Summary
Lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stata un organismo modello chiave per identificare e studiare geni che regolano la biogenesi e le funzioni del sistema endosomal. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'etichettatura specifico dei comparti endosomiali per gli studi ultrastrutturali.
Abstract
Endosomi sono uno dei principali membrana ordinamento posti di blocco nelle cellule eucariotiche e regolano il riciclaggio o la distruzione delle proteine per lo più dalla membrana plasmatica e il Golgi. Di conseguenza il sistema endosomal svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare, e mutazioni in geni appartenenti a questa rete di organelli interconnessi da trasporto vescicolare, causano gravi patologie tra cui il cancro e disturbi neurobiologici. E 'quindi di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base della biogenesi e l'organizzazione del sistema endosomal. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato fondamentale in questo compito. Per etichettare e analizzare a livello ultrastrutturale sistema endosomal di questo organismo modello specifico, presentiamo qui un protocollo dettagliato per la nanogold assorbimento carica positiva da sferoplasti seguite dalla visualizzazione di queste particelle attraverso una reazione valorizzazione argento. Questo metodo è anche un prezioso troppol per l'esame morfologico di mutanti con difetti nel traffico endosomal. Inoltre, non è solo applicabile per esami ultrastrutturali ma può anche essere combinato con etichettature immunogold delle indagini localizzazione della proteina.
Introduction
Il sistema endosomal è un importante apparato di smistamento membrana che svolge molteplici ruoli cellulari cruciali, tra cui il traffico di recettori smistamento enzima lisosomiale e il riciclaggio di membrana plasmatica (PM) recettori 1,2. Endosomi sono divisi in tre diversi comparti, vale a dire. gli endosomi precoci (EE), alla fine degli endosomi (LE) e le endosomi di riciclo. Questa classificazione si basa sul tempo impiegato materiale endocitosi raggiungerli, sulle proteine marker specifiche e sulla loro morfologia. Membrane, ovvero proteine e lipidi bistrati, interiorizzate dal PM possono sia essere consegnati ai lisosomi via endosomi per la degradazione o essere riciclati. Le membrane sono trasportati endosomi dal Golgi e similmente, sia continuare ad lisosomi o essere recuperate indietro ai Golgi. Inoltre, le proteine possono essere filtrate in vescicole luminali erba verso l'interno dalla membrana endosomal limitante, un processo che porta alla formazione diuna sottocategoria di LE, i corpi multivescicolari.
Il sistema endosomal lievito è relativamente meno complessa di quella delle cellule eucariotiche superiori. Endosomi lievito sono suddivisi in EE e LE. In contrasto con cellule di mammifero non contengono endosomi di riciclo ma anche organelli lisosomi legati tessuto-specifici. Di conseguenza, essi hanno una rete meno complessa di endosomal rotte del narcotraffico 3,4. Pertanto lievito ha rappresentato e rappresenta un sistema sperimentale vantaggiosa per studiare alcuni dei principi traffico membrana sottostante nel sistema endosomal. Questo vantaggio è accentuato dal fatto che numerosi geni coinvolti nelle vie endosomali sono stati inizialmente isolato con schermi genetici nel lievito 5. Mentre il sistema endosomiale lievito wild type e cellule mutanti è stata ampiamente studiata utilizzando approcci biochimici e di microscopia a fluorescenza, la sua indagine a livello ultrastrutturale è stato solominima. Analisi morfologiche sono particolarmente rilevanti nel lievito perché la maggior parte degli organelli endosomiali vengono rilevati come strutture puntuate mediante microscopia a fluorescenza, che rendono difficile la loro identificazione univoca 6. Purtroppo solo un numero limitato di antisieri riconoscere proteine marker lievito endosomali sta lavorando in immuno-microscopia elettronica (IEM) preparazioni 7-10. Per alcune proteine, questo problema è stato aggirato dalla codifica endogeno del gene di interesse e l'impiego di un anticorpo che riconosce il tag di rilevarla 7,11,12. Spesso, tuttavia, le proteine sono rilevabili da IEM causa dei loro livelli di espressione bassi. La loro sovraespressione non è una soluzione, perché questo approccio può indurre mis-localizzazioni e / o alterazioni nei organelli morfologia / funzioni. Così l'etichettatura dei compartimenti endocitici con una sonda rilevabile mediante microscopia elettronica EM è un'opzione efficace. Questa è una soluzione ottimale soprattutto se il prOBE sta entrando nel percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo, che permette di conoscere quando segnerà un organello specifico 6.
