Samtidiga cellulära långsiktiga inspelningar från två olika hjärn neuropiles eller två olika anatomiska områden etablerades honungsbin. Dessa inspelningar tillåter undersökning av tidsmässiga aspekter av neuronal bearbetning i olika områden i hjärnan på den enda neuron samt på ensemblen nivå i en beter djur.
I både däggdjur och insekter neuronal information bearbetas i olika högre och lägre ordning centra i hjärnan. Dessa centra är kopplade via konvergerande och divergerande anatomiska anslutningar inklusive foder framåt och feedback ledningar. Vidare information av samma ursprung delvis skickas via parallella vägar till olika och ibland i samma områden i hjärnan. För att förstå de evolutionära fördelar och de beräknings fördelarna med dessa ledningsstrategier och särskilt deras tidsmässiga beroenden av varandra, är det nödvändigt att ha samtidig tillgång till enstaka nervceller i olika skrifter eller neuropiles i samma beredning med hög tidsupplösning. Här koncentrerar vi oss på honungsbin genom att visa en unik cellulära långsiktig tillgång för att spela in flera enheter aktivitet vid två efterföljande neuropiles 1, den Antenn lob (AL), den första luktbehandlingssteg och svampkroppen (MB), en högre ordning integrationscenter ofrilved i inlärning och minnesbildning, eller två parallella neuronala trakter 2 anslut AL med MB. Det senare valdes som ett exempel och kommer att beskrivas i sin helhet. I stöd video bygg och permanent införande av flexibla flerkanaltrådelektroder demonstreras. Parvis differentiell amplifiering av mikro trådelektroden kanaler drastiskt reducerar bruset och verifierar att källan för den signal som är nära relaterad till läget för elektrodspetsen. Den mekaniska flexibilitet de använda trådelektroder medger stabila invasiva långsiktiga inspelningar under flera timmar upp till dagar, vilket är en klar fördel jämfört med konventionella extra-och intracellulära in vivo inspelningsteknik.
Honungsbin liksom de flesta andra insekter är starkt beroende av luktsystemet. Bland annat de använder lukt ledtrådar för orientering, parning, kommunikation med artfränder, och födosök. Deras väl utarbetade luktsystem bidrar till en rik repertoar av inlärnings beteenden relaterade till blomster lukt stimuli. Dessa beteenden kan enkelt studeras under kontrollerade laboratorieförhållanden (för en översikt se 3 – 5). Deras "mini hjärnor" (jämför 6) med deras relativt litet antal nervceller gör att honungsbinas en väl anpassad modell organism för att studera lukt kodning och lärande under övervakning av neural aktivitet.
Luktsinnet hos insekter och i däggdjur visar motsvarande organisation i stor utsträckning (för översikt se 7,8). I honungsbin omkring 80.000 receptor nervceller 9 belägna i sensillae längs antenner 10,11 översätter miljö lukt stimulans till ett neuronal signal. Axoner från luktreceptor nervceller innerverar Antenn lob (AL), som har en glomerulär organisation jämförbar med den vertebrat luktloben. AL omfattar cirka 164 glomeruli är sammankopplade med varandra med ca 4.000 lokala intern (LN) (för översikt se 12). Särskilt i honeybee det har visats nyligen att LNS åstadkomma fläckvis lateral anslutning och att olika subpopulationer besitter grundämnen och configural olfactory kodningsegenskaper 13,14. AL visade sig delas upp i en ventrala och dorsala hemi lob som ger upphov till den mediala och den laterala Antenn lob-tarmkanalen (m-och l-ALT, tidigare benämnt m-och l-APT för medial-och lateral Antenn lob protocerebral skriftar 15 – 17). Här en ny vägarna terminologi införs genom en ny insats för en enhetlig nomenklatur för insekten hjärnan kommer att användas 18. Båda alts (l-och m-ALAT) kombinera antingen 410 (l-ALAT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular projection neuroner (PN), respektive 15,16,19. PNS i båda områden har nyligen visats kod lukter parallellt 2 (för översikt se 17,20), och båda skrifter synaptically bilda olika anslutningar med Kenyon Cells (KC), svamp kropp (MB) huvudsakliga nervceller. Varje MB innehåller ca 172.000 KCS 21-23. MBS är kända för att vara inblandade i stimulans integration, inlärning och minnesbildning. AXO dendriter av KCS bildar stjälk (svamp stäv), som har två huvudsakliga utgångs regioner: Vertica eller alfa-loben och den horisontella eller beta-lob 22,24. Utsignalen från MB konvergerar till endast cirka 400 yttre neuroner (SV) 24. ENS ansvarig för luktinformationsbehandling oftast innerverar den ventrala aspekten av vertikala loben 22. Nyligen har det visats att undersköterskor inspelade på detta område koda lukten belöning föreningen 25.
