Summary
الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية.
Abstract
الإندوسومات هي واحدة من كبرى غشاء الفرز نقاط التفتيش في الخلايا حقيقية النواة والتي تنظم إعادة تدوير أو تدمير معظمها من البروتينات الغشاء البلازمي وجولجي. ونتيجة لذلك النظام endosomal يلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية، والطفرات في جينات المنتمين إلى هذه الشبكة من العضيات مترابطة بواسطة وسائل النقل الحويصلي، يسبب أمراض خطيرة بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية. لذا من الأهمية رئيس هو لفهم الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي وتنظيم نظام endosomal. كان الخباز الخباز الخميرة محوريا في هذه المهمة. لتسمية تحديدا وتحليل على مستوى التركيبية النظام endosomal هذا النموذج الحي، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لامتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts تليها التصور من هذه الجسيمات من خلال تعزيز التفاعل الفضة. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة للغايةل لفحص الصرفي من المسوخ مع عيوب في الاتجار endosomal. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس فقط ينطبق على الامتحانات التركيبية لكنها يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع labelings immunogold للتحقيقات البروتين التعريب.
Introduction
نظام endosomal هو جهاز الفرز غشاء الرئيسية التي تلعب أدوارا متعددة الخلوية حاسمة بما في ذلك الاتجار انزيم الليزوزومية مستقبلات الفرز وإعادة التدوير من غشاء البلازما (بعد الظهر) مستقبلات 1،2. وتنقسم الإندوسومات في ثلاث مقصورات مختلفة، مثال. والإندوسومات في وقت مبكر (EE)، والإندوسومات الراحل (LE) والإندوسومات إعادة التدوير. ويستند هذا التصنيف على الوقت الذي يستغرقه للمواد endocytosed للوصول إليهم، على بروتينات محددة وعلامة على التشكل. يمكن أن تكون إما تسليمها الأغشية، أي البروتين والدهون طبقات ثنائية، المنضوية من PM إلى الجسيمات الحالة عبر الإندوسومات للتدهور أو إعادة تدويرها مرة أخرى. ويتم نقل الأغشية أيضا الإندوسومات من جولجي وبالمثل، إما الاستمرار في الجسيمات الحالة أو يتم استردادها مرة أخرى إلى جولجي. وعلاوة على ذلك، والبروتينات يمكن أن تخزن في الحويصلات اللمعية في مهدها الداخل من endosomal الحد الغشاء، وهي العملية التي تؤدي إلى تشكيلفئة فرعية من جنيه، والهيئات عديد الحويصلات.
نظام endosomal الخميرة هو نسبيا أقل تعقيدا من واحدة من الخلايا حقيقية النواة عالية. وتنقسم الإندوسومات الخميرة في وEE جنيه. وعلى النقيض من خلايا الثدييات أنها لا تحتوي على الإندوسومات إعادة التدوير ولكن أيضا العضيات ذات الصلة يحلول الأنسجة محددة. وبالتالي لديهم شبكة أقل تعقيدا من طرق الاتجار endosomal 3،4. ولذلك فقد الخميرة مثلت ولا تزال تمثل النظام التجريبي مفيد لدراسة بعض المبادئ الأساسية في حركة غشاء نظام endosomal. وأكد هذه الميزة من حقيقة أن العديد من الجينات المعنية في مسارات endosomal تم عزلها في البداية مع شاشات الوراثية في الخميرة 5. في حين أن النظام endosomal الخميرة في النوع البري وخلايا متحولة وقد درس على نطاق واسع باستخدام نهج المجهري البيوكيميائية ومضان، تحقيقاتها على مستوى التركيبية كان فقطالحد الأدنى. التحليلات المورفولوجية هي ذات أهمية خاصة في الخميرة لأن يتم الكشف عن معظم العضيات endosomal عن الهياكل نقط بواسطة المجهر مضان، والتي تجعل من الصعب تحديد لا لبس فيه 6. للأسف سوى عدد محدود من أمصال مضادة الاعتراف علامات البروتين الخميرة endosomal تعمل في المناعية الإلكترون المجهري (IEM) الاستعدادات 7-10. بالنسبة لبعض البروتينات، وقد تم التحايل على هذه المشكلة عن طريق وضع علامات الذاتية من الجينات في المصالح واستخدام الأجسام المضادة الاعتراف علامة على الكشف عن 7،11،12. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عنها بواسطة البروتينات هي IEM بسبب انخفاض مستويات التعبير الخاصة بهم. من overexpression ليست حلا لأن هذا النهج يمكن أن تحدث سوء تعريب و / أو تغييرات في التشكل عضية / وظائف. وبالتالي فإن وضع العلامات من مقصورات التقامي مع لجنة التحقيق كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني EM هو خيار فعالة. هذا هو الحل الأمثل وخاصة إذا كان العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية تدخل الطريق التقامي بطريقة تعتمد على الوقت، والذي يسمح لمعرفة متى سيكون علامة على عضية محددة 6.