L'assorbimento di nanogold carica positiva da sferoplasti lievito (vale a dire. Lievito in cui la parete cellulare è stato rimosso enzimaticamente) è stato utilizzato con successo per identificare la endosomiale lievito scomparti 10. Queste particelle si legano fortemente ai lipidi carichi negativamente che compongono le membrane biologiche. Così i soci nanogold cariche positivamente con il PM, penetra nella cellula per endocitosi e passa attraverso l'EE e LE prima di raggiungere il vacuolo. Queste piccole particelle d'oro, tuttavia, non hanno dimensioni adeguate per essere visto da EM. Per renderle visibili, le loro dimensioni possono essere allargata mediante reazioni chimiche che portano alla deposizione di argento o oro intorno alla sonda oro 13-15. Abbiamo sviluppato e applicato con successo un approccio IEM basato sul metodo Tokuyasu effettuare subcellularelocalizzazione studia 8,16. Questo metodo consente di eseguire etichettatura immunogold su preparazioni di lievito con una risoluzione eccellente della morfologia 8,17-24. Abbiamo anche stabilito una procedura che combina questo protocollo IEM con l'etichettatura nanogold del sistema lievito endosomale compartimenti 6. Usando questo approccio abbiamo morfologicamente caratterizzato diverse sottoclassi di endosomi e ultrastrutturalmente esaminato mutanti con un traffico endosomiale difetto 6,25. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa etichettatura nanogold può essere combinato con etichettature immunogold fornendo la possibilità di esplorare la distribuzione di una proteina di interesse sulle diverse sottopopolazioni endosomi. Qui vi presentiamo come è praticamente eseguito l'etichettatura del sistema lievito endosomiale con nanogold carica positiva.
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Protocol
1. Spheroplast Preparazione
- Incubare il lievito notte a 30 ° C in 10 ml di mezzo appropriato determinato dal disegno dell'esperimento.
- Il giorno dopo, misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) usando un fotometro, Diluire le cellule nello stesso terreno di coltura ad una OD 600 di 0,2-0,4 e farle crescere ad una fase di crescita esponenziale meno che la progettazione del esperimento richiede una condizione diversa. Le cellule sono in fase esponenziale quando la coltura ha un diametro esterno 600 di 1-2.
- Raccogliere 10 OD 600 equivalenti di cellule mediante centrifugazione a 3500 xg per 5 minuti in un tubo da 50 ml. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tubi 100 mM (pH 9,6), ditiotreitolo 10 mM e incubate a 30 ° C per 10 min.
- Raccogliere nuovamente le cellule per centrifugazione a 3.500 xg per 5 min. Scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 5 ml di terreno (determinato dal disegno dell'esperimento) contenente 1 M sorbitolo e 5 mg di enzima litico, e incubare la miscela a 30 ° C con delicata agitazione per 30 min.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti per raccogliere la frazione di pellet, che corrisponde alle sferoplasti. Scartare il surnatante.
- Risospendere le sferoplasti in 960 ml di ghiaccio freddo supporti (medio determinato dal disegno dell'esperimento) contenente 1 M sorbitolo e trasferire il composto in una ghiacciata 2 ml provetta.
2. Nanogold assorbimento
- Usando una pipetta, mescolare delicatamente il spheroplast con 4 nmol di particelle cariche positivamente nanogold risospese in 40 ml di acqua. Il volume finale della miscela deve essere di 1 ml.
- Posizionare la sospensione cellulare ottenuta in ghiaccio per 15 min.
- Trasferire la sospensione a temperatura ambiente ed incubare per il tempo necessario a consentire nanogold internalizzazione via endocytosis.
NOTA: A 5 min assorbimento sarà principalmente portare l'etichettatura di vescicole e dei primi comparti endosomiali, mentre un 15 min assorbimento permetterà di contrassegnare l'intero sistema endosomiale (precoce e endosomi tardivi). Tempi di incubazione più lungo (più di 30 min), consentiranno inoltre di etichettare vacuolo.
NOTA: esperimenti di etichettatura Pulse-chase non possono essere eseguite con questo metodo. Pertanto, quando l'etichettatura per l'analisi di LE, nanogold anche essere trovate in PM e INEE.
3. Fissazione e sezionamento
- Interrompere l'assorbimento nanogold con l'aggiunta di 1 ml di doppio fissativo forza [4% paraformaldeide (PFA), 0,4% glutaraldeide (GA) in 0.1 M tampone PHEM (20 TUBI mm, 50 HEPES mM, pH 6,9, 20 mM EGTA, MgCl 4 mM 2)] contenente 1 M sorbitolo alla sospensione cellulare. Mantenuto il tubo a temperatura ambiente.
- Capovolgere delicatamente manualmente le provette micocentrifuge più volte durante 30 minuti (questo permetterà di mantenere le sferoplasti insospensione) e centrifugare due volte a 1700 xg per 25 sec.
- Sostituire il fissativo scartando il surnatante e con l'aggiunta di 1 ml di fissativo fresco forza standard (2% PFA, 0,2% GA in 0.1 M tampone PHEM) contenente 1 M sorbitolo e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una ruota lenta rotazione della camera.
- Elaborare le cellule per crio-sezionamento come descritto in precedenza 6. NOTA: Per le procedure di valorizzazione nanogold assorbimento e d'argento, il trattamento con acido periodico descritto nel protocollo indicato è di non essere effettuati. Il trattamento con acido periodico è permeabilize meglio la parete cellulare 26 ma questa struttura è stata eliminata durante la generazione di sferoplasti.
- Tagliare 50 criosezioni sottili nm a -120 ° C con la lama di diamante a secco utilizzando un UCT ultramicrotomo come descritto in precedenza 8 e metterli su carbone Formvar rivestito 50 maglie griglie di nichel.
4. Miglioramento argento per Nanogold particelle Visualizzazione
NOTA: La procedura per preparare le miscele di reazione è fondamentalmente quello indicato dal costruttore. Adeguamenti pratici che utilizzano questo protocollo, rende la procedura di valorizzazione argento efficace e affidabile su criosezioni.
- Rimuovere il kit di potenziamento argento dal freezer e scongelare in un incubatore a 37 ° C oa bagnomaria. Quando scongelati, posizionare il kit in un incubatore a 24 ° C collocato in una stanza buia fino al momento dell'uso (vedi 4.7).
- Posizionare la piastra di riscaldamento in camera oscura e riscaldarlo alla temperatura finale di 24 ° C.
- Coprire la parte superiore della piastra di riscaldamento con la protezione di superficie, lato lucido, e fissarlo con un nastro.
- Posizionare il Parafilm sul Benchkote e segnare i bordi con un pennarello nero per essere in grado di vedere i bordi parafilm nel buio.
- Nastro un termometro sulla parte superiore della Benchkote per monitorare la temperatura della piastra riscaldante. Gradualmente regolare la temperatura se non 24 ° C.
- PlaCE Il tubo da 50 ml con acqua bidistillata e il kit di miglioramento argento all'interno.
- Riempire le piccole piastre di Petri con acqua bidistillata, pre-riscaldato a 37 ° C. Posizionare le griglie in acqua, provino lato negativo, per 30 min.
- Ripetere questo passo 4.7 ancora una volta.
- Trasferire le griglie nel box di stoccaggio e portarli alla camera oscura.
- Risciacquare nuovamente le griglie facendoli passare (con il lato campione giù) su alcune gocce di acqua bidistillata a 24 ° C immessi sul parafilm che è stato fissato sulla piastra di riscaldamento.
- Assicurarsi che 9 supplementare doppio gocce d'acqua distillata sono pronti sul Parafilm, per il risciacquo dopo la reazione valorizzazione argento.
- Spegnere la luce e assicurarsi che tutte le luci siano spente. Accendere la luce rossa.
- Estrarre le soluzioni A e B del kit potenziamento argento dal termostato 24 ° C.
- Mettere primi 6 gocce di soluzione A e poi 6 gocce di soluzione B in un 1,5 ml provetta e mescolare bene con una pipetta Pasteur di vetro evitando di fare le bolle. La soluzione è abbastanza spessa e deve essere miscelato manualmente con una pipetta prima di finalmente vortex brevemente.
- Mettere le soluzioni A e B di nuovo in incubatrice 24 ° C ed estrarre la soluzione C.
- Aggiungere 6 gocce della soluzione C al mix A / B. Poi mescolare ancora prima con una pipetta Pasteur e poi nel vortex, evitare di fare bolle.
- Utilizzare immediatamente la miscela finale inserendo (~ 20 l / drop) gocce sul Parafilm.
- Con un pulito, pinzette anti-magnetico, posizionare le griglie sulla miscela (ad es., Argento migliorando reazione) da 6 a 15 minuti a seconda della valorizzazione (ie. Dimensione delle particelle d'oro) voluto da ottenere.
- Rimuovere le griglie dalla miscela e trasferirli sulla superficie dell'acqua bidistillata scende a 24 ° C per lavaggi. In primo luogo, utilizzare in rapida successione 6 gocce e poi 3 gocce con 7 min tempo di incubazione per goccia, Prima di accendere le luci.
- Procedere con il passaggio successivo, sia l'etichettatura immuno-oro o marcatura di membrana 27, al fine di visualizzare il risultato di un'inchiesta EM.
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Representative Results
Secondo il protocollo presentato, la morfologia del sistema lievito endosome può essere accesso da EM trasmissione. Figura 1 mostra diversi tipi di compartimenti endosomiali che sono stati raggiunti e quindi etichettati con nanogold. Il nanogold-argento avanzato può essere chiaramente visto come elettroni particelle dense. Le impostazioni ottimali stabiliti per la reazione valorizzazione argento permette avente particelle di oro in una gamma omogenea dimensioni tra 5 e 15 nm, che non interferisce con l'ultrastruttura della cellula di lievito. Membrana plasmatica così come compartimenti endosomiali primi sono accessibili al nanogold dopo 5 min di incubazione a 24 ° C (Figura 1A), mentre LE, nei casi presentati corpi multivescicolari, sono raggiungibili da queste particelle dopo almeno 30 minuti di assorbimento (Figura 1B). Il potere di risoluzione di combinare la nostra procedura IEM 8 con il protocollo valorizzazione nanogold / argento qui descritta è ONUderlined dalla conservazione e qualità della morfologia degli organelli mostrate, in particolare le vescicole interno degli organismi multivesicular (Figura 1B).
Figura 1. Analisi ultrastrutturale di nanogold marcato compartimenti lievito endosomali. Sferoplasti sono stati ottenuti dal ceppo SEY6210 wild type (MATalpha URA3-52 LEU2-3, 112 his3-Δ200 TRP1-Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 mel GAL), come descritto nel protocollo presentato. Sferoplasti sono state poi incubate con 4 nmol di nanogold carico positivamente a 4 ° C per 15 minuti prima di essere trasferito a temperatura ambiente per 10 (pannello A) o 30 min (pannello B). Le cellule sono state successivamente fissati, preparate per criosezionamento 8 prima di effettuare la reazione valorizzazione argento sul preparato come descrittonel protocollo presentato. A. compartimenti precoce del sistema lievito endosomal. Oltre alla membrana plasmatica, una breve assorbimento del nanogold (5 min) permette l'etichettatura di vescicole singole (frecce), vescicole eventualmente endocitosi e di strutture tubolari (freccia), molto probabilmente endosomi precoci. B. Il lievito ultrastruttura corpo multivesicular. A 30 min di incubazione conduce l'etichettatura di LE / corpi multivescicolari (asterischi), ma anche endosomi precoci e in vacuoli parte (non mostrato). M, mitocondri; N, nucleo; PM, membrana plasmatica; V, vacuolo. Bar = 200 nm.
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Discussion
Immuno-microscopia elettronica è una tecnica che permette di combinare localizzazione di proteine con la risoluzione ultrastrutturale dei vettori e organelli dove queste proteine risiedono. Ciò è particolarmente importante quando si studia il sistema lievito endosomiale perché i suoi comparti appaiono come strutture puntuate in microscopia a fluorescenza. È pertanto difficile distinguerle. Per questo motivo l'uso di una sonda rilevabile da EM e immettendo il percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo è cruciale per marcare specificamente le diverse endosomi. Questo tipo di sonda è utile per valutare la funzionalità di endocitosi 6 ed è un'alternativa alla mancanza di sieri rilevare marcatori proteici.
La procedura qui descritta exploit caricato positivamente nanogold come sonda per etichettare i comparti endosomali. Mentre criosezionamento richiede attrezzature e competenze speciali, il protocollo presentato è tecnicamente facile e non riCoro macchine speciali. Pertanto è accessibile a qualsiasi laboratorio che vorrebbe usarlo per la sua ricerca. Tuttavia, alcune precauzioni devono essere prese durante la fase critica di questa procedura, cioè la reazione valorizzazione argento. Questa reazione è molto sensibile alla luce e quindi tutte le luci (tranne quella rossa) in sala deve essere spento e / o coperto. Come tutte le reazioni chimiche, la velocità della reazione valorizzazione argento è influenzata dalla temperatura. Per ottenere risultati coerenti e riproducibili con gli stessi parametri, tutte le soluzioni e gli strumenti devono essere attentamente preincubato a 24 ° C. È fondamentale stabilire con precisione il tempo di incubazione per la valorizzazione argento nella stanza in cui verrà effettuata regolarmente questa reazione. Espansione del nanogold deve essere sufficientemente lungo per essere in grado di rilevare visivamente la particella d'oro da EM e deve essere sufficientemente breve da evitare la generazione di particelle di grandi dimensioni, che potrebbe riguardare i morfologiche. Per questo motivo, è vivamente consigliabile l'esecuzione di un esperimento pilota durante l'impostazione di questa tecnica in laboratorio. Durante questo test le particelle nanogold devono essere argento avanzato per tempi diversi per determinare il tempo ottimale per la reazione. Da notare che le dimensioni delle particelle ottenute non possono essere di dimensioni omogenee; ci sarà sempre qualche eterogeneità, ma questo deve essere mantenuto al minimo possibile, in un range compreso tra 5 - 15 nm. Questo è particolarmente importante se la procedura nanogold assorbimento sarà combinato con etichettature immuno-oro. Un altro aspetto da tenere in considerazione quando si interpretano i risultati è che gli esperimenti di etichettatura pulse-chase non sono possibili con questo metodo. Di conseguenza il PM e EE sono etichettati anche in un assorbimento nanogold mirato a visualizzare LE.
È anche possibile vedere le applicazioni aggiuntive del protocollo presentato qui. Un'opzione potrebbe essere quella di correlare i dati EM di nanogold captazione con microscop fluorescentey. FM4-64 è un lipofila colorante fluorescente marcatore che associa al PM e, nel suo cammino verso il vacuolo, sta attraversando i comparti endosomiali in modo dipendente dal tempo. Entrambi FM4-64 e nanogold entrare nella cellula in associazione con lipidi e hanno probabilmente molto simile cinetica di internalizzazione 28,29. Di conseguenza entrambi i coloranti possono essere usati allo stesso tempo in correlativo luce-EM approcci per esplorare simultaneamente la dinamica e la ultrastruttura della endocytic compartments.The presentato metodo può essere utilizzato anche per il traffico recettore-mediata attraverso il sistema endocytic 30. Derivati Monomaleido e mono-solfo-N-idrossi-succinimmidico del nanogold possono essere usate per legare covalentemente queste particelle di proteine 6. Ad esempio reticolazione con la-a o l'α-fattore può permettere a seguito della endocitosi di questi due feromoni dai loro recettori specifici.
Tutti insieme, il protocollo descritto permette di specifically etichettare gli organelli del sistema lievito endosomal utilizzando una sonda endocitosi, che può essere reso rilevabile da EM. Questo strumento sperimentale è un valido approccio per studiare la biogenesi e l'organizzazione dei compartimenti lievito endosomiali a livello ultrastrutturale.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano René Scriwanek per l'assistenza alla preparazione della figura. FR è sostenuto da ECHO (700.59.003), ALW programma aperto (821.02.017 e 822.02.014), la cooperazione DFG-NWO (DN82-303) e ZonMw VICI (016.130.606) sovvenzioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
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