İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.
Memeliler ve böcekler hem de nöronal bilgiler farklı yüksek ve düşük seviyede beyin merkezlerinde işlenir. Bu merkezler yakınsak ve ileri besleme ve geri besleme kabloları dahil olmak üzere farklı anatomik bağlantıları yoluyla birleştirilir. Ayrıca, aynı menşe bilgisi kısmen farklı ve bazen aynı beyin alanlara paralel yollar aracılığıyla gönderilir. Bu kablo stratejileri ve birbirlerine özellikle geçici bağımlılıkları evrimsel yararları yanı sıra sayısal avantajları anlamak için, bu yüksek zamansal çözünürlükte Aynı müstahzar içindeki değişik yolları veya neuropiles tek nöron eş zamanlı erişim için gereklidir. Burada iki müteakip neuropiles 1, antennal lobun (AL), ilk koku işleme aşamasında ve mantar gövdesinin (MB), daha yüksek dereceden entegrasyon merkezi invo multi ünite aktivitesini kaydetmek için eşsiz bir hücre dışı uzun süreli erişim göstererek bal arıları üzerinde yoğunlaşmaköğrenme ve bellek oluşumu, ya da MB ile AL bağlayacak iki paralel nöronal yolları 2 lved. Ikinci bir örnek olarak seçilmiştir ve tam bir şekilde tarif edilecektir. Destekleyen video inşaat ve esnek çok kanallı teli kalıcı ekleme gösterilmiştir. Mikro telidir kanalları İkili diferansiyel amplifikasyon ölçüde gürültüyü azaltır ve sinyalin kaynak yakın elektrot ucunun konumu ile ilişkili olduğunu doğrular. Kullanılan tel elektrotlar mekanik esneklik sağlar: istikrarlı, uzun vadeli invazif kayıtlar çok saat boyunca, geleneksel olarak ilave ve hücre içi vivo kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında açık bir avantaj olan gün kadar.
Bal arısı gibi diğer birçok böcekler ağır olfaction güveniyor. Diğerlerinin arasında bu yönelim, çiftleşme, conspecifics ile iletişim ve yiyecek aramak için koku ipuçlarını kullanın. Onların iyi oluşturulmamıştır koku sistemi çiçek koku uyanlarla ilişkili öğrenme davranışları zengin bir repertuar katkıda bulunmaktadır. (- 5 incelemesi 3 bakınız) Bu davranışlar kolayca kontrollü laboratuvar koşullarında ele alınabilir. Nöron nispeten küçük numaralar ile onların "mini beyinleri" (krş. 6) balarısı koku kodlama eğitim ve nöral aktivitenin izlenmesi sırasında öğrenme için de uygun bir model organizma yapar.
Böcekler hem de memelilerde koku alma sistemi (7,8 inceleme için bakınız) büyük ölçüde benzer organizasyonunu göstermektedir. Bal arılarında yılında anten 10,11 boyunca sensillae bulunan yaklaşık 80.000 reseptör nöronlar 9 neur içine çevre koku uyaran çevirmekÖnal sinyali. Olfaktör reseptör nöronlardan gelen aksonlar omurgalı koku ampul karşılaştırılabilir bir glomerüler organizasyona sahiptir antennal lobu (AL), innerve. AL 4000 yerel internöronlar (LN) ile birbirleri ile bağlantılı yaklaşık 164 glomerül içerir (inceleme için 12). Özellikle balarısı o LN yamalı yanal bağlantı sağlamak ve farklı subpopülasyonunun element ve configural koku kodlama özelliklere 13,14 sahip olduğu son zamanlarda kanıtlanmıştır. AL medial ve lateral antennal lob yolu (m-ve l-ALT sebebiyet veren bir ventral ve dorsal hemi lobun bölünerek gösterilmiştir; eskiden m-ve medial-lateral antennal lob protocerebral l-APT olarak adlandırılan ) 15-17 cezbet. İşte böcek beynin bir birleşik adlandırılması için yeni bir çaba tarafından tanıtılan yeni bir sistem terminoloji 18 kullanılacaktır. Her iki ALT basılı (l-ve m-ALT) 410 (l-ALT) veya 510 (m-ALT) uniglomerular Proje ya da kombinection nöronlar (PN), sırasıyla 15,16,19. Her iki yollarında PNS son zamanlarda (inceleme için 17,20 bakınız) paralel 2 kod koku gösterilmiştir ve hem yolları synaptically Kenyon Hücreleri (KC), mantar gövde (MB) anapara nöronlar ile farklı bağlantıları oluşturur. 23 – Her MB yaklaşık 172.000 kcs 21 içerir. MB uyarıcı entegrasyon, öğrenme ve hafıza oluşumunda rol oynadığı bilinmektedir. Vertica veya alfa-lob ve yatay veya beta-lob 22,24: keratinosit karsinom axo dentritler iki ana çıkış bölgeleri var pedinkülde (mantar kök) oluşturur. MB çıkışı sadece yaklaşık 400 dış nöronların (EN) 24 yakınlaşıyor. Koku bilgi işleme sorumlu çoğunlukla dikey lobun 22 ventral innerve ens. Son zamanlarda, bu alanda kaydedilen Ens'i koku ödül ilişki 25 kodlayan gösterilmiştir.
Olarak Temporal29 – böcekler gibi omurgalıların koku alma sistemi içinde cevapların dağılımı potansiyel kodlama ilke 26 gibi önemli ve anlamlı bir yönü haline gelmiştir. Aynı anda yüksek temporal çözünürlük farklı sitelerden birden nöronlar kayıt yapabilmek için, biz arı koku sisteminde farklı hedef bölgelere tanıtıldı özelleştirilmiş çok kanallı tel elektrotlar kullanılarak çift çoklu birim kayıt tekniklerini kurulmuştur. Bu yaklaşım tek nöronların ve ya paralel koku yolları, ikili koku yolunun 2 veya farklı sonraki neuropils 1 arasında var nöronların popülasyonlarının düzeyinde balarısı koku sisteminde zamansal işleme, analiz ve karşılaştırma için bize sağlar. Son zamanlarda elektrotlar farklı bir yapılandırma kullanarak çekirge koku alma sistemi 30 benzer bir deneysel yaklaşım ile plan-değişmeyen koku tanıma 31 için zamanmekansal kodlama mekanizmasını analiz başardık. ThBize, kurulan ikili kayıtları eşzamanlı nöronal aktivite profilleri hakkında mekansal bilgi toplama etkinleştirin.
Kalsiyum görüntüleme elde geniş uzamsal örnekleme göre bu yöntem sadece iki noktalar kaydedilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalsiyum görüntüleme tekniklerine göre avantajı ise, geleneksel CCD görüntüleme ya da 2-ya da foton görüntüleme satın tarafından temin edilemeyen bir eylem potansiyeli kayıtlarında, yüksek zamansal hassas olduğunu. Burada tarif edilen hücre dışı bir sürekli olarak implante elektrotlar ve elektrot sürüklenme kaçınarak, beyin ve kafa kapsül göre sabitlenir. Bu keskin hücre içi elektrotların kullanımı ile karşılaştırıldığında açık bir avantajdır. Hücre içi kalsiyum kayıtları ve görüntüleme kıyasla diğer bir avantajı, çok saatler güne kadar değişen uzun bir gözlem sinir zamandır. Bu öğrenme ve bellek oluşumu sinirsel araştırmak için önemli bir ön koşuldur. Çok ek faydalarbirim kayıtları ayrıca tartışma bölümünde özetlenmiştir.
Bu metodolojik genel olarak özel tasarım tel elektrotlar imalat prosedürü, gösterilir 32,33 uyarlanan ve balarısı beyinde uzun süreli çoklu birim kayıtları için uygundur. Buna ek olarak, bu tür elektrotların sürekli olarak aynı anda kaydetmek üzere bal arısı koku alma sistemi içinde iki farklı kaydına implante nasıl bir örnek L-ve çok stimülasyon protokolleri izin vermek için, uzun süre boyunca m-ALT 2 gösterilmiştir. Kayıt pozisyonların doğrulanması için kayıt sitelerin boyama ve sonrası kayıt görselleştirme için bir örnek ve protokol sağlanır.
Bu makalede, üretim ve özel tasarlanmış çok kanallı mikro tel elektrotların kullanımını gösterir. Tarif edilen elektrotlar bir birim ve (ayrıntılar için bkz 1,2,25) bir numune içinde gecikme ölçümleri ve farklı nöron ve farklı neuropils diğer geçici yanıt özellikleri için özellikle yararlıdır nüfus aktivitesini kayıt için uygundur. Ayrıca biz kalıcı güne kadar saat sürecek bal arıları davranıyor istikrarlı, uzun süreli kayıtları izin mikro tel elektrotları nasıl uygulanacağını göstermiştir.
Ekstrasellüler çoklu birim kayıtları mekansal bilgi ile birlikte yüksek zamansal çözünürlük elde etmek için olumlu bir araç haline geldi. Bizim durumumuzda, bu paralel nöronal yolları 2 ya da iki farklı neuropils 1. ya vardır. Çoklu nöronlar paralel tek nöron düzeyinde ve yüksek zamansal çözünürlükte kayıt ve analiz edilebilir. Çoklu-birim rekor41 – bulgular ilk böceklerin 39 da daha sonra memelilerde 38 uygulandı ve edilmiştir. Önemli ilerleme dışı çoklu kanal kayıt teknikleri 42,43 geliştirilmesi ve iyileştirilmesi ile elde edilmiştir. Bu, örneğin, yeni elektrotlar 44 veya roman başak sıralama ve kümeleme algoritmaları 45 geliştirme içerir. 48 – hücre-dışı çok üniteli bir kayıt teknikleri genel yöntemler de 46 tarif edilmiştir. Bu videoda gösterilen kendini inşa elektrotlar ayrıca daha elektrot başına microwires veya mikro teller uçları arasındaki ölçülebilir sürekli mesafeleri kazanmak için bükülmüş olabilir ekleyerek adapte edilebilir. Her iki prosedür, ancak, esneklik azaltılması ve elektrot kalınlığı artan yol açacaktır.
Yaygın şahin güve, keçiboynuzu ve hamamböceği 40,49 gibi çok daha büyük böcekler dışı kayıtlar için kullanılan silikon sondalar karşılaştırıldığında – </sup> 51 tarif edilen mikro tel elektrotlar esnek, daha küçük olan ve potansiyel beyin hareketleri ile kolayca başa çıkabilir ve bu nedenle, güvenilir bir şekilde daha geniş bir davranış gösterir repertuar arı ve karıncalar gibi küçük sosyal böceklerde kullanılabilir. Tanımlanan mikro teller, yuvarlak esnek ve daha küçük ve hedefi uzun çalışma için ise açık bir avantajdır çevredeki dokuya dolayısıyla daha az zararlı iken çoğu silikon sondalar, onların ekleme kanal boyunca akson ve sinir dokusunun kesilmesi gibi yapıları keskin incik var bir sağlam ve davranışlar hayvan vadeli plastisite. Mikro tel elektrotlar diğer bir avantajı da düşük maliyetli üretim ve kolay kullanımıdır. Bunun yerine dikkatle pahalı silikon sonda temizlik elektrot telleri taze, bu nedenle tıkanıklık olmaması sorunları önce beyin ekleme için kesilir ve. Bundan başka, her iki farklı neuropiles 1 o eklenen aynı hazırlanmasında birden fazla mikro tel elektrot kullanmak mümkündürr yolları 2 biz burada göstermek gibi. Bu yaklaşım, farklı nöral işleme düzeylerde tepki gecikmeleri ve etkileşimler gibi zamansal yönlerini analiz etmek ve karşılaştırmak için özellikle olumludur.
Biz bir hücre dışı kayıtlı sinyal başına tek hücre aktivitesini yansıtmadığını bilincindeyiz. Her zaman, elektrot ucu etrafında gerilim etkinliğinin bir bileşiktir. Bir elektrot içinde iki komşu kablo mikro kanallar fark her zaman hesaplanan sinyalinin kaynağını tam olarak belirlemek için. Böylece tek ünite aktivitesini ayıklamak için kullanılan başak sinyalleri için kaynak her zaman bir ya da kolayca ayırt başak dalga şekilleri sonuçlanan diğer elektrot kanala ya da çok yakındı. Uzağa gelen sinyaller, komşu neuropils kas aktivitesi veya etkinlik gibi, karşılaştırılabilir şekilleri ve genlikleri çağrıştıran, aynı anda hem elektrotlar ulaşmak ve bu prosedür ile atılır. Spike2 şablon uygun teknik kullanılarak,Biz aynı değildir tek ünite aktivitesini elde etmek çok emin, ama tek bir nöron aktivitesi için çok yakındır. Ancak, başak sıralama sorunu hücre içi kayıt teknikleri kullanılarak önlenebilir.