وقد تم بنجاح استخدام امتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts الخميرة (أي. الخميرة حيث تمت إزالة جدار الخلية إنزيمي) لتحديد endosomal الخميرة المقصورات 10. هذه الجسيمات يرتبط بقوة إلى الدهون سالبة الشحنة تتكون الأغشية البيولوجية. وبالتالي الزميلة nanogold موجبة مع رئيس الوزراء، تخترق الخلية عن طريق الإلتقام ويمر عبر EE جنيه وقبل أن يصل إلى فجوة. هذه الجسيمات صغيرة من الذهب، ومع ذلك، لم يكن لديك الحجم المناسب أن ينظر إليها من قبل EM. لجعلها مرئية، حجمها يمكن توسيعها عن طريق التفاعلات الكيميائية التي تؤدي إلى ترسب الفضة أو الذهب حول التحقيق الذهب 13-15. قمنا بتطوير وتطبيق هذا النهج بنجاح IEM على أساس أسلوب Tokuyasu لأداء التحت خلويةيدرس توطين 8،16. يسمح هذا الأسلوب أداء immunogold وضع العلامات على الاستعدادات الخميرة مع قرار ممتاز من التشكل 8،17-24. أنشأنا أيضا إجراء الجمع بين هذا البروتوكول IEM مع وضع العلامات nanogold النظام الخميرة endosomal المقصورات 6. باستخدام هذا النهج الذي اتسمت شكليا فرعية مختلفة من الإندوسومات وultrastructurally فحص المسوخ مع الاتجار endosomal عيب 6،25. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن هذا الوسم nanogold يمكن دمجها مع labelings immunogold توفير إمكانية لاستكشاف توزيع بروتين من الفائدة على مجموعات سكانية فرعية مختلفة جسيم داخلي. هنا نقدم كيف يتم تنفيذ وسم النظام الخميرة endosomal مع nanogold موجبة عمليا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكوراء
- احتضان بين عشية وضحاها الخميرة في 30 درجة مئوية في 10 مل من المتوسط مناسب يحدده تصميم التجربة.
- بعد اليوم، وقياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) باستخدام مضواء، تمييع الخلايا في نفس الثقافة المتوسطة إلى OD 600 من 0.2-0.4 وتنمو منها إلى مرحلة النمو المتسارع إلا إذا كان تصميم التجربة يتطلب حالة مختلفة. الخلايا في مرحلة الأسي عندما الثقافة لديه OD 600 من 1-2.
- جمع 10 OD 600 حكمه من الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق في أنبوب 50 مل. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية خلية في 5 مل من 100 ملي أنابيب (الرقم الهيدروجيني 9.6)، 10 ملي dithiothreitol والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- مرة أخرى جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
- resuspend الخلايا طن 5 مل من المتوسط (التي يحددها تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول و 5 ملغ من انزيم التحللي، واحتضان الخليط عند 30 درجة مئوية مع الهز لطيف لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق لجمع جزء بيليه، والتي تتطابق مع spheroplasts. تجاهل طاف.
- resuspend وspheroplasts في 960 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجليد الباردة (تحديد المتوسط عن طريق تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول ونقل الخليط في البرد الجليدي 2 مل أنبوب microcentrifuge.
2. Nanogold امتصاص
- باستخدام ماصة، مزيج بلطف الكوراء مع 4 نانومول من جزيئات موجبة الشحنة nanogold معلق في 40 ميكرولتر من الماء. الحجم النهائي من الخليط يجب أن يكون من 1 مل.
- ضع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- نقل تعليق في درجة حرارة الغرفة واحتضان ذلك للفترة الزمنية المطلوبة للسماح nanogold الداخلي عن طريق البريدndocytosis.
ملاحظة: سوف امتصاص 5 دقائق تؤدي أساسا إلى وضع العلامات من الحويصلات التقامي ومقصورات endosomal في وقت مبكر، في حين أن امتصاص 15 دقيقة سيسمح للاحتفال نظام endosomal كامل (أوائل وأواخر الإندوسومات). وسوف يعد مرات الحضانة (أكثر من 30 دقيقة) تسمح أيضا لتسمية فجوة.
ملاحظة: لا يمكن إجراء نبض مطاردة التجارب وضع العلامات مع هذا الأسلوب. لذلك، عندما وصفها لتحليل جنيه، كما سيتم العثور nanogold في وINEE PM.
3. تثبيت وباجتزاء
- وقف امتصاص nanogold بإضافة 1 مل من ضعف قوة تثبيتي [بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، 0.4٪ غلوتارالدهيد (GA) في 0.1 م العازلة PHEM (20 ملم أنابيب، و 50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.9، 20 ملي EGTA، 4 ملي MgCl 2)] تحتوي على 1 M السوربيتول إلى تعليق الخلية. أبقى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
- عكس بلطف يدويا أنابيب micocentrifuge عدة مرات خلال 30 دقيقة (وهذا سوف يسمح للحفاظ على spheroplasts فيالتعليق) ثم الطرد المركزي مرتين في 1،700 x ج لمدة 25 ثانية.
- استبدال تثبيتي عن طريق التخلص من طاف وذلك بإضافة 1 مل من الطازجة قوة تثبيتي القياسية (2٪ PFA، 0.2٪ GA في 0.1 م العازلة PHEM) تحتوي على 1 M السوربيتول واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة ببطء.
- معالجة الخلايا للالبرد باجتزاء كما هو موضح سابقا 6. ملاحظة: للحصول على إجراءات تعزيز امتصاص nanogold والفضة، والعلاج حامض الدوري موضح في البروتوكول المشار إليه لم المراد تنفيذها. علاج حمض الدوري هو أفضل permeabilize جدار الخلية 26 ولكن تم القضاء على هذا الهيكل خلال جيل من spheroplasts.
- خفض 50 نانومتر في cryosections رقيقة -120 درجة مئوية مع جفاف سكين الماس باستخدام مشراح مستدق UCT كما هو موضح سابقا 8 ووضعها على الكربون المغلفة Formvar 50 تنسجم شبكات النيكل.
4. تعزيز الفضية لNanogold الجسيمات Visualization
ملاحظة: الإجراء لإعداد الخلائط رد فعل هو في الأساس واحدة أشارت من قبل الشركة المصنعة. التعديلات العملية باستخدام هذا البروتوكول، ويجعل الإجراء تعزيز الفضة فعالة وموثوق بها على cryosections.
- إزالة عدة تعزيز الفضة من الفريزر وذوبان الجليد هو في الحاضنة 37 درجة مئوية أو حمام الماء. عند إذابة، ضع عدة في حاضنة 24 درجة مئوية وضعها في غرفة مظلمة حتى استخدام (انظر 4.7).
- وضع لوحة التدفئة في غرفة مظلمة ودافئة لدرجة الحرارة النهائية من 24 درجة مئوية.
