles aseguran un acceso de largo plazo a la unidad y la población de la actividad neuronal en comportarse abejas.
Demostramos cómo usar dos de estos electrodos en diferentes etapas de procesamiento en el mismo animal, lo que facilita el análisis de los aspectos de codificación temporales entre los diferentes sitios de registro. Dependiendo del problema de la investigación y el modelo de insecto el método básico de construcción de electrodo demostrado aquí se extienden fácilmentepoder y / o se puede adaptar. Por ejemplo, es concebible utilizar más de los tres cables individuales para producir electrodos multicanal. Además, el número de sitios de grabación puede ser ampliado y la observación de aspectos temporales de más de dos secciones o neuropils es factible. Nuestra esperanza es que este método va a inspirar a muchos científicos y contribuirá positivamente a la comprensión del procesamiento neuronal sofisticada en pequeños cerebros.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |