Summary
Gær, Saccharomyces cerevisiae, har været en vigtig model organisme for at identificere og studere gener, der regulerer den biogenese og funktioner endosomale system. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for særlig mærkning af de endosomale rum til ultrastrukturelle studier.
Abstract
Endosomer er en af de større membran sortering checkpoints i eukaryote celler, og de regulerer genanvendelse eller destruktion af proteiner meste fra plasmamembranen og Golgi. Som følge den endosomale system spiller en central rolle i at opretholde cellehomeostase, og mutationer i gener hører til dette netværk af organeller forbundet ved vesikulær transport forårsage alvorlige patologier, herunder cancer og neurobiologiske lidelser. Det er derfor af afgørende betydning for at forstå mekanismerne bag biogenese og organisering af endosomale system. Gæren Saccharomyces cerevisiae har været afgørende i denne opgave. Til specifikt mærke og analyserer på det ultrastrukturelle niveau endosomale system af denne model organisme, præsenterer vi her en detaljeret protokol for positivt ladede nanogold optagelse af spheroplaster efterfulgt af visualisering af disse partikler gennem en sølv ekstraudstyr reaktion. Denne metode er også et værdifuldt forl for den morfologiske undersøgelse af mutanter med defekter i endosomal menneskehandel. Desuden er det ikke kun gælder for ultrastrukturelle undersøgelser, men det kan også kombineres med immunguld labelings for protein localization undersøgelser.
Introduction
Det endosomal er et stort membran sortering apparat, der spiller flere vigtige cellulære roller, herunder handel med lysosomale enzym sortering receptorer og genbrug af plasmamembranen (PM) receptorer 1,2. Endosomes er opdelt i tre forskellige rum, dvs. de tidlige endosomes (EE), den afdøde endosomes (LE) og genbrug endosomes. Denne klassifikation er baseret på den tid det tager for endocytose materiale til at nå dem, om specifikke markørproteiner og på deres morfologi. Membraner, dvs protein-og lipid-dobbeltlag, internaliserede fra PM kan enten leveres til lysosomer via endosomes til nedbrydning eller genbruges tilbage. Membraner er også transporteres til endosomes fra Golgi og på samme måde, enten fortsætte til lysosomer eller blive hentet tilbage til Golgi. Desuden kan proteiner sorteres i luminale vesikler spirende indad fra den endosomale begrænsende membran, en proces, der fører til dannelsen afen underkategori af LE, de multivesikulære organer.
Gæren endosomal er relativt mindre kompleks end den ene af høje eukaryote celler. Gær endosomer er opdelt i EE og LE. I modsætning til pattedyrsceller de ikke indeholder genanvendelse endosomer men også vævsspecifikke lysosom-relaterede organeller. Derfor har de et mindre komplekst netværk af ruter endosomale menneskehandel 3,4. Gær Derfor har repræsenteret, og repræsenterer stadig en fordelagtig eksperimentelt system til at studere nogle af de principper, membran trafik i endosomale system. Denne fordel understreges af det faktum, at mange gener involveret i den endosomale veje er indledningsvis isoleret med genetiske skærme i gær 5.. Mens gær endosomale system vildtype og mutant celler er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af biokemiske og fluorescensmikroskopi tilgange har sin undersøgelse på det ultrastrukturelle niveau kun væretminimal. Morfologiske analyser er særligt relevante i gær, fordi de fleste af de endosomale organeller opdages så pointere strukturer ved fluorescens mikroskopi, som gør svært utvetydig identifikation 6. Desværre er det kun et begrænset antal antisera anerkendelse gær endosomale proteinmarkører arbejder i immuno-elektron-mikroskopi (IEM) præparater 7-10. For nogle proteiner, er dette problem blevet omgået ved den endogene tagging af genet af interesse, og anvendelsen af et antistof, der genkender tag for at opdage det 7,11,12. Men ofte proteiner påvises ved IEM på grund af deres lave ekspressionsniveauer. Deres overekspression er ikke en løsning, fordi denne tilgang kan fremkalde mis-lokaliseringer og / eller ændringer i organel morfologi / funktioner. Mærkningen af endocytiske rum med en probe påvises ved elektronmikroskopi EM er således en effektiv løsning. Dette er en optimal løsning, især hvis PROBE går ind i endocytiske rute i en tidsafhængig måde, som gør det muligt at vide, hvornår det vil markere et bestemt organel 6.
Optagelsen af positivt ladede nanogold ved gærsfæroplaster (dvs.. Gær, hvor cellevæggen er blevet enzymatisk fjernet) har med succes været anvendt til at identificere gær endosomale segmenter 10. Disse partikler stærkt binder til negativt ladede lipider, som udgør de biologiske membraner. Således positivt ladede nanogold associerer med PM, trænger cellen ved endocytose og passerer gennem EE og LE, før de når vacuole. Disse små guldpartikler dog ikke har en passende størrelse til at blive set af EM. At gøre dem synlige, kan deres størrelse udvides ved kemiske reaktioner, der fører til aflejring af sølv eller guld omkring guld sonden 13-15. Vi har udviklet og anvendt med succes en IEM tilgang baseret på Tokuyasu metode til at udføre subcellulærtlokalisering undersøgelser 8,16. Denne metode giver udfører immunogold mærkning på gærpræparater med en fremragende opløsning på morfologi 8,17-24. Vi har også etableret en procedure, der kombinerer denne IEM protokol med nanogold mærkning af gær endosomale systemet rummene 6. Ved hjælp af denne tilgang, vi har morfologisk karakteriseret forskellige underklasser af endosomes og ultrastrukturelt undersøgte mutanter med en endosomal handel defekt 6,25. Desuden har vi vist, at denne nanogold mærkning kan kombineres med immunogold labelings giver mulighed for at undersøge fordelingen af et protein af interesse på de forskellige endosome subpopulationer. Her præsenterer vi, hvordan mærkningen af gær endosomale-system med positivt ladede nanogold er praktisk udført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Sfæroblast Forberedelse
- Inkuber gær natten over ved 30 ° C i 10 ml af det passende medium bestemmes af udformningen af forsøget.
- Dagen efter, at måle den optiske densitet af kulturen ved 600 nm (OD600) ved anvendelse af et fotometer, Fortynd celler i det samme kulturmedium til en OD600 på 0,2-0,4, og dyrke dem i en eksponentiel vækstfase, medmindre udformningen af eksperiment kræver en anden tilstand. Celler er i den eksponentielle fase, når kulturen har en OD600 på 1-2.
- Collect 10 OD600 ækvivalenter cellerne ved centrifugering ved 3.500 x g i 5 min i et 50 ml rør. Efter centrifugering supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM dithiothreitol og inkuberes ved 30 ° C i 10 min.
- Saml igen cellerne ved centrifugering ved 3.500 x g i 5 min. Supernatanten.
- Resuspender cellerne in 5 ml medium (bestemt ved udformningen af forsøget) indeholdende 1 M sorbitol og 5 mg lytisk enzym og inkuber blandingen ved 30 ° C med forsigtig rystning i 30 minutter.
- Centrifugeres cellesuspensionen ved 300 xg i 5 minutter til opsamling af pellet-fraktionen, hvilket svarer til sfæroplasterne. Supernatanten.
- Resuspender sfæroplasterne i 960 pi iskold medier (medium bestemmes af udformningen af forsøget) indeholdende 1 M sorbitol og overføre blandingen til en iskold 2 ml mikrocentrifugerør.
2.. Nanogold Optagelse
- Ved hjælp af en pipette forsigtigt blande spheroplast med 4 nmol af positivt ladede nanogold partikler resuspenderet i 40 pi vand. Det endelige volumen af blandingen skal være på 1 ml.
- Placer den opnåede cellesuspension på is i 15 min.
- Overfør suspensionen ved stuetemperatur og inkuberes det for den krævede tid til at tillade nanogold internalisering af endocytosis.