- تغطية الجزء العلوي من لوحة التدفئة مع حامي السطح، الجانب اللامع فوق، وضمان الحصول عليها مع الشريط.
- وضع Parafilm على Benchkote وبمناسبة حواف مع علامة سوداء ليكون قادرا على رؤية الحواف Parafilm في الظلام.
- ميزان حرارة الشريط على الجزء العلوي من Benchkote لرصد درجات الحرارة من لوحة التدفئة. ضبط درجة الحرارة تدريجيا إذا لم 24 درجة مئوية.
- جيش التحرير الشعبى الصينىCE أنبوب 50 مل بالماء المقطر المزدوج وطقم تعزيز الفضة في الداخل.
- ملء أطباق بتري صغيرة مع الماء المقطر المزدوج، استعد مسبقا عند 37 درجة مئوية. وضع شبكات في الماء، عينة الجانب السلبي، لمدة 30 دقيقة.
- كرر هذه الخطوة 4.7 مرة أخرى.
- نقل الشبكات في صندوق تخزين وتقديمهم إلى غرفة مظلمة.
- شطف شبكات مرة أخرى عن طريق تمرير لهم (مع الجانب عينة لأسفل) على عدة قطرات من الماء المقطر مزدوجة في 24 ° C وضعت على Parafilm التي تم إصلاح على لوحة التدفئة.
- تأكد من أن 9 مزدوجة قطرات الماء المقطر إضافية مستعدون على Parafilm، لالشطف بعد رد الفعل تعزيز الفضة.
- تحويل ضوء قبالة والتأكد من أن جميع الأنوار مطفأة. بدوره الضوء الأحمر على.
- إخراج ألف وباء حلول من عدة تعزيز الفضة من الحاضنة 24 درجة مئوية.
- ووضع قطرات 6 الأولى من الحل A ثم 6 قطرات من محلول B في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخلط جيدا مع ماصة باستير الزجاج تجنب جعل فقاعات. الحل هو سميكة جدا ولها إلى أن تكون مختلطة يدويا مع ماصة قبل vortexing لفترة وجيزة في نهاية الأمر.
- وضع حلول A و B مرة أخرى في الحاضنة 24 درجة مئوية، واخراج الحل C.
- إضافة 6 قطرات من الحل C إلى المزيج A / B. ثم تخلط مرة أخرى الأول مع ماصة باستور ومن ثم من قبل vortexing، وتجنب الوقوع في فقاعات.
- استخدامها على الفور الخليط النهائي عن طريق وضع قطرات (~ 20 ميكرولتر / قطرة) على Parafilm.
- مع ملاقط نظيفة، ومكافحة المغناطيسي، ووضع شبكات على الخليط (على سبيل المثال، الفضة تعزيز رد فعل) لمدة 6 to15 دقيقة تبعا للتعزيز (أي. حجم جزيئات الذهب) يرغب في الحصول عليها.
- إزالة شبكات من الخليط وتمريرها على سطح الماء المقطر المزدوج قطرات في 24 درجة مئوية لمدة يغسل. أولا، استخدم في خلافة بسرعة 6 قطرات ثم 3 قطرات مع 7 دقيقة فترة حضانة من كل قطرة ماء، قبل ان يتحول الأضواء على.
- انتقل إلى الخطوة التالية، إما وضع العلامات المناعية الذهب أو غشاء تلطيخ 27 من أجل تصور نتيجة لإجراء تحقيق EM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين وفقا لبروتوكول المقدمة، مورفولوجية النظام الخميرة جسيم داخلي يمكن أن يكون وصول EM الإرسال. الشكل 1 أنواع مختلفة من المقصورات endosomal التي تم التوصل إليها، وبالتالي المسمى مع nanogold. وnanogold محسنة الفضة يمكن رؤيتها بوضوح كما الإلكترون جسيمات كثيفة. الإعدادات المثلى التي أنشئت لتعزيز تفاعل الفضة يسمح وجود جزيئات الذهب في مجموعة متجانسة الحجم ما بين 5 و 15 نانومتر، والتي لا تتداخل مع التركيب الدقيق للخلية الخميرة. غشاء البلازما وكذلك المقصورات endosomal في وقت مبكر يمكن الوصول إلى nanogold بعد الحضانة 5 دقائق في 24 ° C (الشكل 1A)، في حين جنيه، في الهيئات عديد الحويصلات الحالة المعروضة، يمكن الوصول إليها من خلال هذه الجزيئات بعد لا يقل عن 30 دقيقة من امتصاص (الشكل 1B). قوة القرار من جمع بين ما لنا الإجراء IEM 8 مع بروتوكول تعزيز nanogold / الفضة الموصوفة هنا هو من الامم المتحدةderlined من قبل المحافظة ونوعية التشكل من العضيات مبين، ولا سيما الحويصلات الداخلية من الهيئات عديد الحويصلات (الشكل 1B).
الشكل 1. تحليل التركيبية من nanogold المسمى مقصورات الخميرة endosomal. تم الحصول على Spheroplasts من نوع السلالة البرية SEY6210 (MATalpha ura3-52 leu2-3، 112 HIS3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801-suc2 Δ9 ميل GAL) كما هو موضح في البروتوكول المقدمة. ثم تم تحضين Spheroplasts مع 4 نانومول من nanogold موجبة الشحنة في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل نقله إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 (لوحة A) أو 30 دقيقة (لوحة B). تم إصلاح الخلايا في وقت لاحق، وتجهيزها لcryosectioning 8 قبل تنفيذ الفضة تعزيز رد فعل على إعداد كما هو موضحفي بروتوكول المعروضة. A. مقصورات في وقت مبكر من النظام الخميرة endosomal. بالإضافة إلى غشاء البلازما، وامتصاص قصيرة من nanogold (5 دقائق) يسمح بوضع العلامات على حويصلات واحد (السهام)، الحويصلات ربما التقامي، والهياكل الأنبوبية (السهم)، من المرجح جدا في وقت مبكر الإندوسومات. B. الخميرة عديد الحويصلات التركيب الدقيق الجسم. A 30 دقيقة الحضانة يؤدي إلى وسم جنيه / الهيئات عديد الحويصلات (النجمة)، ولكن أيضا الإندوسومات المبكر وفجوات في جزء (لا يظهر). M، الميتوكوندريا؛ N، نواة؛ مساء، غشاء البلازما؛ V، فجوة. شريط = 200 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المناعية الإلكترون المجهري هو الاسلوب الذي يسمح الجمع بين توطين البروتينات مع قرار التركيبية من الناقلين والعضيات حيث تتواجد هذه البروتينات. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند دراسة نظام الخميرة endosomal لأن حجرات لها تظهر هياكل نقط كما في مضان المجهري. وبالتالي فإنه من الصعب تمييزها. لهذا السبب، فإن استخدام مسبار كشفها بواسطة EM ودخول الطريق التقامي بطريقة تعتمد الوقت أمر بالغ الأهمية للاحتفال تحديدا الإندوسومات مختلفة. هذا النوع من التحقيق هو قيمة لتقييم وظائف الإلتقام 6 و هو بديل لعدم وجود أمصال مضادة كشف علامات البروتين.
الإجراء الموضح هنا استغلال موجبة الشحنة nanogold بمثابة التحقيق لتسمية مقصورات endosomal. بينما cryosectioning يتطلب معدات ومهارات خاصة، وبروتوكول المعروضة من السهل من الناحية الفنية ولا إعادةكراس آلات خاصة. وبالتالي فإنه يمكن الوصول إلى أي مختبر التي ترغب في استخدامها لبحوثه. ومع ذلك، بعض الاحتياطات التي يتعين اتخاذها خلال خطوة حاسمة من هذا الإجراء، أي رد فعل تعزيز الفضة. هذا رد فعل حساس جدا للضوء وبالتالي كل الأضواء (ما عدا واحدة حمراء) في الغرفة يجب أن إيقاف و / أو تغطيتها. لأن جميع التفاعلات الكيميائية، ويتأثر سرعة رد الفعل تعزيز الفضة من درجة الحرارة. للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار استخدام نفس المعلمات، وجميع الحلول والأدوات يجب أن تكون preincubated بعناية في 24 درجة مئوية. فمن الأهمية بمكان إنشاء بدقة فترة حضانة لتعزيز الفضة في الغرفة حيث سيتم تنفيذ هذا التفاعل بشكل روتيني. التوسع في nanogold أن تكون طويلة بما فيه الكفاية من أجل أن تكون قادرة على الكشف عن الجسيمات بصريا الذهب من قبل EM ويجب أن تكون قصيرة بما يكفي لتجنب توليد جزيئات كبيرة الحجم، والتي يمكن أن تغطي تفاصيل المورفولوجية. لهذا السبب، يقترح ترحيبا حارا لأداء تجربة رائدة عند إعداد هذه التقنية في المختبر. خلال هذا الاختبار الجسيمات nanogold يجب أن تكون الفضة معززة لأوقات مختلفة لتحديد الوقت الأمثل للتفاعل. من المذكرة، يمكن للأبعاد الجزيئات التي تم الحصول عليها لا يكون من حجم متجانسة؛ سيكون هناك دائما بعض التجانس ولكن هذا يجب أن تبقى ضئيلة بقدر الإمكان، في نطاق بين 5-15 نانومتر. هذا مهم بشكل خاص إذا كان سيتم الجمع بين الإجراء امتصاص nanogold مع labelings المناعية الذهب. جانب آخر ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير النتائج هو أن نبض مطاردة التجارب وضع العلامات ليست ممكنة مع هذا الأسلوب. بالتالي سيتم تسمية رئيس الوزراء وEE أيضا في امتصاص nanogold تهدف إلى تصور جنيه.
فمن الممكن أيضا أن نرى تطبيقات إضافية للبروتوكول المعروضة هنا. خيار يمكن أن يكون لربط البيانات EM امتصاص nanogold مع microscop الفلورسنتذ. FM4-64 هو محبة للدهون صبغ فلوري علامة أن الزميلة لPM و، في طريقها إلى فجوة، يمر من خلال المقصورات endosomal بطريقة تعتمد على الوقت. كلا FM4-64 وnanogold دخول الخلية بالتعاون مع الدهون وربما لديهم حركية استيعاب مشابهة جدا 28،29. ونتيجة لذلك يمكن استخدامها على حد سواء الأصباغ في نفس الوقت في ضوء مترابط-EM النهج لاستكشاف ديناميكية في وقت واحد وقدم التركيب الدقيق للالتقامي compartments.The يمكن أيضا أن تستخدم لطريقة الاتجار بوساطة مستقبلات من خلال نظام التقامي 30. المشتقات Monomaleido وأحادية سلفو-N-هيدروكسي succinimido من nanogold يمكن استخدامها لربط تساهمي هذه الجسيمات إلى البروتينات 6. يمكن على سبيل المثال عبر ربط مع أحد أو لعامل α تسمح بعد الإلتقام هذه الفيرومونات اثنين بواسطة مستقبلات محددة.
كل ذلك معا، وبروتوكول وصف يسمح لالمواصفاتifically تسمية العضيات النظام الخميرة endosomal باستخدام مسبار endocytosed، والتي يمكن أن يتم كشفها بواسطة EM. هذه الأداة التجريبية هو نهج قيمة لدراسة نشوء حيوي وتنظيم المقصورات الخميرة endosomal على مستوى التركيبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر رينيه Scriwanek للمساعدة في إعداد الشكل. ويدعم FR بواسطة ECHO (700.59.003)، برنامج ALW المفتوحة (821.02.017 و822.02.014)، والتعاون DFG-NWO (DN82-303) وZonMW VICI (016.130.606) المنح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
