Summary
효모, 사카로 미세스 세 레비 시아는, 엔도 좀 시스템의 생합성과 기능을 조절하는 유전자를 확인하고 연구하는 중요한 모델 생물이다. 여기에서 우리는 초 미세 구조 연구를위한 엔도 좀 구획의 특정 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
엔도 좀은 진핵 세포의 체크 포인트를 정렬 주요 막 중 하나이며 그들은 대부분 플라즈마 막과 골지체에서 단백질의 재활용 또는 파괴를 조절한다. 결과 엔도 솜 시스템은 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하고, 소낭 수송에 의해 상호의 소기관이 네트워크에 속하는 유전자의 돌연변이, 암 및 신경 생물학적 장애 등 심각한 병변을 일으킨다. 이는 엔도 솜 시스템의 생합성 및 조직을 기본 메커니즘을 이해하는 것이 프라임 관련성이다. 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애의이 작업에 중요한되었습니다. 특히 라벨과 미세 수준에서이 모델 생물의 엔도 좀의 시스템을 분석하기 위해, 우리는 여기에 실버 향상 반응을 통해 이러한 입자의 시각화 다음 spheroplasts에 의해 적극적으로 청구 nanogold 흡수에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 가치가 너무엔도 좀의 인신 매매에 결함이있는 돌연변이의 형태 학적 검사를위한 L. 또한, 그것은뿐만 아니라 미세 시험에 적용 할뿐만 아니라 단백질 현지화 수사 immunogold labelings와 결합 될 수있다.
Introduction
엔도 솜 시스템 1,2 수용체 리소좀 효소 선별 수용체의 매매와 원형질막 (PM)의 리사이클을 포함한 여러 중요한 역할을 담당하고 세포의 주요 막 선별 장치이다. 엔도 좀은 세 가지 구획, 즉 나누어집니다. 초기 엔도 좀 (EE), 후반 엔도 좀 (LE)와 재활용 엔도 좀. 이 분류는 그것이 특정 마커 단백질에 자신의 형태에, 그들에 도달하는 endocytosed 소재에 소요되는 시간을 기준으로합니다. PM에서 내면화 막, 즉 단백질과 지질 이중층은, 어느 저하에 엔도 좀을 통해 리소좀에 전달 될 수 또는 재순환 될 수있다. 멤브레인은 리소좀에 계속하거나 다시 골지로 검색 할 수도 마찬가지로 골지체에서 엔도 좀으로 이송하고있다. 또한, 단백질은 경계 막 엔도 솜의 형성에 이르게하는 과정에서 내측 신진 내강 소체로 분류 될 수있다LE의 하위 범주, multivesicular 기관.
효모 엔도 솜 시스템은 비교적 덜 복잡한 높은 진핵 세포 중 하나 이상이다. 효모 엔도 좀은 EE와 LE로 구분됩니다. 그들이 리사이클 엔도 솜 또한 조직 특이 리소좀 - 관련 세포 기관을 포함하지 않는 포유 동물 세포 대조적. 결과적으로 그들은 엔도 좀 인신 매매 경로 3,4의 덜 복잡한 네트워크를 가지고. 따라서 효모 표현 여전히 엔도 좀 시스템에서의 기본 원칙 막 트래픽의 일부를 연구하는 유리한 실험 시스템을 나타내고있다. 이러한 장점은 엔도 좀의 경로에 관련된 다수의 유전자가 처음 효모 5 유전자 화면으로 고립되어 있다는 사실을 강조했다. 야생형 및 돌연변이 세포에서 효모 엔도 솜 시스템이 광범위 생화학 및 형광 현미경을 이용하여 접근 연구되어 있지만, 미세 구조 레벨에서 그 조사는왔다최소. 엔도 좀의 세포 기관의 대부분이 자신의 명백한 식별 6 어렵게 형광 현미경에 의해 구두점 구조로 감지하기 때문에 형태 학적 분석은 효모에 특히 적합하다. 불행하게도 효모 엔도 좀의 단백질 마커를 인식 항혈청의 단지 제한된 수의 (IEM) 준비 7-10 면역 전자 현미경에서 일하고있다. 일부 단백질의 경우,이 문제는 또한 유전자의 내생 태깅하고 7,11,12를 검출하는 태그를 인식하는 항체의 사용에 의해 회피되었다. 그러나, 종종 단백질 때문에 자신의 낮은 발현 수준의 IEM으로는 발견 할 수없는 경우가 있습니다. 이 방법은 세포 내 소기관의 형태 / 기능에 잘못를 지역화 및 / 또는 변경을 유도 할 수 있기 때문에 자신의 과발현은 해결책이 아니다. 따라서 전자 현미경 EM에 의해 검출 프로브 세포 내 이입 구획의 라벨은 효과적인 옵션입니다. 특히 경우에 최적의 솔루션을 홍보탑재 장치는 특정 소기관 6을 표시 할 때 알 수 시간 의존적으로 세포 내 이입 경로를 입력한다.
