Summary
Gjær, Saccharomyces cerevisiae, har vært et viktig modellorganisme for å identifisere og studere gener som regulerer biogenesis og funksjoner av endosomal system. Her presenterer vi en detaljert protokoll for den spesifikke merking av endosomal avdelinger for ultra studier.
Abstract
Endosomer er en av de store membran sortering av kontrollpunkter i eukaryote celler, og de regulerer gjenvinning eller destruksjon av proteinene stort sett fra plasmamembranen og Golgi. Som et resultat av endosomal systemet spiller en sentral rolle i å opprettholde celle homeostase, og mutasjoner i gener som tilhører dette nettverket av organeller sammen av vesikulært transport, føre til alvorlige sykdommer, inkludert kreft og nevrobiologiske forstyrrelser. Det er derfor av største betydning for å forstå mekanismene bak biogenesis og organisering av endosomal system. Den gjær Saccharomyces cerevisiae har vært sentral i denne oppgaven. For å spesifikt merke og analysere ved ultra nivå endosomal system av denne modellorganisme presenterer vi her en detaljert protokoll for de positivt ladede nanogold opptak av sfæroplaster etterfulgt av visualisering av disse partiklene gjennom en sølv forsterkning reaksjon. Denne metoden er også en verdifull ogsål for den morfologiske undersøkelse av mutanter med defekter i endosomal menneskehandel. Dessuten er det ikke bare anvendelig for ultra undersøkelser, men det kan også kombineres med immunogold labelings for protein lokaliseringsundersøkelser.
Introduction
Den endosomal systemet er en stor membran sortering apparat som spiller flere viktige cellulære roller inkludert smugling av lysosomalenzymet sortering reseptorer og resirkulering av plasmamembran (PM) reseptorer 1,2. Endosomes er delt i tre forskjellige avdelinger, det vil si. tidlig endosomes (EE), avdøde endosomes (LE) og resirkulerings endosomes. Denne klassifiseringen er basert på den tiden det tar for endocytosed materiale for å nå dem, på spesifikke markørproteiner og på deres morfologi. Membraner, dvs. protein og lipid bilayers, internalisert fra PM kan enten leveres til lysosomer via endosomes for degradering eller bli resirkulert tilbake. Membraner blir også transportert til endosomer fra Golgi og tilsvarende, enten fortsette til lysosomer eller hentes tilbake til Golgi. Videre kan proteiner bli sortert inn i luminal vesikler spirende innover fra den endosomal begrensende membran, en prosess som fører til dannelse aven underkategori av LE, de multivesikulære organer.
Gjær endosomal system er relativt mindre kompleks enn den høye eukaryote celler. Gjær endosomer er inndelt i EE og LE. I motsetning til pattedyrceller de ikke inneholder gjenvinnings endosomes men også vevsspesifikke lysosome relaterte organeller. Derfor har de en mindre kompleks nettverk av endosomal smuglerruter 3,4. Derfor gjær har representert og representerer fremdeles en fordelaktig eksperimentelt system for å studere noen av de prinsippene underliggende membran trafikk i endosomal system. Denne fordelen understrekes av det faktum at mange gener involvert i endosomal trasé har vært utgangspunktet isolert med genetiske skjermer i gjær 5. Mens gjær endosomal system i villtype og mutant celler har blitt grundig studert ved hjelp av biokjemiske og fluorescens mikros tilnærminger, har sin etterforskning på ultrastructural nivå bare værtminimal. Morfologiske analyser er spesielt relevant i gjær fordi de fleste av endosomal organ oppdages så Punktum strukturer ved fluorescens mikroskopi, som gjør vanskelige deres utvetydig identifikasjon seks. Dessverre er det bare et begrenset antall antisera erkjenner gjær endosomal protein markører arbeider i immuno-elektron-mikroskopi (IEM) preparater 7-10. For noen proteiner, har dette problemet blitt omgått ved den endogene merking av genet av interesse og anvendelsen av et antistoff gjenkjenner signal for å detektere det 7,11,12. Ofte er imidlertid proteinene er detekterbar ved IEM på grunn av deres lave nivåer. Deres overekspresjon er ikke en løsning fordi denne tilnærmingen kan indusere mis-lokaliseringer og / eller endringer i organelle morfologi / funksjoner. Således merkingen av de endocytiske avdelinger med en sonde påvisbare ved elektronmikroskopi EM er et effektivt alternativ. Dette er en optimal løsning, spesielt hvis det prOBE går inn i endocytic rute i en tidsavhengig måte, noe som gjør det mulig å vite når det vil markere en bestemt organelle seks.
Opptaket av positivt ladede nanogold av gjær sfæroplaster (f.eks. Gjær hvor celleveggen er blitt fjernet enzymatisk) har med hell blitt brukt til å identifisere den gjær endosomal avdelinger 10.. Disse partiklene sterkt bindes til de negativt ladede lipidene som utgjør de biologiske membraner. Således de positivt ladede nanogold forbinder med PM, trenger inn i cellen ved endocytose og går gjennom EE og LE før den når vakuole. Disse små gullpartikler, men ikke har en passende størrelse for å bli sett av EM. For å gjøre dem synlige, kan deres størrelse bli forstørret ved kjemiske reaksjoner som fører til utfelling av sølv eller gull rundt gull probe 13-15. Vi har utviklet og vellykket anvendt en IEM tilnærming basert på Tokuyasu metode for å utføre subcellulærlokalisering studerer 8,16. Denne metoden gjør det mulig å utføre en immunmerking på gjær forberedelser med en utmerket oppløsning på morfologi 8,17-24. Vi har også etablert en prosedyre som kombinerer dette IEM protokollen med nanogold merking av gjær endosomal system avdelinger 6. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi har morfologisk karakterisert forskjellige underklasser av endosomes og ultrastructurally undersøkt mutanter med en endosomal trafficking defekt 6,25. Videre har vi vist at dette nanogold merking kan kombineres med en immun labelings gir muligheten til å utforske fordelingen av et protein av interesse på de ulike endosome subpopulasjoner. Her presenterer vi hvor merking av gjær endosomal system med positivt ladede nanogold er praktisk talt utført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Sfæroplastkvalitet Forberedelse
- Inkuber gjæren over natten ved 30 ° C i 10 ml av det hensiktsmessige medium bestemmes av utformingen av forsøket.
- Dagen etter, å måle den optiske tetthet av kulturen ved 600 nm (OD 600) ved hjelp av et fotometer, Fortynn cellene i det samme kulturmedium til en OD 600 på 0,2 til 0,4, og dyrke dem i en eksponensiell vekstfase med mindre utforming Eksperimentet krever en annen tilstand. Cellene er i den eksponentielle fasen når kulturen har en OD 600 av 1-2.
- Samle 10 OD 600 ekvivalenter av celler ved sentrifugering ved 3500 xg i 5 min i et 50 ml rør. Etter sentrifugering, kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM ditiotreitol og inkubert ved 30 ° C i 10 min.
- Samle igjen cellene ved sentrifugering ved 3500 xg i 5 min. Kast supernatanten.
- Suspender cellene in 5 ml medium (bestemt av utformingen av eksperimentet) inneholdende 1 M sorbitol og 5 mg av lytiske enzym, og inkuberes blandingen ved 30 ° C med forsiktig risting i 30 min.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 minutter for å samle opp pelleten fraksjon, som svarer til de sfæroplaster. Kast supernatanten.
- Resuspender sfæroplaster i 960 mL iskald media (medium bestemmes av utformingen av eksperimentet) inneholdende 1 M sorbitol, og overfører blandingen i en iskald 2 ml mikrosentrifugerør.
2. Nanogold Opptak
- Ved hjelp av en pipette, bland forsiktig av spheroplast med 4 nmol av positivt ladede partikler nanogold resuspenderes i 40 pl vann. Det endelige volum av blandingen må være av en ml.
- Plasser den oppnådde cellesuspensjonen på is i 15 min.
- Overfør suspensjonen ved romtemperatur og inkuber den for den nødvendige tid for å tillate nanogold internalisering av endocytosis.
MERK: En 5 min opptak i hovedsak vil føre til merking av endocytiske vesikler og tidlig endosomal avdelinger, mens en 15 min opptak vil tillate å markere hele endosomal systemet (tidlig og sent endosomes). Lengre inkubasjonstidene (mer enn 30 min) vil også tillate å merke vakuole.
MERK: Puls-chase merking eksperimenter kan ikke utføres med denne metoden. Derfor, når merking for analyse av LE, nanogold vil også bli funnet på PM og inEE.
Tre. Fiksering og seksjonering
- Stopp nanogold opptak ved å legge til en ml av dobbel styrke fiksativ [4% Paraformaldehyde (PFA), 0,4% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M PHEM buffer (20 mm rør, 50 mMHEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2)] inneholdende 1 M sorbitol til cellesuspensjonen. Holdt på røret ved romtemperatur.
- Vend forsiktig manuelt micocentrifuge rør flere ganger i løpet av 30 min (dette vil tillate å holde sfæroplaster isuspensjon) og deretter sentrifugere den to ganger ved 1700 xg i 25 sek.
- Sett på fiksativ ved å forkaste supernatanten og ved tilsetning av 1 ml friskt standard styrke fiksativ (2% PFA, 0,2% GA i 0,1 M PHEM buffer) inneholdende 1 M sorbitol, og inkuber i 2 timer ved romtemperatur på en langsomt roterende hjul.
- Behandle celler for Cryo-seksjonering som beskrevet tidligere seks. NB: For nanogold opptak og sølv ekstrautstyr prosedyrer, den periodiske syrebehandling som er beskrevet i det angitte protokoll har ikke til å bli utført. Den periodiske syrebehandling er å bedre permeabilize celleveggen 26, men denne struktur har blitt eliminert ved generering av sfæroplaster.
- Skjær 50 nm tynne cryosections ved -120 ° C med tørr diamant kniv ved hjelp av en UCT ultramicrotome som tidligere beskrevet åtte og plassere dem på Formvar karbon belagt 50 maskene nikkel nett.
4. Silver Enhancement for Nanogold Particle visuajonssone
MERK: Fremgangsmåten for å forberede reaksjonsblandinger er i utgangspunktet det som er angitt av produsenten. Praktiske tilpasninger som bruker denne protokollen, gjør sølv forbedringsprosedyren effektiv og pålitelig på cryosections.
- Fjern sølv forsterkning kit fra fryseren og tines det i en 37 ° C inkubator-eller vannbad. Når tint, plassere settet i en 24 ° C inkubator plasseres i et mørkt rom inntil bruk (se 4.7).
- Plasser den varme plate i det mørke rommet, og varme den til den endelige temperatur på 24 ° C.
- Dekk toppen av varmeplate med overflatebeskytter, blanke siden opp, og fest den med en tape.
- Plasser Parafilm på Benchkote og merke kantene med en svart markør for å være i stand til å se de Parafilm kanter i mørket.
- Tape et termometer på toppen av Benchkote for å overvåke temperaturen av varmeplaten. Justere temperaturen gradvis om ikke 24 ° C.
- Place i 50 ml rør med dobbelt destillert vann, og den sølv forbedring sett inni.
- Fyll de små petriskåler med dobbelt destillert vann, forvarmet til 37 ° C. Plasser gitrene i vannet, prøvesiden ned, i 30 min.
- Gjenta dette 4.7 trinn én gang til.
- Overfør nett i oppbevaringsboksen, og ta dem med til det mørke rommet.
- Skyll gitrene på nytt ved å føre dem (med prøvesiden ned) ved flere dråper av dobbelt destillert vann ved 24 ° C som er plassert på Parafilm som er festet på varmeplaten.
- Sørg for at ni ekstra doble destillert vann dråper er klar på Parafilm, for skylling etter sølv ekstrautstyr reaksjon.
- Slå av lyset og sørge for at alle lysene er slukket. Slå det røde lyset på.
- Ta ut A-og B oppløsninger av sølv forsterkning kit fra 24 ° C inkubator.
- Sett første 6 dråper av en løsning, og deretter 6 dråper av løsning B i et 1,5 ml mikrosentrifuge tube, og bland godt med et glass Pasteur pipette unngå å lage bobler. Løsningen er ganske tykk, og det må være manuelt blandes med en pipette før endelig å virvle det kort.
- Sett A-og B-løsninger tilbake i 24 ° C inkubator og ta ut den C-løsning.
- Tilsett 6 dråper av C løsning av A / B-blandingen. Bland deretter igjen først med en Pasteur pipette og deretter ved virvling, unngå å lage bobler.
- Bruk straks den endelige blanding ved å plassere dråper (~ 20 mL / dråpe) på Parafilm.
- Med en ren, anti-magnetisk pinsett, legg ristene på blandingen (f.eks., Sølv styrke reaksjon) for 6 til 15 min avhengig av ekstrautstyr (ie. Størrelsen på gullpartikler) ønsket å bli innhentet.
- Fjern gitrene fra blandingen og gi den videre til toppen av dobbelt destillert vann synker ved 24 ° C for hver vask. Bruk først i raskt rekkefølge 6 dråper og deretter tre dråper med 7 min inkubasjonstid per dråpe, Før du slår av lysene på.
- Fortsett til neste trinn, enten immun-gull merking eller membranfarging 27 for å visualisere resultatet for en EM etterforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I henhold til den fremlagte protokoll, kan morfologien til gjær endosome systemet være tilgang av overførings EM. Figur 1 viser forskjellige typer av endosomal avdelinger som er blitt nådd, og derfor merket med nanogold. Sølvet forbedret nanogold kan tydelig ses som elektron tette partikler. De optimale innstillinger som er fastsatt for sølv forsterkning reaksjonen tillater at gullpartiklene i en homogen størrelsesområdet mellom 5 og 15 nm, som ikke forstyrrer den ultrastructure av gjærcellen. Plasma membran samt tidlige endosomal avdelinger er tilgjengelige for nanogold etter en 5 min inkubasjon ved 24 ° C (figur 1A) mens LE, i de presenterte case multivesikulære organer, kan nås av disse partiklene etter minst 30 min av opptak (Figur 1B). Oppløsningen makt for å kombinere vår IEM prosedyre 8 med nanogold / sølv ekstrautstyr protokollen beskrevet her er underlined ved bevaringen og kvaliteten på morfologien til de viste organeller, spesielt de innvendige vesikler fra de multivesikulære organer (figur 1B).
Figur 1. Ultrastructural analyse av nanogold merket gjær endosomal avdelinger. Sfæroplaster ble hentet fra villtype SEY6210 belastning (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 TRP1-proinotoren-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 mel GAL) som beskrevet i den presenterte protokollen. Sfæroplaster ble deretter inkubert med 4 nmol av positivt ladede nanogold ved 4 ° C i 15 minutter før den ble overført til romtemperatur 10 (panel A) eller 30 min (panel B). Celler ble senere løst, bearbeidet for frysesnitt 8 før du utfører sølv ekstrautstyr reaksjon på preparatet som beskreveti den presenterte protokollen. A. Tidlige avdelinger av gjær endosomal system. I tillegg til plasma-membran, tillater en kort opptak av nanogold (5 min) for merking av enkelt-vesikler (pilspisser), eventuelt endocytiske vesikler, og av rørformede strukturer (pil), meget sannsynlig tidlige endosomer. B. Gjær multivesicular kroppen ultrastructure. En 30 min inkubasjon fører til merking av LE / multivesikulære organer (skjult), men også tidlig endosomes og delvis vakuoler (ikke vist). M, mitokondrier; N, kjernen; PM, plasma membran; V, vakuole. Bar = 200 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-elektron-mikroskopi er en teknikk som gjør det mulig å kombinere lokalisering av proteiner med ultrastructural oppløsning av bærere og organeller, der disse proteinene bor. Dette er spesielt viktig når man studerer gjær endosomal system fordi dets avdelinger vises som Punktum strukturer i fluorescens mikroskopi. Det er derfor vanskelig å skille dem. Av denne grunn er bruk av en probe detekteres ved hjelp av EM og inn i endocytiske vei i en tidsavhengig måte er avgjørende for å spesifikt merke de forskjellige endosomer. Denne type sonde er verdifull for å vurdere funksjonaliteten til endocytose 6, og det er et alternativ til den manglende antisera påvise proteinmarkører.
Den fremgangsmåte som er beskrevet her utnytter positivt ladet nanogold som en probe til å merke endosomal seksjonene. Mens frysesnitt krever spesielt utstyr og kompetanse, er det presenteres protokollen teknisk enkel og ikke rekoret spesielle maskiner. Derfor er det tilgjengelig for ethvert laboratorium som ønsker å bruke det til sin forskning. Men noen forholdsregler må tas under den kritiske trinn av denne fremgangsmåten, dvs. sølv forsterkning reaksjonen. Denne reaksjonen er svært følsom for lys, og derfor alle lysene (bortsett fra den røde) i rommet må være slått av og / eller dekket. Som alle kjemiske reaksjoner, er hastigheten av sølvet forsterkning reaksjon påvirket av temperaturen. For å oppnå konsistente og reproduserbare resultater ved bruk av de samme parametere, alle løsninger og verktøy må være nøye preinku-bert ved 24 ° C. Det er viktig å nøyaktig fastslå Inkubasjonstiden for sølv forbedring i rommet hvor denne reaksjonen blir rutinemessig utført. Utvidelse av nanogold må være lang nok for å kunne være i stand til visuelt å detektere gull partikkel av EM, og må være kort nok til å unngå dannelsen av for store partikler, som kan dekke morfologiske detaljer. Av denne grunn er det varmt slått å utføre et pilotforsøk ved innstilling av denne teknikken i laboratoriet. I løpet av denne test på nanogold partiklene må være sølv forbedret for forskjellige tider for å bestemme den optimale tid for reaksjonen. Til opplysning kan dimensjonene på de oppnådde partiklene ikke være av homogen størrelse; det vil alltid være noen heterogenitet men dette må holdes så minimal som mulig, i et område mellom 5 - 15 nm. Dette er spesielt viktig hvis nanogold opptak prosedyre vil bli kombinert med immuno-gull labelings. Et annet aspekt som skal holdes i bakhodet når man skal tolke resultatene er at puls-chase merking eksperimenter er ikke mulig med denne metoden. Følgelig PM og EE blir også merkes i en nanogold opptak rettet til å visualisere LE.
Det er også mulig å se ytterligere anvendelser av protokoll er presentert her. Et alternativ kan være å korrelere EM-data av nanogold opptak med fluorescerende mikroskopy. FM4-64 er en lipofil fluoriserende fargestoff fargestoff som tilknyttede PL, og på sin vei til vakuolen, passerer gjennom endosomal seksjoner på en tidsavhengig måte. Både FM4-64 og nanogold inn i cellen i forbindelse med lipider, og de har trolig svært lik internalisekinetikk 28,29. Som et resultat av begge fargestoffer kan brukes på samme tid i correlative lys-EM tilnærminger for samtidig å utforske den dynamiske og den ultra av endocytic compartments.The frem fremgangsmåte kan også brukes til å reseptormediert handel via endocytic system 30.. Monomaleido og mono-sulfo-N-hydroksy-succinimido-derivater med nanogold kan benyttes for kovalent å binde disse partiklene til proteiner 6. For eksempel tverrbinding med a-eller α-faktoren kan gi etter endocytose av disse to feromoner fra deres spesifikke reseptorer.
Alle sammen, gjør at den beskrevne protokollen til specifically merke organeller av gjæren endosomal systemet ved hjelp av en endocytosed probe, noe som kan gjøres påvisbart ved EM. Dette eksperimentelle verktøyet er en verdifull tilnærming til å studere biogenesis og organisering av gjær endosomal avdelinger på ultrastructural nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker René Scriwanek for bistand ved utarbeidelse av figuren. FR er støttet av ECHO (700.59.003), ALW Åpne Program (821.02.017 og 822.02.014), DFG-NWO samarbeid (DN82-303) og ZonMW Vici (016.130.606) tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