BEMÆRK: En 5 min optagelse vil hovedsageligt føre til mærkning af endocytiske vesikler og tidlige endosomale rum, mens en 15 min optagelse vil tillade at markere hele endosomale systemet (tidlige og sene endosomer). Længere inkuberingstider (mere end 30 min) vil også gøre det muligt at mærke vakuolen.
BEMÆRK: Puls-chase mærkning af eksperimenter kan ikke udføres med denne metode. Derfor, når mærkningen til analyse af LE, nanogold vil også findes på PM og inEE.
3.. Fiksering og Sektionsinddeling
- Stop nanogold optagelse ved tilsætning af 1 ml dobbelt styrke fiksativ [4% paraformaldehyd (PFA), 0,4% glutaraldehyd (GA) i 0,1 M Phem puffer (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2)], der indeholdt 1 M sorbitol til cellesuspensionen. Holdes røret ved stuetemperatur.
- Vend forsigtigt manuelt micocentrifuge rør flere gange i løbet af 30 min (dette vil gøre det muligt at holde sfæroplaster isuspension) og centrifugeres to gange ved 1.700 xg i 25 sek.
- Udskift fiksativ ved at kassere supernatanten og ved at tilsætte 1 ml frisk standard styrke fiksativ (2% PFA, 0,2% GA i 0,1 M Phem buffer) indeholdende 1 M sorbitol og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur på en langsomt roterende hjul.
- Behandle celler til cryo-sektionering som beskrevet tidligere 6. BEMÆRK: For nanogold optagelse og sølv ekstraudstyr procedurer, den periodiske syrebehandling beskrevet i den angivne protokol ikke skal udføres. Den periodiske syre behandling er at bedre permeabilize cellevæggen 26, men denne struktur er blevet elimineret under genereringen af spheroplaster.
- Skær 50 nm tynde kryosektioner ved -120 ° C med tør diamant kniv ved hjælp af en UCT ultramikrotom som tidligere beskrevet 8 og placere dem på Formvar carbon coated 50 masker nikkel net.
4.. Silver Enhancement for Nanogold Particle Visuasering
BEMÆRK: Proceduren for at forberede reaktionsblandingerne er dybest set den ene anført af fabrikanten. Praktiske tilpasninger ved hjælp af denne protokol, gør silver enhancement procedure effektiv og pålidelig på kryosektioner.
- Fjern sølv ekstraudstyr kit fra fryseren og tø det i en 37 ° C inkubator eller vandbad. Når optøet, skal du placere sættet i en 24 ° C inkubator placeres i et mørkt rum, indtil brug (se 4.7).
- Placer varmepladen i mørke rum og varme det til den endelige temperatur på 24 ° C.
- Dæk toppen af varmeplade med overfladen beskytter, skinnende side opad, og fastgør det med et bånd.
- Placer Parafilm på Benchkote og markere kanterne med en sort markør for at være i stand til at se Parafilm kanter i mørke.
- Tape et termometer på toppen af Benchkote for at overvåge temperaturen af varmepladen. Gradvist justere temperaturen hvis ikke 24 ° C.
- Place 50 ml rør med dobbelt destilleret vand, og sølv forbedring kit inde.
- Fyld de små petriskåle med dobbelt destilleret vand, præ-opvarmet til 37 ° C. Placer net i vandet, modellen nedad, i 30 min.
- Gentag dette 4.7 trin endnu en gang.
- Overfør gitre i opbevaringsboks og bringe dem til det mørke rum.
- Skyl ristene igen ved at passere dem (med modellen side nedad) på flere dråber dobbelt destilleret vand ved 24 ° C placeret på Parafilm der er blevet fastgjort på varmepladen.
- Sørg for, at 9 yderligere dobbelt destilleret vand dråber er klar på Parafilm for skylning efter sølv ekstraudstyr reaktion.
- Slukke lyset og sørg for, at alt lys er slukket. Drej det røde lys på.
- Tag A-og B-opløsninger af sølv ekstraudstyr kit fra 24 ° C inkubator.
- Put første 6 dråber af en løsning, og derefter 6 dråber af B-opløsning i en 1,5 ml mikrocentrifugerør, og bland godt med et glas Pasteur pipette undgå at lave bobler. Løsningen er ganske tykt, og det skal manuelt blandet med en pipette, før endelig vortexbehandling det kort.
- Put A-og B-løsninger tilbage i 24 ° C inkubator og tag C-løsningen.
- Tilsæt 6 dråber C opløsning til A / B-blandingen. Derefter blandes igen først med en Pasteur-pipette og derefter med vortex, undgå at lave bobler.
- Anvendes umiddelbart slutblandingen ved at anbringe dråber (~ 20 ul / dråbe) på Parafilm.
- Med en ren, anti-magnetiske pincet placere ristene på blandingen (f.eks., Sølv øge reaktion) til 6 til 15 minutter, afhængigt af ekstraudstyret (dvs.. Størrelse af guld partikler) ønskede at blive opnået.
- Fjern net fra blandingen og videregive dem på toppen af dobbelt destilleret vand dråber ved 24 ° C til vask. Først skal du bruge i hurtigt rækkefølge 6 dråber og derefter 3 dråber med 7 min inkubationstid pr dråbe, Før du tænder lysene.
- Fortsæt til det næste trin, enten immuno-guld mærkning eller membranfarvning 27 med henblik på at visualisere resultatet for en EM undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge den præsenterede protokol kan morfologi gær endosome systemet være adgang ved transmission EM. Figur 1 viser forskellige typer af endosomale rum, der er blevet nået, og derfor er mærket med nanogold. Den sølvforstærket nanogold kan tydeligt ses som elektrondonorer tætte partikler. De optimale indstillinger bestemt for sølv-forstærkning reaktion tillader der guldpartikler i en homogen størrelse mellem 5 og 15 nm, som ikke interfererer med ultrastruktur gærcellen. Plasmamembranen samt tidlige endosomale rum er tilgængelige for nanogold efter en 5 min inkubation ved 24 ° C (figur 1A), mens LE i de præsenterede case multivesikulære organer, kan nås med disse partikler efter mindst 30 min optagelse (Figur 1B). Resolutionen magt kombinere vores IEM procedure 8 med nanogold / silver enhancement protokollen beskrevet her er underlined af bevarelse og kvaliteten af morfologien af de viste organeller, især de interne vesikler af multivesikulære organer (figur 1B).
Figur 1. Ultrastrukturelle analyse af nanogold mærket gær endosomale rum. Spheroplaster blev opnået fra vildtype SEY6210 stamme (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 mel GAL) som beskrevet i den præsenterede protokol. Sfæroplaster blev derefter inkuberet med 4 nmol positivt ladede nanogold ved 4 ° C i 15 minutter, før de overføres til stuetemperatur i 10 (panel A) eller 30 minutter (panel B). Cellerne blev efterfølgende fast, forarbejdet til cryosectioning 8 inden udførelse af sølv enhancement reaktion på præparatet som beskreveti den præsenterede protokol. A. Tidlige rum i gær endosomale systemet. Ud over plasmamembranen, en kort optagelse af nanogold (5 min) tillader mærkning af enkelte vesikler (pilespidser), eventuelt endocytiske vesikler, og af rørformede strukturer (pil), meget sandsynlige tidlige endosomer. B. Gær multivesikulær krop ultrastruktur. En 30 min inkubation fører til mærkning af LE / multivesikulære organer (skjult), men også tidligt endosomes dels vacuoles (ikke vist). M, mitokondrier; N, kerne; PM, plasmamembran; V, vacuole. Bar = 200 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-elektron-mikroskopi er en teknik, der gør det muligt at kombinere lokalisering af proteiner med ultrastrukturelle opløsning af luftfartsselskaberne og organeller, hvor disse proteiner bor. Dette er især vigtigt, når man studerer gær endosomale system, fordi dens rum vises som pointere strukturer i fluorescens mikroskopi. Det er derfor vanskeligt at skelne dem. Af denne grund er anvendelsen af en probe, der kan påvises ved EM og indtaste endocytiske vej på en tidsafhængig måde er afgørende for specifikt markere forskellige endosomer. Denne type probe er værdifuld til at vurdere funktionaliteten af endocytose 6, og det er et alternativ til den manglende antisera påvisning proteinmarkører.
Den her beskrevne fremgangsmåde udnytte positivt ladede nanogold som en probe til at mærke endosomale rum. Mens cryosectioning kræver særligt udstyr og færdigheder, den præsenterede protokol er teknisk let og ikke remå gøres specielle maskiner. Derfor er det tilgængeligt for alle laboratorier, der gerne vil bruge det til sin forskning. Har nogle forholdsregler skal dog tages i den kritiske trin i denne procedure, dvs sølv ekstraudstyr reaktion. Denne reaktion er meget følsom over for lys og derfor alle lamper (undtagen den røde) i lokalet skal være slukket og / eller dækket. Da alle kemiske reaktioner, er hastigheden af sølv ekstraudstyr reaktion påvirkes af temperaturen. For at opnå konsistente og reproducerbare resultater ved anvendelse af de samme parametre, alle opløsninger og værktøjer har omhyggeligt præinkuberet ved 24 ° C. Det er afgørende for præcist at fastslå inkubationstiden for sølv forbedring i det rum, hvor denne reaktion skal rutinemæssigt udført. Udvidelse af nanogold skal være lang nok for at være i stand til visuelt at detektere guldpartikel af EM og skal være kort nok til at undgå dannelse af store partikler, som kan omfatte morfologiske detaljer. Af denne grund er det varmt foreslået at udføre et pilotforsøg under iværksættelsen af denne teknik i laboratoriet. Under denne test nanogold partikler være sølv øget til forskellige tidspunkter for at bestemme det optimale tidspunkt for reaktionen. Af note, kan dimensionerne af de opnåede partikler ikke være homogen størrelse; vil der altid være nogle heterogenitet men dette skal holdes så minimal som muligt, i et interval mellem 5 - 15 nm. Dette er især vigtigt, hvis nanogold optagelse procedure vil blive kombineret med immuno-guld labelings. Et andet aspekt, der skal holdes for øje, når fortolkningen af resultaterne er, at puls-chase mærkningsordninger eksperimenter er ikke muligt med denne metode. Derfor PM og EE vil også blive mærket i en nanogold optagelse til formål at visualisere LE.
Det er også muligt at se yderligere programmer i protokollen, der præsenteres her. En mulighed kunne være at korrelere EM data nanogold optagelse med fluorescerende microscopy. FM4-64 er et lipofilt fluorescerende kontrastmiddel, der associerer til PM, og på sin vej til vacuolen, passerer gennem den endosomale rum i en tidsafhængig måde. Både FM4-64 og nanogold ind i cellen sammen med lipider, og de har sandsynligvis meget lignende internalisering kinetik 28,29. Som et resultat begge farvestoffer kan anvendes på samme tid i korrelative lys-EM tilgange til samtidigt at udforske den dynamiske og ultrastrukturen af endocytiske compartments.The præsenterede metode kan også anvendes til receptor-medieret handel gennem endocytiske systemet 30. Monomaleido og mono-sulfo-N-hydroxy-succinimido derivater af nanogold kan anvendes til kovalent at binde disse partikler til proteiner 6. For eksempel tværbinding med a-eller α-faktor kan tillade efter endocytose af disse to feromoner deres specifikke receptorer.
Alt sammen, den beskrevne protokol tillader at specifically mærke de organeller gær endosomale system ved hjælp af en endocytose probe, som kan gøres påviselige ved EM. Denne eksperimentelle værktøj er en værdifuld metode til at studere biogenese og organisering af gær endosomale rum i ultrastrukturelle niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker René Scriwanek for assistance med udarbejdelse af figuren. FR er støttet af ECHO (700.59.003), ALW Open Program (821.02.017 og 822.02.014) DFG-NWO samarbejde (DN82-303) og ZonMw VICI (016.130.606) tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