효모 spheroplasts (세포벽이 효소 제거 된 예. 효모)에 의해 적극적으로 청구 nanogold의 이해 성공적으로 효모 엔도 솜 (10)을 구획 식별하는 데 사용되었습니다. 이 입자들은 강하게 생체막을 구성하는 음으로 하전 된 지질에 결합. 따라서 PM과 함께 적극적으로 청구 nanogold 관계자는 엔도 시토 시스에 의해 세포를 관통하고 공포에 도달하기 전에 EE와 LE를 통해 전달합니다. 이러한 작은 금 입자는, 그러나, EM으로 보이는 적절한 크기를 갖고 있지. 그들이 볼 수 렌더링하려면, 그 크기는 금 프로브 13-15 주위에은이나 금의 퇴적으로 이어질 화학 반응에 의해 확대 될 수있다. 우리가 개발하고 성공적 아세포 수행 Tokuyasu 방법에 근거 IEM 방식을 적용한현지화는 8,16 연구. 이 방법은 형태 8,17-24의 우수한 해상도와 효모 준비에 immunogold 라벨을 수행 할 수 있습니다. 우리는 또한 6 구획은 효모 엔도 좀 시스템의 nanogold 라벨에이 IEM 프로토콜을 결합하는 과정을 설립했다. 우리는 형태 학적 결함 6,25 엔도 좀의 인신 매매와 돌연변이를 엔도 좀의 다른 서브 클래스를 특징으로하고 ultrastructurally 검사 한이 방법을 사용. 또한, 우리는이 nanogold 라벨이 immunogold labelings가 다른 엔도 좀의 모집단에 대한 관심의 단백질의 분포를 탐구 할 수있는 가능성을 제공하는 결합 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 여기에 우리가 적극적으로 청구 nanogold와 효모 엔도 좀 시스템의 라벨을 실질적으로 수행하는 방법을 제시한다.
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Protocol
1. 스페 준비
- 실험의 디자인에 의해 결정되는 해당 매체의 10ml에 30 ° C에서 하룻밤 효모를 배양한다.
- 하루 후, 광도계를 사용하여 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도를 측정 OD 0.2 ~ 0.4의 600에 동일한 배지에서 세포를 희석의 디자인하지 않는 기하 급수적 인 성장 단계로 성장 실험은 다른 조건이 필요합니다. 문화 OD 1 ~ 600이 때 세포는 지수 상에 있습니다.
- 50 ML 튜브에서 5 분 3,500 XG에서 원심 분리하여 세포의 10 OD 600 등가물을 수집합니다. 원심 분리 후, 상층 액을 버린다.
- 100 ㎜ 파이프 (산도 9.6) 5 ㎖, 10 mM의 디티 오 트레이 톨, 10 분 동안 30 ° C에서 배양에서 세포 펠렛을 Resuspend.
- 5 분 3,500 XG에서 원심 분리하여 다시 세포를 수집합니다. 상층 액을 버린다.
- 세포를 재현 탁 전n은 1 M 소르비톨 및 세포 용해 효소의 5 ㎎을 함유 (실험의 디자인에 의해 결정), 부드러운 30 분 동안 진탕 30 ° C의 혼합물을 배양 배지 5 ㎖.
- spheroplasts에 해당 펠릿 분획을 수집하기 위하여 5 분 동안 300 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- 얼음 냉 매체의 960 μL에 spheroplasts을 재현 탁 1 M 소르비톨을 포함 (매체 실험의 디자인에 의해 결정) 및 얼음 냉 2 ㎖ microcentrifuge 관에 혼합물을 전송합니다.
2. Nanogold 통풍 관
- 피펫을 사용하여 부드럽게 물 40 μL에 재현 탁 적극적으로 청구 nanogold 입자의 4 nmol의와 스페 혼합. 혼합물의 최종 부피는 1 ㎖의 수 있습니다.
- 15 분 동안 얼음에 얻은 세포 현탁액을 놓습니다.
- 실온에서 현탁액을 전송하고 E로 nanogold 내재화를 허용하는 데 필요한 시간을 부화ndocytosis.
참고 : 15 분 흡수가 (초기와 후기 엔도 좀) 전체 엔도 좀 시스템을 표시 할 수 있도록 할 것이다 동안 5 분의 흡수는 주로, 세포 내 이입 소포 초기 엔도 솜 구획의 표시로 이어질 것입니다. 긴 배양 시간 (30 분)도 공포에 라벨을 허용합니다.
참고 : 펄스 추적 라벨 실험이 방법을 수행 할 수 없습니다. LE의 분석을 위해 라벨을 때 따라서, nanogold는 PM 및 inEE에서 찾을 수 있습니다.
3. 고정 및 단면
- 강도 2 배 정착액 1 ㎖를 추가하여 nanogold 흡수를 정지 [4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 0.1 M PHEM 버퍼에 0.4 % 글루 타르 알데히드 (GA) (20 mM의 파이프, 50 mM의 HEPES, 산도 6.9, 20 MM의 EGTA, 4 mM의 MgCl2를 2)] 세포 현탁액에 1 M 소르비톨을 함유. 실온에서 튜브를 유지했다.
- 부드럽게 (이것은에 spheroplasts을 유지하기 위해 허용합니다 30 분 동안 micocentrifuge 튜브 수동으로 여러 번 반전정지) 한 후 25 초 동안 1,700 XG에서 두 번 원심 분리.
- 상층 액을 버리고 신선한 표준 강도의 정착액 1 ㎖ (2 % PFA, 0.1 M PHEM 버퍼에 0.2 % GA) 1 M 소르비톨을 포함하고 천천히 회전하는 바퀴에 실온에서 2 시간 동안 배양을 추가하여 정착을 교체합니다.
- 이전 6 설명한 바와 같이 극저온 절편의 세포를 처리합니다. 참고 : nanogold 흡수 및 실버 향상 절차는 지정된 프로토콜에 설명 된 요오드 산 처리를 수행 할 수 없습니다. 요오드 산 처리는 더 나은 셀 벽 (26)을 투과하도록하지만,이 구조는 spheroplasts의 생성 중에 제거되었다.
- 이전 8 설명한 바와 같이 UCT 인해 Ultramicrotome를 사용하여 건조 다이아몬드 나이프와 -120 ° C에서 50 nm의 얇은 저온부 컷 (50) 니켈 그리드 메쉬 코팅 Formvar 탄소에 배치.
Nanogold 입자 기기, 비즈니스를위한 4.은 향상lization
주 : 반응 혼합물을 준비하는 절차는 기본적으로 제조업체가 표시 한 것입니다. 이 프로토콜을 이용하여 실용적인 적응는, 저온부에 실버 개선 절차는 효율적이고 신뢰할 수있다.
- 냉동실에서 실버 향상 키트를 제거하고 37 ° C의 배양기 또는 물을 욕조에 녹여. 해동 할 때 (4.7 참조) 사용할 때까지 어두운 방에 배치 된 24 ° C 배양기에서 장비를 배치합니다.
- 어두운 방에 난방 격판 덮개를 놓고 24 ° C의 최종 온도로 따뜻하게
- 표면 보호, 광택면을 위로하고, 테이프로 고정으로 가열 플레이트의 상단을 커버.
- Benchkote에 파라 필름을 놓고 어둠 속에서 파라 필름의 에지를 볼 수있는 검은 색 마커 가장자리를 표시합니다.
- 가열 플레이트의 온도를 모니터링하기 위해 Benchkote의 상단에 온도계하는 테이프. 점차적으로 온도를 조정하지 않을 경우 24 ° C.
- 괞 찮아증류수 안쪽은 강화 키트 50 ㎖ 튜브 CE.
- 증류수와 작은 페트리 접시를 기입, 37 ℃에서 미리 예열 물에 그리드를 놓고 30 분 동안, 아래면을 표본.
- 이 4.7 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 저장 상자에 격자를 전송하고 어두운 방에 가져.
- 가열 플레이트에 고정 된 파라 필름에 배치 24 ° C에서 증류수 몇 방울에 (아래 시편면)을 전달하여 다시 그리드를 씻어.
- 9 추가 증류수 방울은 강화 반응 후 헹굼, 파라 필름에 대한 준비가되어 있는지 확인합니다.
- 빛을 끄고 모든 표시등이 꺼져 있는지 확인하십시오. 붉은 빛을 켭니다.
- 24 ° C 배양기에서 실버 향상 키트의 A와 B 해결책을보십시오.
- 먼저 솔루션의 6 방울 및 1.5 m의 B 솔루션의 다음 6 방울을 넣어L의 microcentrifuge 관, 거품을 만들 피하는 유리 파스퇴르 피펫으로 잘 섞는다. 용액은 매우 두껍고 수동 최종적 짧게 텍싱 전에 피펫과 혼합되어야한다.
- 다시 24 ° C 배양기에서 A와 B 솔루션을 넣고 C 솔루션을 가지고.
- A / B 믹스 C 용액 6 방울을 추가합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫 우선 다시 혼합 한 후 소용돌이로 교반하여 거품을 만드는 것을 피하십시오.
- 파라 필름에 (~ 20 μL / 드롭) 방울을 배치하여 즉시 최종 혼합물을 사용합니다.
- 깨끗하고, 항 자성 족집게로 얻을 수 싶다고 향상 (금 입자의 예. 크기)의 따라 6 - 15 분 동안 혼합물 (예.,은 강화 반응)에 그리드를 배치합니다.
- 혼합물에서 그리드를 제거하고 세척을 위해 24 ° C에서 삭제 증류수의 상단에이를 전달합니다. 첫째, 빠른 속도로 연속 6 방울의 사용 후 드롭 당 7 분의 배양 시간과 3 방울, 조명을 켜기 전에.
- 다음 단계, EM 조사에 대한 결과를 시각화하기 위해 면역 골드 라벨 또는 막 염색 27도 진행합니다.
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Representative Results
제시된 프로토콜에 따라, 효모 엔도 좀 시스템의 형태가 전송 EM에 의해 액세스 할 수 있습니다. 그림 1에 도달하기 때문에 nanogold로 표지 된 엔도 좀 구획의 다른 유형을 보여줍니다. 은 강화 nanogold 명확 전자 고밀도 입자로 볼 수 있습니다. 실버 인핸스 반응 설정된 최적의 설정은 효모 세포의 미세 구조에 지장이없는 5 ~ 15 nm의 사이의 균일 크기 범위의 금 입자를 구비한다. 세포막뿐만 아니라, LE가 제시된 경우 multivesicular 몸에 흡수 적어도 30 분 (그림 후이 입자에 의해 도달하는 동안 초기 엔도 좀의 구획은 24 ° C에서 5 분간 배양 (그림 1A) 후 nanogold에 액세스 할 수 있습니다 1B). nanogold / 실버 향상 프로토콜과 함께 우리의 IEM 절차 8을 결합의 해상도 전력은 유엔 여기에 설명multivesicular 기관 (그림 1B)의 내부 소포 특히 같이 세포 기관의 형태의 보존과 품질에 의해 derlined.
nanogold라는 효모 엔도 좀 구획의 그림 1. 미세 구조 분석. 제시된 프로토콜에 설명 된대로 Spheroplasts는 야생형 SEY6210 변형 (MATalpha URA3-52 LEU2-3, 112 HIS3-Δ200의 TRP1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 멜 GAL)에서 얻을 수 있었다. Spheroplasts는 다음 10 (패널 A) 또는 30 분 (패널 B) 실온에 전송하기 전에 15 분 동안 4 ° C에서 적극적으로 청구 nanogold 4 nmol의와 함께 배양 하였다. 세포를이어서, 고정 된 바와 같은 제제에 실버 인핸스 반응을 수행하기 전에 8 저온 절편 제작을 위해 가공 하였다제시된 프로토콜. 효모 엔도 좀 시스템의 A. 초기 구획. 세포막 외에 nanogold (5 분)의 짧은 흡수는 단일 소체 (화살촉), 아마도 세포 내 이입 소포 및 관형 구조물 (화살표)의 매우 가능성 초기 엔도 솜의 표시를 허용한다. B. 효모 multivesicular 몸의 미세 구조. 30 분 배양은 LE / multivesicular 기관 (별표)의 표시뿐만 아니라, 초기 엔도 솜에 이르게 및 부품 액포 (도시하지 않음). M, 미토콘드리아; N, 핵; PM, 세포막; V, 공포. 바 = 200 nm의.
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Discussion
면역 전자 현미경은이 단백질이있는 사업자와 세포 소기관의 미세 해상도와 단백질의 현지화를 결합 할 수있는 기술이다. 그 구획은 형광 현미경에서와 구두점 구조를 표시하므로 효모 엔도 솜 시스템을 연구 할 때 특히 중요하다. 그것은 그것들을 구별하는 것이 곤란하다. 이러한 이유로 EM에 의해 검출 및 시간 의존적으로 세포 내 이입 경로를 입력하는 것은 매우 중요하다 프로브의 사용은 특별히 다른 엔도 좀을 표시한다. 이러한 유형의 프로브는 엔도 시토 시스 (6)의 기능을 평가하기 위해 귀중한이며 항혈청 검출 단백질 마커의 부족에 대한 대안이다.
여기에 설명 된 절차를 적극적으로 엔도 좀 구획 레이블을하는 프로브로 nanogold 청구 악용. 저온 절편 제작이 특수 장비와 기술을 필요로하지만, 제시된 프로토콜은 기술적으로 간단하고 다시 사용하지 않습니다특수 기계를 첩. 따라서 그것의 연구에 사용하고자하는 모든 실험실에 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 몇 가지주의 사항은 강화 반응 즉,이 과정의 중요한 단계, 동안 촬영해야합니다. 이 반응은 빛에 매우 민감하기 때문에 방에 (빨간색) 제외한 모든 표시등이 꺼져 및 / 또는 적용해야합니다. 모든 화학 반응으로, 실버 인핸스 반응의 속도는 온도에 의해 영향을 받는다. 동일한 매개 변수를 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 모든 솔루션 및 도구는 신중하게 24 ℃에서 미리 배양 할 필요가 정확하게 반응이 일상적으로 수행 될 방은 강조 용 배양 시간을 설정하는 것이 중요하다. nanogold의 확장은 시각적으로 EM에 의해 금 입자를 감지 할 수 있도록하기 위해 충분히 길어야하는 형태 학적 세부 사항을 커버 할 수 대형 입자의 발생을 방지하기 위해 충분히 짧아야한다. 이 때문에, 따뜻하게 실험실에서이 기술을 설정할 때 파일럿 실험을 수행하도록 제안한다. 테스트 중에 nanogold 입자는 반응을위한 최적의 시간을 결정하기 위하여 다른 시간에 대한 향상된 실버 있어야한다. 참고로, 얻어진 입자의 크기는 균일 한 크기 일 수 없다; 항상 거기에 약간의 이질성 수 있지만, 이것은 5의 범위에서, 가능한 한 최소로 유지되어야합니다 - 15 nm의. nanogold 흡수 절차는 면역 금 labelings과 결합 할 경우에 특히 중요합니다. 결과를 해석 할 때 염두에 두어야 할 또 다른 측면은 펄스 추적 라벨 실험은이 방법으로 할 수 없습니다 것입니다. 따라서 PM과 EE는 LE를 시각화하는 것을 목표로 nanogold 흡수에 표시됩니다.
그것은 여기에 제시 프로토콜의 추가 응용 프로그램을 볼 수있다. 옵션은 형광 microscop와 nanogold 이해의 EM 데이터를 상호 연관시킬 수 있습니다예. FM4-64은 PM과, 공포의 방법에에 동료, 시간 의존적으로 엔도 좀의 구획을 통과하는 친 유성 형광 마커 염료입니다. FM4 - 64 nanogold 모두 지질과 관련하여 세포를 입력하고 그들은 아마 매우 유사 국제화 반응 속도 (28, 29)이있다. 그 결과 두 염료 상관 빛-EM에서 동시에 사용할 수있는 것은 동시에 동적를 탐구하는 접근 및 세포 내 이입 compartments.The의 미세 구조는 방법은 또한 세포 내 이입 시스템 (30)을 통해 수용체 매개 인신 매매에 사용할 수 있습니다 발표했다. nanogold의 Monomaleido 및 모노 - 술포-N-하이드 록시 숙신 유도체가 공유 결합 단백질 6에 이들 입자를 결합하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 또는 α-인자와 상호 연결하는 특정 수용체에 의해이 두 페로몬의 엔도 시토 시스에 따라 허용 할 수 있습니다.
모두 함께, 기술 프로토콜은 투기 할 수 있습니다ifically EM에 의해 검출 할 수있다 endocytosed 프로브를 이용하여 효모 엔도 솜 시스템의 소기관 레이블. 이 실험 도구는 미세 수준에서 효모 엔도 좀 구획의 생합성과 조직을 연구하는 중요한 방법입니다.
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Acknowledgments
저자는 그림의 준비와 지원 르네 Scriwanek 감사합니다. FR은 ALW 오픈 프로그램 (821.02.017 및 822.02.014), DFG-NWO 협력 (DN82-303) 및 ZonMW VICI (016.130.606) 보조금, ECHO (700.59.003)에 의해 지원된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
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