Temporal somaspekter inom luktsinnet av insekter samt ryggradsdjur har blivit en viktig och betydelsefull aspekt som en potentiell princip kodning 26 – 29. För att samtidigt spela in flera nervceller från olika platser med hög tidsupplösning, etablerade vi dubbla multi enhet inspelningsteknik i kundanpassade flerkanalstrådelektroder infördes till olika målområden i biets luktsystemet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att analysera och jämföra temporal behandling i honungsbinas luktsystemet i nivå med enskilda nervceller och populationer av nervceller, antingen mellan parallella lukt vägar, den dubbla luktvägen 2 eller mellan olika efterföljande neuropils 1. Nyligen med en liknande experimentell metod i gräshoppor luktsystemet 30 med en annan utformning av elektroder kunde analysera spatiotemporal kodningsmekanism för bakgrund-invariant luktigenkänning 31. Thoss, de etablerade dubbla inspelningar möjliggör insamling av geografisk information om samtidiga neuronala aktivitetsprofiler.
Jämfört med den bredare rumsliga provtagning erhålls från kalcium avbildning denna metod medger inspelning från endast två fläckar. Dock är fördelen jämfört med kalcium avbildningstekniker för hög tidsprecision åtgärds potentiella inspelningar som inte kan tillhandahållas av antingen konventionell CCD-avbildning eller 2-photon imaging förvärv. De extracellulära elektroder som beskrivs här är permanent implanterade och fast förhållande till hjärnan och huvudet kapsel undvika elektrodglidning. Detta är en klar fördel jämfört med användningen av skarpa intracellulära elektroder. En annan fördel jämfört med intracellulära inspelningar och kalcium avbildning är den förlängda tiden neurala observation allt från flera timmar upp till dagar. Detta är en viktig förutsättning för att undersöka neurala korrelat till inlärning och minnesbildning. Ytterligare fördelar med multienhets inspelningar vidare beskrivs i diskussionsavsnittet.
I denna metod översikt tillverkningsförfarandet av egen design trådelektroder kommer att visas, anpassad från 32,33 och lämpade för långsiktiga multi enhet inspelningar i honungsbinas hjärnan. Dessutom, ett exempel på hur dessa typer av elektroder är permanent implanteras vid två olika inspelningsplatser inom honungsbinas luktsinne för att spela in samtidigt på l-och m-ALT under lång tid så att många stimuleringsprotokoll visas 2. För kontroll av inspelningspositioner ett exempel och protokoll för färgning och efterinspelning visualisering av inspelningsplatser finns.
Denna artikel visar att produktion och användning av kundanpassade flerkanalmikrotrådelektroder. De beskrivna elektroderna kan användas för att spela in både enhet och befolkningsfrågor, som är speciellt användbart för latency mätningar och andra temporala respons egenskaper hos olika nervceller och olika neuropils inom ett enda exemplar (för detaljer se 1,2,25). Vi har dessutom visat hur permanent att genomföra mikrotrådelektroder för att möjliggöra stabila långsiktiga inspelningar i beter honungsbin som varar i flera timmar upp till dagar.
Cellulära flera enheter inspelningar blev positivt verktyg för att uppnå hög tidsupplösning i kombination med geografisk information. I vårt fall, dessa är antingen parallella neuronala trakter 2 eller två olika neuropils 1. Flera nervceller kan spelas in och analyseras på den enda neuron nivån parallellt och med hög tidsupplösning. Flerenhetens registerningar tillämpades först i däggdjur 38 och senare även i insekter 39-41. Betydande framsteg har gjorts med att utveckla och förbättra cellulära flerkanalsinspelningstekniker 42,43. Detta, till exempel, omfattar utveckling av nya elektroder 44 eller nya spik sorterings-och klusteralgoritmer 45. Generella metoder för cellulära multi-unit inspelningstekniker är väl beskrivna 46-48. De själv byggt elektroderna som visas i denna video dessutom kan anpassas genom att lägga till fler microwires per elektrod eller mikrotrådarna kan tvinnas för att få mätbara konstant avstånd mellan spetsarna. Båda förfarandena skulle emellertid leda till minskande flexibilitet och ökar tjockleken på elektroden.
Jämfört med kisel sonder som vanligen används för extracellulära inspelningar i mycket större insekter som höken mal, gräshoppor och kackerlacka 40,49 – </sup> 51 de beskrivna mikrotrådelektroder är mindre, flexibla och klarar lätt med potentiella hjärnrörelser och därmed kan användas på ett tillförlitligt sätt i små sociala insekter som bin och myror som visar en mycket bredare beteenderepertoar. De flesta silikon sonder har skarpa skaft liknande strukturer skär axoner och nervvävnad längs deras insättningskanalen, medan de beskrivna mikrotrådarna är runda, flexibla och mindre och är därmed mindre skadliga för den omgivande vävnaden vilket är en klar fördel om målet är att studera lång variga plasticitet i en intakt och beter djur. En annan fördel med mikrotrådelektroder är deras låga tillverkningskostnad och enkel hantering. Istället för att noggrant rengöra en dyr silikon sond elektrodkablar är nyklippt före hjärn insättning och därmed saknar problemen med trafikstockningar. Vidare är det möjligt att använda mer än en mikro trådelektroden i samma beredning antingen införas i olika neuropiles 1 or kontrakt 2 som vi visar här. Detta tillvägagångssätt är särskilt gynnsamt att analysera och jämföra tidsmässiga aspekter som respons latenser och interaktioner på olika neurala behandlingsnivåer.
Vi är medvetna om det faktum att en extracellulär inspelade signalen inte återspeglar enda cell aktivitet per se. Det är alltid en förening med spännings aktivitet runt elektrodspetsen. För att lokalisera källan till signalen skillnaden mellan två intilliggande mikrokabelkanaler inom en elektrod är alltid beräknas. Således källan för spik signaler som används för att extrahera enda enhet aktivitet var alltid mycket nära till antingen ett eller det andra elektrodkanal vilket resulterar i lätt urskiljbara spik vågformer. Signaler från längre bort, liksom muskelaktivitet eller aktivitet av grann neuropils, når båda elektroderna samtidigt frammana jämförbara former och amplituder och kommer att förkastas av detta förfarande. Använda mallmatchningsteknik i Spike2,Vi är övertygade om att erhålla enhet aktivitet, vilket inte är samma sak, men mycket nära enda neuron aktivitet. Däremot kan frågan om spik sortering undvikas genom att använda intracellulära inspelningsteknik.
Encelliga inspelningar med antingen vassa elektroder eller patch pipetter tillåter fördjupad kunskap om fysiologiska egenskaperna hos ett enda neuron. Men på grund av den begränsade storleken på insekts nervceller och deras neurites (t ex., Mindre än 1 mikrometer för honungsbinas PN 52) endast kortsiktiga inspelningar är hanterbara. Dessutom kan intra cellulära inspelningar vara invasiva och kan skada cellen som är möjligen en annan orsak till de tidsmässiga begränsningar. In vivo intracellulära inspelningar i insekter sällan överleva en timme. Ett tidsfönster som var tillräcklig för det banbrytande arbetet av Martin Hammer 53 som spelade in intracellulär från ett enda identifierat neuron, den ventrala oparade maxilar neuron # 1 (VUMmx1). Han kunde lbläck sin verksamhet direkt till belöningen vägen. Juliane Mauelshagen 54 registrerade intracellulärt aktiviteten hos en identifierad svampkroppen extrinsic neuron, den pedunculus extrinsic neuron # 1 (PE1) under klassisk betingning. Samma neuron var i fokus för Menzel och Manz 55 när de hittade LTP efter elektrisk stimulering av Kenyon celler. Men Okada och kollegor 56 kunde använda intracellulärt väl karakteriserade tillsatta mönster (dubbla och tredubbla spikar) för identifiering av PE1 under extracellulära inspelningar. När allt en kombination av båda metoderna, kan intracellulära inspelningar från identifierade nervceller och extracellulära långsiktiga inspelningar vara ett kraftfullt verktyg för framtida undersökningar.
Men med hjälp av vassa elektroder för att spela in flera celler (enheter) samtidigt på olika förädlingsnivåer under flera timmar upp till dagar att analysera sina tidsresponssamband och / eller till och med plast förändringar iär nästan omöjligt.
Med den första kalcium avbildning i den honungsbinas 57,58 med hjälp av kalciumkänsliga färgämnen analys av rumsliga mönster av lukt svar var tillgänglig 59-62. Men i många fall kalciumkänsliga färgämnena måste införas för att hjärnvävnaden via invasiva manipulationer som återigen begränsar biets livslängd och inneboende egenskaper hos de analyserade cellerna. Denna fråga övervinns i andra modellorganismer som den fruktflugan använda genetiskt införda kalciumsensorer 63,64. Men i allmänhet kan kalcium sensorer införa andra begränsningar, eftersom de kan fungera som kalcium buffertar som sannolikt påverkar den tidsmässiga egenskaper luktsvar. Samtidiga intracellulära inspelningar i kombination med kalcium avbildning eller computational metoder kan visa den rätta tidsupplösning av avbildning processer 65,66. Emellertid är den temporala upplösningen av avbildningsprocessen rather begränsad. Optiska förvärvs system använder oftast CCD-avbildning med en tidsupplösning av 5-20 Hz 67, även om 2-Photon-Imaging skulle kunna skaffa snabbare sekvenser 68. Dock går ökar samplingshastigheten alltid tillsammans med en förlust i rumslig upplösning. Dessutom kalciumkänsliga färgämnen som används i honungsbinas genomgår blekning, vilket också minskar anskaffningstiden 69.
Jämfört med andra fysiologiska inspelningstekniker i insekter våra flexibla flerkanals mikrotrådelektroder säkerställa lång tid tillgång till enhet och befolkning neuronal aktivitet i beter bin.
Vi visade hur man använder två av dessa elektroder i olika skeden bearbetning i samma djur, vilket underlättar analysen av tidskodnings aspekter mellan de olika inspelningsplatser. Beroende på forskningsproblem och modellen insekt den grundläggande metoden för elektrod byggnad visade här är enkelt utökastånd och / eller kan anpassas. Till exempel är det tänkbart att använda fler än de tre separata ledare för att producera flerkanalelektroderna. Dessutom kan antalet inspelningsplatser förlängas och observera timliga aspekter av mer än två områden eller neuropils är genomförbart. Vår förhoppning är att denna metod kommer att inspirera många forskare och kommer att bidra positivt till förståelsen av avancerade neuronal bearbetning i små hjärnor.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |