Summary
A levedura Saccharomyces cerevisiae, tem sido um organismo chave modelo para identificar e estudar genes que regulam a biogênese e funções do sistema endosomal. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a rotulagem específica dos compartimentos endossomais para estudos ultra-estruturais.
Abstract
Endossomos são um dos principais membrana triagem checkpoints em células eucarióticas e que regulam a reciclagem ou destruição de proteínas principalmente a partir da membrana plasmática e do Golgi. Como resultado, o sistema endossomal desempenha um papel central na manutenção da homeostase celular, e mutações em genes pertencentes a esta rede de organelos interligadas por transporte vesicular, causar patologias graves, incluindo o cancro e desordens neurobiológicos. Por isso, é de relevância primordial para compreender os mecanismos subjacentes à biogênese e organização do sistema endosomal. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido fundamental nessa tarefa. Para identificar e analisar especificamente em nível ultra-estrutural do sistema endosomal deste organismo modelo, apresentamos aqui um protocolo detalhado para a captação nanogold carregada positivamente por esferoplastos seguido pela visualização dessas partículas através de uma reação aprimoramento prata. Este método também é muito valiosol para o exame morfológico de mutantes com defeitos de tráfico endosomal. Além disso, não é aplicável apenas para exames ultraestruturais, mas também pode ser combinado com rotulamentos imunomarcação para investigações de localização de proteínas.
Introduction
O sistema endossomal é um grande aparelho de separação de membrana, que desempenha várias funções celulares importantes incluindo o tráfico de enzima lisossomal receptores de triagem e a reciclagem de membrana plasmática (PM) de receptores de 1,2. Endossomos são divididos em três compartimentos diferentes, isto é,. os primeiros endossomas (EE), os endossomas tardios (LE) e os endossomas de reciclagem. Esta classificação baseia-se o tempo que leva para o material de endocitose para os alcançar, em proteínas marcadoras específicas e à sua morfologia. Membranas, ou seja, proteínas e lipídios bicamadas, internalizadas do PM pode ser entregue a lisossomos via endossomos para a degradação ou ser reciclado. As membranas são também transportadas para os endossomas de Golgi e da mesma forma, ou continuar a lisossomas ou ser recuperado de volta para o Golgi. Além disso, as proteínas podem ser classificados em vesículas luminais brotamento para dentro a partir da limitação da membrana endossomal, um processo que leva à formação deuma subcategoria de LE, os corpos multivesiculares.
O sistema endossomal levedura é relativamente menos complexo do que o de células eucarióticas elevados. Endosomes fúngicas são divididas em EE e LE. Em contraste com células de mamíferos que não contêm endossomas de reciclagem, mas também organelas relacionadas com lisossoma específicos de tecidos. Conseqüentemente, eles têm uma rede menos complexo de rotas de tráfico endossomais 3,4. Portanto levedura representou e ainda representa um sistema experimental vantajoso para estudar alguns dos princípios tráfego membrana subjacente no sistema endosomal. Esta vantagem é realçada pelo facto de que numerosos genes envolvidos nas vias endossomais foram inicialmente isolado com telas genéticas na levedura 5. Enquanto o sistema endossomal levedura no tipo selvagem e mutantes de células tem sido extensamente estudada utilizando abordagens bioquímicas e de microscopia de fluorescência, a investigação ao nível ultra-estrutural tem sido somentemínima. As análises morfológicas são particularmente relevantes na levedura, porque a maioria das organelas endossomais são detectados como estruturas pontuar por microscopia de fluorescência, o que torna difícil a sua identificação inequívoca 6. Infelizmente, apenas um número limitado de anti-soros reconhecer marcadores de proteína de levedura endossomais está trabalhando em imuno-elétron-microscópio (IEM) preparações 7-10. Para algumas proteínas, este problema tem sido contornado pela marcação endógena do gene de interesse e a utilização de um anticorpo que reconhece a marca para detectar 7,11,12. Muitas vezes, no entanto, as proteínas são indetectáveis pelo IEM por causa dos seus baixos níveis de expressão. Sua superexpressão não é uma solução porque esta abordagem pode induzir mal-localizações e / ou alterações nas organelas de morfologia / funções. Assim, a rotulagem dos compartimentos endocíticas com uma sonda detectável por microscopia eletrônica de EM é uma opção eficaz. Esta é uma solução óptima, especialmente se o probe está a entrar no percurso de endocitose de uma maneira dependente do tempo, o que permite saber quando se vai marcar um organelo específico 6.
A absorção de nanogold carregado positivamente por esferoplastos de levedura (ou seja. Levedura em que a parede celular foi removida enzimaticamente) tem sido utilizado com sucesso para identificar o endossomal levedura compartimentos 10. Estas partículas ligam-se fortemente com os lípidos carregados negativamente que compõem as membranas biológicas. Assim, os associados nanogold carregados positivamente com o PM, penetra na célula por endocitose, e passa através do EE e LE antes de atingir o vacúolo. Estas pequenas partículas de ouro, no entanto, não têm um tamanho adequado para ser visto por EM. Para torná-los visíveis, seu tamanho pode ser ampliada por meio de reações químicas que levam à deposição de prata ou de ouro ao redor da sonda ouro 13-15. Nós desenvolvemos e aplicado com sucesso uma abordagem IEM com base no método de realizar Tokuyasu subcelularlocalização estuda 8,16. Este método permite realizar imunomarcação em preparações de levedura com uma excelente resolução da morfologia 8,17-24. Temos também estabeleceu um procedimento que combina este protocolo IEM com a rotulagem nanogold do sistema de levedura endosomal compartimentos 6. Usando essa abordagem, temos caracterizados morfologicamente diferentes subclasses de endosomes e ultraestruturalmente examinado mutantes com um tráfico endosomal defeito 6,25. Além disso, foi demonstrado que esta rotulagem nanogold pode ser combinado com rotulamentos imunomarcação proporcionando a possibilidade de explorar a distribuição de uma proteína de interesse nas diferentes subpopulações de endossoma. Aqui apresentamos como a rotulagem do sistema de levedura endosomal com nanogold carga positiva está praticamente realizado.
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Protocol
1. Esferoplastos Preparação
- Incubar a levedura durante a noite a 30 ° C em 10 ml do meio apropriado determinado pela concepção da experiência.
- No dia seguinte, medir a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um fotómetro, Diluir as células no mesmo meio de cultura para uma DO 600 de 0,2-0,4 e crescem-los a uma fase de crescimento exponencial, a menos que o desenho do experimento requer uma condição diferente. As células estão na fase exponencial quando a cultura tem uma OD 600 de 1-2.
- Recolha 10 OD 600 equivalentes de células por centrifugação a 3500 xg durante 5 min num tubo de 50 ml. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de 100 mM de PIPES (pH 9,6), ditiotreitol 10 mM e incubou-se a 30 ° C durante 10 min.
- Recolha de novo as células por centrifugação a 3500 xg durante 5 min. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células in 5 ml de meio (determinados pelo desenho do experimento) contendo 1 M de sorbitol e 5 mg de enzima lítica, e incubam-se a mistura a 30 ° C com agitação suave durante 30 min.
- Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 minutos para recolher a fracção de sedimento, que corresponde aos esferoplastos. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender os esferoplastos em 960 ul de meios de gelo frio (média determinada pelo desenho do experimento) contendo 1 M de sorbitol e transfere-se a mistura em um gelado de 2 ml tubo de microcentrífuga.
2. Nanogold Absorção
- Com uma pipeta, misture delicadamente o esferoplasto com 4 nmol de partículas carregadas positivamente nanogold ressuspendido em 40 mL de água. O volume final da mistura deve ser de 1 ml.
- Colocar a suspensão de células obtidas em gelo durante 15 min.
- Transferir a suspensão à temperatura ambiente e incubam-lo durante o tempo necessário para permitir a internalização por e nanogoldndocytosis.
NOTA: A 5 min a captação vai, principalmente, para a rotulagem de vesículas de endocitose e compartimentos endossomais iniciais, enquanto a 15 min captação permitirá marcar todo o sistema endosomal (precoce e endosomes final). Tempos de incubação mais longos (mais de 30 min) também vai permitir a rotular o vacúolo.
NOTA: experiências de marcação de pulso de perseguição não pode ser realizado com este método. Portanto, quando a rotulagem para a análise de LE, nanogold também serão encontrados no PM e INEE.
3. Fixação e Seccionamento
- Pare a absorção nanogold por adição de 1 ml de fixador força dupla [4% de paraformaldeído (PFA), 0,4% de glutaraldeído (GA) em tampão de 0,1 M PHEM (PIPES 20 mM, HEPES 50 mM, pH 6,9, EGTA 20 mM, MgCl 4 mM 2)] contendo 1 M de sorbitol à suspensão de células. Mantido o tubo à temperatura ambiente.
- Inverter cuidadosamente manualmente os tubos micocentrifuge várias vezes durante 30 minutos (isto irá permitir manter os esferoplastos emsuspensão) e em seguida, centrifugar duas vezes em 1700 xg por 25 seg.
- Substituir o fixador, descartando-se o sobrenadante e adicionando 1 ml de fixador fresco força padrão (2% de PFA, a 0,2% em tampão de GA PHEM 0,1 M) contendo 1 M de sorbitol e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente em uma roda de rotação lenta.
- Processar as células de crio-seccionamento, tal como descrito anteriormente 6. NOTA: Para os procedimentos de aumento de absorção nanogold e prata, o tratamento com ácido periódico descrito no protocolo indicado não tem de ser executada. O tratamento com ácido periódico é melhor permeabilizar a parede da célula 26, mas esta estrutura tem sido eliminado durante a geração de esferoplastos.
- Cortar 50 criossecções delgadas Nm a -120 ° C com faca de diamante seco usando uma UCT ultramicrótomo como descrito anteriormente 8 e colocá-los em carbono Formvar revestido 50 malhas de redes de níquel.
4. Prata Enhancement para Nanogold Particle Visualização
NOTA: O procedimento para preparar as misturas de reação é, basicamente, a indicada pelo fabricante. Adaptações práticas que utilizam este protocolo, torna o procedimento de aumento de prata eficaz e confiável em criossecções.
- Retirar o kit de melhoria de prata do congelador e descongelar em uma incubadora a 37 ° C ou banho de água. Quando descongelado, coloque o kit em uma incubadora de 24 ° C colocado em uma sala escura até a sua utilização (ver 4.7).
- Colocar a placa de aquecimento na câmara escura e de aquecê-lo até a temperatura final de 24 ° C.
- Cubra o topo da placa de aquecimento com o protetor de superfície, o lado brilhante para cima, e prenda-o com uma fita.
- Coloque o Parafilm na Benchkote e marcam as arestas com um marcador preto para ser capaz de ver as bordas Parafilm no escuro.
- Tape um termómetro no topo da Benchkote para monitorizar a temperatura da placa de aquecimento. Ajustar gradualmente a temperatura se não for 24 ° C.
- Place o tubo de 50 ml com água bidestilada e do kit acessório de prata no interior.
- Encha as pequenas placas de Petri com água duplamente destilada, pré-aquecido a 37 ° C. Coloque as grades na água, espécime lado de baixo, por 30 min.
- Repita este passo 4.7 mais uma vez.
- Transfira as grades na caixa de armazenamento e trazê-los para a sala escura.
- Lavar as grelhas de novo, passando-os (com o lado da amostra para baixo) em várias gotas de água bi-destilada a 24 ° C colocados no parafilme que foi imobilizado na placa de aquecimento.
- Certifique-se que nove duplas gotas de água destilada adicionais estão prontos na Parafilm, para o enxágüe após a reação aprimoramento prata.
- Desligar a luz e certifique-se de que todas as luzes estão apagadas. Desligue a luz vermelha.
- Retire das soluções A e B do estojo de prata reforço da incubadora 24 ° C.
- Coloque primeiros seis gotas de solução A, e depois 6 gotas de solução B em um 1,5 mtubo de microcentrífuga de l, e misturar bem com uma pipeta de Pasteur de vidro evitando fazer bolhas. A solução é bastante espesso e tem que ser misturada manualmente com uma pipeta, antes de finalmente vortex brevemente.
- Coloque as soluções A e B de volta na incubadora 24 ° C e retire a solução C.
- Adicionar 6 gotas da solução de C para a mistura A / B. Em seguida, misture novamente em primeiro lugar com uma pipeta Pasteur e, em seguida, em vórtice, evite fazer bolhas.
- Utilizar imediatamente a mistura final colocando gotas (~ 20 ul / gota) no Parafilm.
- Com uma limpeza, pinças anti-magnéticos, colocar as grades na mistura (por exemplo,., Reacção prata reforço) para 6 a 15 minutos, dependendo do acessório (ou seja,. Tamanho das partículas de ouro), que pretendia ser obtido.
- Retirar as grelhas a partir da mistura e passa-os no topo da água bi-destilada, gotas, a 24 ° C durante as lavagens. Em primeiro lugar, usar em rápida sucessão 6 gotas e, em seguida, 3 gotas com 7 min tempo de incubação por gota, Antes de virar as luzes acesas.
- Vá para a próxima etapa, ou rotulagem imuno-ouro ou coloração da membrana 27, a fim de visualizar o resultado de uma investigação EM.
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Representative Results
De acordo com o protocolo apresentado, a morfologia do sistema de levedura do endossoma podem ser acesso por EM transmissão. Figura 1 mostra diferentes tipos de compartimentos endossomais que foram alcançados e, por conseguinte, rotulados com nanogold. O nanogold reforçada-prata pode ser visto claramente como electrões partículas densas. As configurações óptimas estabelecidas para a reacção de reforço prata permite que possui partículas de ouro numa gama de tamanho homogéneo entre 5 e 15 nm, o que não interfere com a ultra-estrutura da célula de levedura. Membrana plasmática, bem como os compartimentos endossomais iniciais são acessíveis ao nanogold após 5 minutos de incubação a 24 ° C (Figura 1A) enquanto LE, nos corpos multivesiculares apresentado caso, são acessíveis por estas partículas após pelo menos 30 minutos de absorção (Fig. 1B). O poder de resolução de combinar o nosso procedimento IEM 8 com o protocolo de aprimoramento nanogold / silver aqui descrito é underlined pela conservação e qualidade da morfologia das organelas mostrados, em particular, as vesículas internas dos corpos multivesiculares (Figura 1B).
Análise Figura 1. Ultraestrutural de nanogold rotulado compartimentos levedura endossomais. Os esferoplastos foram obtidos a partir da estirpe SEY6210 tipo selvagem (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp1-Δ901 Iys2-801 suc2-Δ9 mel GAL) como descrito no protocolo apresentado. Os esferoplastos foram então incubadas com 4 nmol de nanogold carregada positivamente a 4 ° C durante 15 minutos antes de ser transferida para a temperatura ambiente durante 10 (painel A) ou 30 min (painel B). As células foram subsequentemente fixadas, processadas para cryosectioning 8 antes de realizar a reacção de reforço de prata na preparação como descritono protocolo apresentado. A. Os primeiros compartimentos do sistema levedura endosomal. Para além da membrana de plasma, um curto absorção do nanogold (5 minutos) permite a marcação de vesículas individuais (pontas de seta), vesículas endocíticas, e, possivelmente, de estruturas tubulares (seta), é muito provável que os endossomas precoces. B. Levedura ultraestrutura corpo multivesicular. A 30 minutos de incubação leva à rotulagem de LE / organismos multi-vesiculares (asteriscos), mas também os endossomas precoces e em vacúolos parte (não mostrada). M, as mitocôndrias; N, núcleo; PM, membrana plasmática; V, vacúolo. Bar = 200 nm.
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Discussion
Imuno-microscopia de electrões é uma técnica que permite a combinação de localização de proteínas com a resolução ultra-estrutural das transportadoras e organelos onde estas proteínas residem. Isto é particularmente importante quando se estuda o sistema de levedura endosomal porque seus compartimentos aparecem como estruturas pontuar em microscopia de fluorescência. Por isso, é difícil distingui-los. Por esta razão, o uso de uma sonda detectável por EM e entrar na rota endocítica numa forma dependente do tempo é crucial para marcar especificamente as diferentes endossomas. Este tipo de teste é importante para avaliar a funcionalidade de endocitose 6 e é uma alternativa para a falta de detecção de anti-soros marcadores proteicos.
O procedimento aqui descrito explorar carregado positivamente nanogold como uma sonda para identificar os compartimentos endossomais. Enquanto cryosectioning requer equipamento especial e habilidades, o protocolo apresentado é tecnicamente fácil e não require máquinas especiais. Por isso, é acessível a qualquer laboratório que gostaria de usá-lo para a sua pesquisa. No entanto, algumas precauções devem ser tomadas durante a fase crítica deste processo, ou seja, a reação aprimoramento prata. Esta reação é muito sensível à luz e, portanto, todas as luzes (exceto o vermelho) na sala tem que ser desligado e / ou cobertas. Como todas as reacções químicas, a velocidade da reacção de reforço de prata é influenciada pela temperatura. Para obter resultados consistentes e reprodutíveis usando os mesmos parâmetros, todas as soluções e as ferramentas têm de ser cuidadosamente pré-incubado a 24 ° C. É fundamental estabelecer com precisão o tempo de incubação para o reforço de prata na sala onde esta reação será realizada de forma rotineira. Expansão da nanogold tem de ser longa o suficiente para ser capaz de detectar visualmente a partículas de ouro por EM e tem de ser suficientemente curto para evitar a geração de partículas de grandes dimensões, que poderiam cobrir detalhes morfológicos. Por esta razão, é muito bem sugerido realizar uma experiência piloto ao configurar esta técnica no laboratório. Durante este ensaio, as partículas têm de ser nanogold prata aumentada para diferentes tempos para determinar o tempo óptimo para a reacção. Digno de nota, as dimensões das partículas obtidas não pode ser de tamanho homogéneo; haverá sempre alguma heterogeneidade, mas esta tem de ser mantida tão mínima quanto possível, num intervalo entre 5-15 nm. Isto é particularmente importante se o processo de absorção nanogold será combinada com rotulamentos imuno-ouro. Outro aspecto a se ter em mente na interpretação dos resultados é que as experiências de rotulagem pulse-chase não são possíveis com este método. Consequentemente, o PM e EE serão também rotulados de captação nanogold teve como objetivo visualizar LE.
É também possível ver as aplicações adicionais do protocolo aqui apresentado. Uma opção poderia ser a de correlacionar os dados de EM de captação nanogold com microscop fluorescentey. FM4-64 é um corante marcador fluorescente lipofílico que associa a PM e, no seu caminho para o vacúolo, é que passa através dos compartimentos endossomais numa forma dependente do tempo. Ambos FM4-64 e nanogold entrar na célula em associação com lípidos e que têm, provavelmente, a cinética de internalização muito semelhantes 28,29. Como resultado os dois corantes pode ser usado ao mesmo tempo em correlativo luz-EM abordagens para explorar, simultaneamente, a dinâmica e a ultra-estrutura do endocítica compartments.The apresentado método também pode ser utilizado para o tráfico mediada por receptor pelo sistema endocítico 30. Derivados Monomaleido e mono-sulfo-N-hidroxi-succinimido do nanogold pode ser utilizado para ligar covalentemente estas partículas de proteínas de 6. Por exemplo, a reticulação com um a-ou o factor-α pode permitir que se segue a endocitose destes dois feromonas pelos seus receptores específicos.
Tudo junto, o protocolo descrito permite especificarifically rotular os organelos do sistema endossomal levedura utilizando uma sonda sujeita a endocitose, o que pode ser feito detectável por EM. Esta ferramenta experimental é uma ferramenta valiosa para estudar a biogénese e organização dos compartimentos endossomais levedura ao nível ultra-estrutural.
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Acknowledgments
Os autores agradecem René Scriwanek pela ajuda com a preparação da Figura. FR é suportado pelo ECHO (700.59.003), ALW Programa Open (821.02.017 e 822.02.014), a cooperação DFG-NWO (DN82-303) e ZonMW VICI (016.130.606) subvenções.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
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