Keskin elektrotlar veya yama pipet ile ya tek hücre kayıtları, tek bir nöronun fizyolojik özellikleri hakkında derinlemesine bilgi sağlar. Bununla birlikte, küçük bir böcek nöronların büyüklüğü ve nöritlere (arı PNS 52 için, örneğin., En az 1 um), sadece kısa vadeli kayıtları yönetilebilir. Ayrıca, hücre içi kayıtları invaziv olabilir ve muhtemelen zamansal sınırlamalar için bir başka nedendir hücreyi zarar olabilir. Böceklerde in vivo hücre içi kayıtları nadiren bir saat dayanmak. Tek bir tespit nöronun, ventral çiftleşmemiş maxilar nöron # 1 (VUMmx1) dan hücre içi kaydedilen Martin Hammer 53 öncü çalışmaları için yeterli bir zaman penceresi. O l olabilirdoğrudan ödül yoluna mürekkep aktivitesini. Juliane Mauelshagen 54 hücre bir tespit mantar vücut dış nöron aktivitesini kayıtlı, klasik koşullanma sırasında pedunculus dış nöron # 1 (PE1). Onlar Kenyon Hücreler elektriksel stimülasyon sonra LTP bulduğumda aynı nöron Menzel ve Manz 55 odağı oldu. Ancak, Okada ve arkadaşları 56 ekstraselüler kayıtlar sırasında Pe1 tanımlanması için hücre iyi karakterize spike desen (çift ve üçlü ani) kullanabilirsiniz. Her iki yöntemin her bir kombinasyonundan sonra tespit nöronlar ve dışı uzun süreli kayıtlar hücre içi kayıtları gelecekteki araştırmalar için güçlü bir araç olabilir.
Ancak, zamansal tepki ilişkileri ve / veya hatta plastik değişiklikleri analiz etmek güne kadar birçok saat boyunca farklı işleme seviyelerde aynı anda birden fazla hücre (adet) kaydetmek için keskin elektrotlar kullanan ineredeyse imkansız.
62 – ilk kalsiyum görüntüleme kalsiyum duyarlı boyalar kullanarak balarısı 57,58 yaklaşımları ile koku yanıtların mekansal desen analizi 59. erişilebilir. Ancak, birçok durumda kalsiyum duyarlı boyalar tekrar arının ömrü ve analiz hücrelerin içsel özellikleri sınırı invaziv manipülasyonlar yoluyla beyin dokusu tanıtılacak olması. Bu sorun, genetik tanıtıldı kalsiyum sensörleri 63,64 kullanarak meyve sineği gibi diğer model organizmalar aşılır. Büyük olasılıkla koku tepkilerin geçici özelliklerini etkileyen kalsiyum tampon olarak hareket edebilir Ancak, genel olarak, kalsiyum algılayıcılar başka sınırlamalar taşıyabilirler. Kalsiyum görüntüleme veya hesaplamalı yaklaşımlar ile birlikte eşzamanlı hücre içi kayıtları görüntüleme uygun zamansal çözünürlük 65,66 işler kanıtlayabilirim. Bununla birlikte, görüntüleme işlemi kendi zamansal çözünürlüğü olan rather sınırlıdır. 2-Foton-Görüntüleme hızlı dizileri 68 elde etmek mümkün olabilir ancak optik toplama sistemleri genellikle, 5-20 Hz 67 bir zamansal çözünürlüğe sahip CCD-görüntüleme kullanın. Ancak, artan örnekleme oranı her zaman uzamsal çözünürlük kaybı ile birlikte gider. Ayrıca honeybee kullanılan kalsiyuma duyarlı boyalar da elde etme süresi 69 azaltan ağartma, geçer.
Böceklerde diğer fizyolojik kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında bizim esnek çoklu-kanal mikro-tel elektrotlar tek ünite ve arılar davranıyor nüfus nöronal aktivitenin uzun süre erişim sağlamak.
Biz farklı kayıt siteler arasında zamansal kodlama yönlerinin analizini kolaylaştırır aynı hayvan, farklı işleme aşamalarında bu elektrotların ikisini nasıl kullanılacağını gösterdi. Araştırma sorunu ve burada gösterdiği elektrot binanın temel yöntemi böcek modele bağlı olarak kolayca genişletmek edilirmümkün ve / veya adapte edilebilir. Örneğin, bu çok kanallı elektrotları oluşturmak için üç adet tek teller fazla kullanmak düşünülebilir. Buna ek olarak, kayıt sitelerinin sayısı genişletilmiş ve ikiden fazla ya da yolları neuropils zamansal açıdan gözlemlemek mümkündür edilebilir. Temennimiz bu yöntem pek çok bilim adamı ilham kaynağı olacak ve küçük beyinleri gelişmiş nöronal işleme anlayışına olumlu katkı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |