Summary
이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.
Abstract
자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : 줄기 세포는 불균등 운명 잠재력이 자손 세포를 생성하는 비대칭으로 나눈다. 비대칭 줄기 세포 분열이 연구의 강력한 지역이었다 지배하는 메커니즘을 이해, 개발 및 질병의 관련성을 감안할 때. 그들은 유 전적으로 다루기 쉬운이며, 대한 시간마다 세포 분열의 연속 라운드를 받아야하기 때문에, 초파리의 중추 신경계, 또는 neuroblasts의 줄기 세포는 줄기 세포 부문의 연구에 필수적인 모델입니다. 약 100 신경줄 기세포는 라이브 영상 현미경 연구를위한 모델 시스템이 특히 유용하게,이 유충 두뇌 돌출부의 각각의 표면 근처에 위치되어있다. 이 작품에서 우리는 널리 줄기 세포의 분열을 시각화하는 데 사용되는 여러 가지 방법을 검토하고, 우리는 상대적으로 장점을 그대로 뇌 조직에 비해 해리 고용한다 그 기술의 단점을 해결합니다. 또한, 우리는 우리의 simplif처음 엔 프로토콜은 라이브 셀 이미징을위한 제 령 애벌레 고정 분석 응용 프로그램에서 전체 두뇌를 이식편하는 데 사용됩니다.
Introduction
줄기 세포는 초기 발달 동안 세포 다이버 시티를 생성하고 성인 조직에서 손상된 세포를 대체하는 분화의 균형과 자기 갱신을 유지한다. 이 항상성의 규정은 손실과 해로운 조직의 변성 또는 종양이 발생할 수 있습니다 줄기 세포 인구의 이상 팽창을 모두 방지 할 수 있습니다.
Neuroblasts (NBS)은 초파리의 중추 신경계 (그림 1A) 배아 단계 1, 2 중 그 첫 번째 양식의 널리 연구 신경 줄기 세포입니다. 자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : NBS는 두 불평등 운명 세포를 생산하는 비대칭 세포 분열 (ACD)의 반복 라운드를 받고있다. ACD는 중심체, 대부분의 세포 3의 미세 소관 조직 센터의 역할이 아닌 막 세포 기관에 의해 인도된다. 유사 분열 동안, NB의 중심체 구성하고 혀끝 - 기초 극성에 따라 양극 분열 스핀들의 방향을ITY 축. 분할 NB의 분열에, 줄기 세포의 운명을 지정 혀끝의 운명을 결정하고, 차별화를 지정 기초의 운명의 결정은, 불평등 한 딸 세포로 분리된다.
유생 중앙 뇌, NBS 두 종류의 그들의 수, 위치, 전사 인자의 발현 및 세포 계보 (도 1a) 4-6에 의해 구별 될 수있다. I NBS는 가장 풍부한 입력하고 약 90 그들의 두뇌 7의 각 광 엽의 전방 및 후방 측면을 채 웁니다. 이 NBS는 전사 인자 Asense (아세)를 표현하고 그들은 특징적으로 하나의 자기 갱신 NB로 나누어 하나의 작은 신경절 어머니 세포 (GMC, 그림 1B). 각 GMC는 두 개의 신경 세포 나 교세포 (그림 1B)를 생성 할 수있는 하나의 단말기 부문을 겪는다. 반면, 각 광 엽의 후방 측을 채울 여덟 유형 II NBS는 아세 식 5 부족합니다. 그들은 ACD를 받아야하나의 자기 갱신 NB와 하나의 중간 신경 전구 (INP)를 생성한다.
INP, 차례로, 비대칭으로 3-5 회 분할한다. INP의 재생 및 단일 GMC (4)의 생산에서 이러한 구분 결과의 각. 공동으로, 특정 NB의 정체성과 GMC의 출생의 시간 순서는 성인 중추 신경계의 신경 세포의 놀라운 다양성에 상승을 제공합니다.
NB ACD의 기초가되는 세포 생물학이 크게 라이브 셀 이미징 기술의 사용을 통해 향상되었습니다 이해. 이미지 라이브 NBS를 사용하여 연구자 게시 프로토콜은 매우 다양. 전반적으로, 그러나, 이러한 방법은 유충의 두뇌가 그대로 유지 또는 기계적으로 분해되어 있는지 여부를 구별 두 가지 일반적인 범주로 분류 할 수있다. 두 기술은 연구원의 응용 프로그램에 따라 각각 장단점이 있습니다.
라이브 NB 세포 디비를 공개 초기 보고서sions는 애벌레 뇌의 수동 해리의 어느 정도를 포함한다. 이러한 프로토콜 세부 사항은 8 번짐이나 유리 커버 슬립에 NBS의 단기 차 문화를 성장하기 위해 떨어져 9 뇌를 괴롭 히고. 이미지를 개선하기 위해 라운드 NBS는 일반적으로 유리 슬라이드 8 또는 아가로 오스 패드 (9) 중 하나와 함께 커버 슬립에 평평하게됩니다. 편평 세포 광학을 개선하고 있지만, 이들 기술들은 분열 밭고랑의 회귀 하나 이상의 시간을 나눌 수 없다는 등, NB의 유사 분열 결함으로 이어질. 따라서, 수동 해리 애벌레 뇌 조직의 물리적 변형을 모두 포함하는 프로토콜은 일반적으로 단지 매우 짧은 기간 (예., 하나의 세포주기 이하) 응용 프로그램에 적합합니다. 마찬가지로, 반 부수 또는 완전히 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 그대로 머리를 평평 하나는 약 30 분 동안 10 주어진 표본 이미징 보낼 수있는 시간을 제한합니다. 이 제한, 생에도 불구하고발 접근법은 성공적 11-14 사용되고있다.
이미지 라이브의 최근 노력은 NBS 제한에게 고립 된 세포의 물리적 왜곡 해리. 이러한 기술은 여러 세포 분열주기를 세포 배양을 유지하기 위해 필요한 애플리케이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 수동으로 해리 두뇌에서 분산 된 세포는 부분적 장기 촬상 16 피브리노겐과 트롬빈 (15)의 혼합물로부터 만들어 응고에 내장 될 수있다. 또한, 외식 뇌는 화학적으로 효소 다음 수동으로 피펫 팁을 통해 반복 통과에 의해 방해 콜라, 이후에 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 요리 (17, 18)에 도금 해리 첫 번째가 될 수 있습니다. 피브리노겐 또는 폴리-L-라이신 하나와 유리 접시를 코팅하는 주요 물리적 왜곡없이 가능한 커버 슬립에 그들을 가까이 가져, 둥근 세포의 확산을 첨부하고 약간을 촉진합니다. 책상 외에도에서에 이러한 방법이 쉽게 약물 섭동 실험 18으로 교환 할 수있다 매체에 NBS를 배양 포함한다. 전반적으로, 직접 도금 NBS 장기 이미징 기능을 희생하지 않고 이미징 광학 향상 분산. 최근, 해리 NBS의 장기간 배양을 기술 프로토콜 (19)을 자세히 설명하고있다.
그러나, 이러한 접근은 그 한계가없는 것은 아니다. 라이브 해리 NBS 이미징 몇 가지주의 사항이 있습니다. 분산 된 세포의 분야에서, 예를 들어, 공간적으로 손상 뇌 일이 구성되어 특정 NB 계통을 식별하는 것이 곤란하다. 마찬가지로, 유형 해리 조직 내 II NBS 대 유형 I를 구분하는 것은 이러한 worniu-GAL4, asense-GAL80 20 계보 추적자 또는 서브 타입 별 도입 유전자의 발현없이도 도전. 이러한 형질 전환 유전자가 일부 응용 프로그램에 매우 유용하지만, 그들은 그 형질 전환 유전자의 예에 연구원을 제한 않는다UAS 인핸서 요소 (21)의 제어하에 가압 유전 복잡한 구조를 필요로하기 때문이다. NBS의 공간 또는 시간 발전을 염려 연구는, 따라서 조직 손상의 문맥에서 생체 내 이미징에 요구한다.
또한, 해리 배아 NBS의 연구는 키 극성의 계면 지역화 22, 23 결정에 인접한 셀의 물리적 접촉이 중요하다는 것을 나타냅니다. 이러한 연구는 완전히 격리 NBS가 더 이상 고정 유사 분열 스핀들 축 유지되지 보여준다. 대신에,이 세포는 아마도 인해 혀끝의 중심체 위치 (22)의 손실을 더 무작위 스핀들 축 연속 GMC 싹을 분리, 넓은 각도를 표시합니다. 유생 NBS와 그 이웃하는 셀 사이의 관계를 광범위하게 연구되지 않았지만, 그것은 유생 줄기 세포 미세 환경은 세포 또는 다른 극성에 충돌 할 수 있음을 고려할 가치가있다행동. 유생 NBS의 생리적 컨텍스트를 유지하기 위하여, 전체 뇌에서 우리 화상 ACD.
영상 해리 NBS와 관련된 제한 사항을 감안할 때, 우리의 실험실과 다른 사람은 전체의 애벌레의 뇌에서 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 프로토콜을 설립했다. 이미지 그대로 뇌에 기술들은 조직의 왜곡이나 손상을 방지하고 가스 교환을 허용하는 유연한 막과 문화 실의 한쪽에 유리의 단단한 표면을 교체합니다. 일부 방법은 곤충 배양 배지, 혈청 및 열 유충 (24)로부터 격리 지방 기관과 아스코르브 산의 혼합물에 외식 뇌 장착 포함한다. 그들은 NB 세포 분열 (25)을 자극하는 것으로 알려진 유사 분열 물질을 분비하기 때문에 격리 된 지방 기관이 추가됩니다. 이 프로토콜은 3 이상의 시간 동안 조직의 무결성을 유지하고 장기간 촬상 24, 26-28 의무, 그러므로,이다. 최근, LON을 기술 프로토콜아스 코르 빈산, 혈청, 지방 기관의 존재 그대로 애벌레 두뇌의 G-기간 이미징은 29 자세히 설명하고있다. 조직이 노출되거나 고정되지도 있기 때문에 중요한 것은,이 방법은 배양 배지를 교환 응용 프로그램에 덜 유용하다 (등 예를 들면, 약물 연구, immunodepletion.).
우리 연구소는 장기 이미징 30, 31 일에 대한 살아있는 애벌레 두뇌의 전체 마운트 준비를 간단하게했다. 다른 사람에 우리의 프로토콜의 주요 장점은 단순하다 : 우리의 관측은 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 필요한 첨가제입니다도 혈청, 아스 코르 빈산, 인슐린, 또는 지방 기관을 나타냅니다. 인슐린 등의 첨가제는, 줄기 세포 분열 (32)와 초파리의 난소 (33) 집단 세포 이동의 장시간 촬영에 유용되어 있지만 우리의 영상 매체는 역의 단순한 혼합물로 구성되어, 그들은, NB ACD 비용 소비로 표시ndard 곤충 세포 배양 배지는 오염을 방지하기 위하여 항생제가 보충 항진균. 재사용 할 수있는 가스 투과성이나 유리 바닥 문화 요리의 사용을 통해, 우리는 연속 NB ACD에 몇 차례를 유지할 수 있었다. 같은 외식 샘플은 쉽게 면역 고정 조직과 다른 절차를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 세부 그대로 애벌레 뇌의 해부뿐만 아니라 라이브 및 고정 모두 분석을위한 두뇌의 준비.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 필요한 재료의 제조는 세 번째 탈피 애벌레의 머리를 이식편하기
- 미세 절제에 필요한 도구를 준비합니다.
- 먼저 각 핀 홀더에 하나의 해부 핀을 배치하여 두 해부 도구 (메스와 훅)를 위조. 손으로 또는 플라이어 (그림 1C)와 긴밀하게 핀을 고정합니다.
- 약 120 °의 각도로 하나 해부 핀이 구부러 이전 포셉 한 쌍을 사용합니다. 핀 홀더가 손에 개최 될 때 핀의 위쪽 절반이 평평하도록 해부 현미경이 작업을 수행합니다. 이 도구를 누른 상태에서 또는 조직을 통해 슬라이스 메스로 사용됩니다.
- 보유 및 조직을 쳤어요하는 데 사용되는 훅으로 두 번째 핀이 구부러 이전 포셉 한 켤레를 사용합니다.
- 손상 도구를 보호하기 위해 피펫 팁 각 해부 도구를 포함한다. 주의로, 잘 형성된 전통 무기한 해부에 사용될 수있다. 필요에 따라 손상되거나 변형 핀을 교체합니다.
- 매체를 해부 준비합니다.
- 조직 문화 후드에서 슈나이더의 배양 배지에 항생제 항진균 보충을 희석. 보충 통합 미디어를 소용돌이 친다.
- 보충 미디어를 여러 번 5 ㎖ 씩 분주을 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 모든 미디어를 저장합니다.
- 실온으로 보충 매체의 5 ML의 나누어지는을 따뜻하게. 멸균 5 ML의 주사기로 매체를 그리고 멸균 0.2 μm의 주사기 필터를 나사.
- 해부 유충을 선택합니다. 뇌 해부하는 것이 가장 쉬운 방법이 될 것으로 크롤링 제 령 유충을 선택 해부 프로브를 사용합니다. 선택 사항 : 포도 한천 접시에 예금 애벌레.
참고 :이 너무 일찍 빠져 나오는 두 번째 또는 첫 번째 령 유충을 강제하는 경향 "젖은 음식,"지나치게 붐비는 유리 병이나 병을 사용하지 마십시오.
참고 : 일부 유전 적 배경이 어린 애벌레를 사용하여 필요로합니다. 이 프로토콜에 영향을주지 않지만, D을 않는다issection 더 어렵습니다.
중추 신경계의 2. 해부
- 하나의 유리 슬라이드에서 약 3cm로 구분 따뜻한 해부 미디어의 두 50 ㎖ 풀을 만들 수 있습니다. 하나의 풀 미세 절개 (그림 1C)에 사용되는 총 해부 및 기타에 사용됩니다.
- 미디어 상품의 하나에 여러 유충을 전송합니다.
- 해부 현미경으로 애벌레와 커버 슬립을 이동합니다. 유충의 앞쪽과 뒤쪽 끝이 알 수있는이되도록 애벌레가 들어있는 풀을 확대합니다.
- 하나의 애벌레의 중간 영역을 파악하는 집게의 쌍을 사용합니다. 다른 손에 집게의 두 번째 쌍을 가지고 같은 지역에 가까운 유충을 파악. 부드럽게 절반의 유충을 찢어 떨어져 집게의 두 쌍을 당깁니다. 커버 슬립의 모든 애벌레에 대해 위의 두 단계를 반복합니다.
- 티슈로 전송하여 유충의 몸의 뒤쪽 절반 폐기하십시오.
- 유충을 확대 번째 있도록전자 전방 mouthhooks 명확하게 볼 수 있습니다. 세 번째 흉부 먼저 앞쪽에 작은이 밴드 사이의 애벌레 mouthhooks의 양측에 작은 절개, 또는 노치를 만들 집게의 두 쌍을 사용합니다.
- 비 지배적 인 손에 집게와 mouthhooks을 잡습니다. 부드럽게 전방 - 투 - 뒤 방향으로 표피를 벗겨하는 다른 손에 집게를 사용합니다. 중앙 신경 시스템이 노출 될 때까지 천천히 표피를 벗겨 계속.
- 집게로 조직을 찢어하여 유충의 나머지 부분에서 중추 신경계를 분리합니다. 중앙 신경 시스템을 방해하지 않도록주의하십시오.
중요한 단계 : 중추 신경계에 잡아 당기지 마십시오! 찢어진 복부 신경 코드 (그림 2A) 또는 왜곡 된 광 엽 (叶) (그림 2B와 2B ')에 손상 샘플을 폐기하십시오. - 커버 슬립의 모든 애벌레에 대해 위의 두 단계를 반복합니다. 에 건강한 외식 조직을 전송미세 해부 단계의 커버 슬립에 매체의 두 번째 (청소) 수영장.
- 뇌에서 말초 조직 (예를 들어, 눈, 날개, 다리 디스크)를 멀리 맑게하기 위하여 해부 핀 도구를 사용합니다. 커버 글라스에 결합 조직을 고정, 원 (뇌)와 원치 않는 조직 사이의 메스를 밀어 넣습니다. 동시에 톱 같은 움직임에 커버 슬립에 메스를 누른 상태에서 부드럽게 원치 않는 조직을 멀리 애타게 후크를 사용합니다.
- 중요한 단계 : 각 뇌에서 모든 디스크를 제거하기 위해 천천히 그리고 신중하게 작업 할 수 있습니다. 뇌의 형태를 방해하지 않도록주의하십시오. 건강한 뇌 손상 복부 신경 코드와 대칭, 둥근 눈 로브 (그림 2C)를해야합니다.
3. 라이브 이미징 두뇌를 외식 마운팅
- (그림 2D)을 위로 향하게하여 투명 필름 50mm의 가스 투과성 배양 접시 전환. t에 매체의 작은 방울 (약 30 μL)을 입금 주사기를 우울요리의 그는 센터.
- 접시에 매체의 드롭에 격리 뇌, 한번에 하나씩 전송. 광 엽 (叶) 아래에 머리를 올리다 훅 도구를 사용합니다. 또한, 복부 신경 코드로부터 돌출 축삭을 파악하는 집게를 사용합니다.
- 매체의 드롭 ~ 10 두뇌를 수집합니다. 그들 중 많은 사람들이 같은 매체의 드롭의 맨 아래에 각각의 머리를 밀어 해부 핀 도구를 사용하여 머리를 물속에 메 니스 커스 (그림 2E)에 갇혀됩니다.
- 이미지에 표시 할 NBS (그림 3A)에 따라 머리를 맞 춥니 다 해부 핀 도구를 사용하여 두뇌의 방향을. 이미지 등의 NBS는 (막 따라) 아래로 향하게 복부 신경 코드를 배치합니다. 이미지에 anterio - 복부 NBS는 (멀리 막에서) 위로 향하게 복부 신경 코드로 두뇌를 놓습니다. 모든 복부 신경 코드가 xy 평면 내에서 같은 방향을 가리 키도록 머리를 맞 춥니 다.
- 주사기 또는 플라스틱 전송 (P)을 사용하여ipette 가스 투과 막에 4 할로 카본 (HC) 기름 방울 (약 30 ㎕를 각)을 배치합니다. 오일의 각 방울의 부피는 서로 중간의 드롭에 해당해야한다. 공간의 오일 방울을 배양 배지의 드롭 중심 커버 슬립의 네 모퉁이에 대응. 완료되면, 다섯 방울 (오일의 4 마리와 중심에있는 매체의 한 방울은) 서양 주사위 (그림 3B)의 다섯 가지 측면을 유사합니다.
- 그것은 모두 한 번에 5 방울을 명중하도록 어셈블리에 # 1.5 22mm의 coverslip에 내립니다. 샘플에 걸쳐 일정한 압력을 유지하는 것은 그들이 중단 될 가능성을 줄일 수 있습니다. 석유와 매체가 커버 슬립의 무게 분산으로 약 3 분을 기다립니다. 미디어의 교차와 같은 모양 (그림 3C 및 3D)을 형성 할 것이다.
- 중요한 단계 : 휴지 심지 (Figu를 사용하여 초과 용지를 제거하여 뇌의 표면에 커버 슬립을 낮 춥니 다) 3C를 다시. 해부 범위에서 샘플을 보면서이 작업을 수행합니다. 용지가 제거 될 때, 커버 슬립을 낮출 것이다. 커버 슬립이 두뇌에 접촉되면 중지합니다. 하지에 심지이 조직의 왜곡 또는 뇌 폭발의 원인이됩니다.
- 영상 등의 NBS (그림 3E)는 3.9 단계로 이동합니다. 영상 anterio - 복부 NBS 경우, 커버 슬립이 약간 복부 신경 코드의 끝 방향으로 (부드럽게 집게로 이끌어으로) 이동해야합니다. 이 영상 (그림 3 층)을 용이하게하기 위해 coverslip에 직접 접촉 두뇌 엽 (叶)을 제공 회전하는 두뇌를 발생합니다.
- 할로 카본 오일 (그림 3D) 소량의 커버 슬립을 포위하여 챔버를 밀봉. coverslip을 돌아 다니며 여분의 기름을 최소화하고 조직 멀리 도말되어야한다.
중앙 브레인 Neuroblasts 4. 라이브 영상
참고 :이 작업을 위해, 니콘 이클립스 티 회전 디스크공 초점 현미경 (도립 현미경) 실시간 이미징에 사용되었다; 우리의 설치에 대한 자세한 내용은 이전에 31 발표되었다. 대안 적으로, 샘플은 직립 시스템을 사용하여 이미징 될 수있다.
- 바로 장착 두뇌 위의 커버 슬립에 침지 기름 한 방울을 추가합니다. 이것은 직접 샘플 위의 목표를 중심에 도움이 될 것입니다.
- 중요한 단계 : 단계 인큐베이터와 25 ° C의 일정한 온도에서 머리를 유지합니다. 조심스럽게 무대 인큐베이터에 탑재 된 샘플의 위치와 뚜껑이있는 챔버를 포함한다.
- 광 엽 (叶)의 중앙과 중간 지역에있는 대형 원형 세포에 초점을 맞춤으로써 전송 된 빛을 사용하여 중앙 뇌 NBS를 찾아, 에피 형광을 사용하지 않습니다. 이 연습 쉬워집니다. 그것은 가능한 한 빛의 최소 금액에 샘플을 노출하는 것이 매우 중요합니다. 손상된 시간 이미징 머리를 낭비하지 마십시오.
- 일단 장소에서, 공 촛점을 위해 사용 빠른 노출을적절한 위치와 깊이를 결정합니다. 제 15 μm의 깊이를 제한합니다. 필요에 따라 조정하고, 다른 테스트 이미지를 촬영.
- 선택 단계 : 더 XY 드리프트가 없는지 확인하기 위해 복부 신경 코드의 테스트 동영상을 수집합니다. 드리프트가 발견되면 해결하기 위해 샘플에 대한 15 ~ 30 분을 기다립니다. 드리프트는 30 분에 정착하지 않는 경우, 새로운 샘플을 준비하고 있습니다. 주요 드리프트는 일반적으로 여분의 기름을 추가로 다시 추적 할 수 있습니다, 또는 기름의 불평등 크기는 설치시 삭제합니다.
- 축 드리프트 (Z-드리프트를) 제거하려면 적외선 LED를 사용하는 연속 자동 초점 장치를 사용합니다. 또한, 수동으로 초점면을 수정합니다.
- 관심 NB가 확인되면, 영상식이 요법을 진행. 모든 살아있는 세포 이미징, 레이저 빛의 양, 노출 시간, 카메라 비닝 (binning), 목표 확대, 시간 및 / 또는 z 단계 간격으로 모두 경험적으로 손에 질문에 대답 할 수있는 특정 실험을 위해 최적화해야합니다. 목표는 빛 댐을 최소화하는 것입니다나이 동안은 여전히 유용한 데이터를 수집. 추가 지침에 대한 설명을 참조하십시오.
- 이미지 Z 축에서 1 μM로 이격 12-14 이미지를 수집하여 NB의 전체 볼륨. 같은 NB의 하나 또는 여러 개의 세포주기를 캡처하는 시간 해상도를 조정합니다. 일반적인 지침으로, 하나의 세포주기 이미징 및 여러 세포주기 1-3 분 간격으로 10 ~ 30 초 간격을 사용합니다.
- 중요한 단계 : 시료가 유사 분열의 지속 시간을 모니터링하여 정상인지 확인합니다. 유사 분열은 더 이상 15 분 걸린다면, 다른 두뇌로 이동합니다. 건강한 뇌는 유사 분열의 여러 라운드를 진행 한 시야에서 많은 NBS를 표시합니다. 각각의 세포주기 때문에 가벼운 손상을 약간 더 이전보다 있습니다.
- 촬상이 완료되면, 배양 챔버를 분해하고, 가스 투과성 배양 접시하지만 모든 버린다. 95 % 에탄올로 배양 접시 표면을 씻어 티슈로 잘 닦아냅니다. 두 번 더 반복합니다.
면역 형광에 대한 두뇌의 5. 준비
- 보충 매체의 약 0.2 ML를 포함하는 1.5 ML 튜브에 20 개 이상의 외식 두뇌를 수집합니다.
- 튜브에서 매체를 제거하고 (0.3 % 트리톤 X-100과 인산염 완충 생리 식염수, PBS) 0.5 ㎖ PBSTx 한 번 머리를 헹군다. 뇌가 모든 액체 교류의 튜브의 바닥에 정착하자. 트리톤 X-100 세제는 조직을 투과하는 데 사용됩니다. 일반적으로 세정 미만 30 초 소요; 뇌가 튜브의 바닥에 정착 한 후 단순히 PBSTx를 제거합니다.
- PBSTx에 희석 9 %의 전자 현미경 수준의 파라 포름 알데히드 0.5 ㎖의 솔루션을 교체합니다. 실온에서 15 분 동안 장동에 품어.
- 유해 폐기물 규정에 따라 정착 폐기하십시오.
- 15 분 동안 0.5 ㎖ PBSTx와 샘플을 씻으십시오. 신선한 PBSTx 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다.
- 0.5 ㎖ PBT (PBS, 1 솔루션을 대체% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 트윈 -20). 실온에서 1 시간 동안 장동로 부화. 이 단계는 블록 조직에 항체의 비특이적 결합을.
- 4 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 보충 PBT 희석 0.5 ㎖ 차 항체 솔루션을 교체합니다. 4 ℃에서 하룻밤 장동에 품다
- 희석 된 일차 항체를 폐기 또는 저장합니다.
- 15 분 동안 0.5 ㎖ PBT와 샘플을 씻으십시오. 신선한 PBT 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다.
- 0.5 수정 PBT의 ML (PBS, 2 % BSA, 0.1 % 트윈 20, 4 % NGS)와 솔루션을 교체합니다. 실온에서 1 시간 동안 장동로 부화.
- 수정 PBT로 희석하여 0.5 ㎖ 차 항체 솔루션을 교체합니다. 실온에서 2 시간 동안 장동에 품어.
- (0.1 % 트윈 - (20)와 PBS) 0.5 ㎖ PBST과 솔루션을 교체합니다. 실온에서 15 분 동안 장동에 품어. 신선한 PBST 두 번 더와 세척 단계를 반복합니다.
- 정중 슬라이드의 중심의 왼쪽을 향해 강하를 제한하는, 유리 슬라이드에 방울로 샘플을 전송.
- 슬라이드의 중심에 장착 매체의 굵은 (직경 약 2 ㎝) (예 Aqua-Poly/Mount)를 추가한다. 왼쪽을 향 PBST의 풀을 피하십시오.
- 설치 매체의 풀에 PBST의 풀에서 두뇌를 전송하는 집게를 사용합니다. 뇌의 바로 위에 설치 매체를 추가하면 자신의 방향을 방해 할 수 있습니다 피해야한다.
- 광학 현미경 아래에서 위로 향하게 이미지를 만들면 설치 매체에 샘플을 준비한다.
- 광학 현미경 슬라이드, 천천히 샘플의 상단에 # 1.5 유리 커버 슬립을 낮 춥니 다. 선택 단계 : 가볍게 커버 슬립에 밀어 작은 공기 방울을 제거.
- 설치 매체가 슬라이드를 거짓말로 밤새 몇 시간, 또는 중합 평면, 빛 허용실온에서, 보호.
- 슬라이드 다음날 군데, 또는 이전의 이미지로 저장 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
라이브 영상은 NB ACD를 조절 메커니즘의 숫자를 해명했다. 종래 이미지 수집하기 위해서는, 최적의 촬상 조건을 결정하는 것이 필요하다. 이 생균의 촬상 기간과 프레임 캡쳐 율을 양립시킬 필요가있다. 미세 세포 분석을 위해, 예를 들어, 일시적인 증가 및 광학 해상도가 요구 될 수있다. 단일 NB 세포주기 (도 4a)를 시각화하는 경우, 이미지가 캡처되는 속도는 광 손상을 도입하지 않고 증가 될 수있다. 일반적으로, 단일 세포 분열 이벤트는 약 10-30 초의 시간 간격으로 모니터 할 수있다. 조직을 손상시키지 않고, 시간 해상도를 증가시키는 하나의 방법은 영상 획득 속도를 조절하는 것이다. 예를 들어, 시간 경과 영상은 재미있는 기능이나 시점 (동영상 1)의 관찰에 증가 낮은 프레임 속도로 개시 될 수있다.
세포 분열의 이미징 연속 라운드 (
다수의 샘플의 분석을 위해, 고정 된 NBS를 분석하는 것이 필요하다. 우리의 고정 프로토콜은 NBS의 전체 형태를 유지하고 면역 형광 분석 (그림 4C-4E)과 호환됩니다. 전체 마운트 고정 꼰 로프NS는 전체 뇌 크기를 시각화하고 모양 또는 NBS를 감지하는 낮은 배율 (그림 4C)에서 이미지가 될 수 있습니다. 더 자세히 NBS 또는 자손 GMCs를 시각화하기 위해, 높은 배율을 사용할 수 있어야합니다. 약간 확대 (그림 4D)에서 전체 NB 계보 클러스터는 관찰 할 수있다. 자세한 세포 분석을 위해, 더 높은 배율 (그림 4E)를 사용합니다.
그림 1. NB ACD의 라이브 세포 이미징을위한 전체 두뇌를 Explanting. A) 유충의 중추 신경계는 두 개의 광 엽 (叶) 및 복부 신경 코드로 구성되어 있습니다. NBS의 두 가지 하위 유형에 박힌 위치에 광학 엽을 채 웁니다. 유형 I (다크 블루)와 유형 II (라이트 블루) B) NBS는 ACD를 받고있다. 각 세포 분열과 함께,한 GMC로 야기하는 NB 클리브 (또는 INP은 도시하지 않음)과 NB 줄기 세포를 재생한다. GMCs (미도 또는 아교)이 뉴런에 상승을 부여 나눌 것이다. C)의 microdissection 두 툴은 핀 홀더에 해부 핀을 삽입함으로써 조립된다. 핀이 구부러하는 유일한 도구 메스와, 관통을 절단하고, 기본 뇌에 손상을주지 않고 불필요한 조직을 치환하는 데 사용되는 후크를 만듭니다. D) 두뇌를 해부 미디어 (파란색 원)의 두 개의 수영장 중 하나에 외식됩니다. 매체의 하나의 풀은 유충 (글로스 해부)로부터 중추 신경계를 제거하기 위해 사용되며, 다른 풀 외식 뇌 (미세 해부)에서 말초 조직 미세 미세 절제를 위해 사용된다.
그림 2. Preserv미세 절제하는 동안 뇌 형태의 ATION은. 성급한 뇌 해부는 (A) 찢어진 복부 신경 코드 또는 (B) 광학 로브 왜곡을 포함 심각한 조직 손상을 유발 할 수 있습니다. 더욱 미묘한 조직 손상 (B ')는 라이브 셀 이미징 피해야한다. (C) 라이브 영상. D) 광학적으로 명확한, 가스 투과 막. E) 가스 투과성 접시에 배지를 배양에 배치 여러 건강한 두뇌의 컬렉션에 적합한 건강한 조직 샘플의 예. 이들의 뇌는 현미경에 장착 할 준비가 된 것입니다. 스케일 바 (AC), 100 μm의; (D), 25mm; (E) 1mm.
그림 3. 라이브 셀 이미징을위한 두뇌를 장착. A) 뇌(S)은 매체의 방울 대략 동일 부피의 HC 기름 방울에 의해 둘러싸여 접시. B)의 중심에 증착 된 배양 배지 방울 내에 행으로 정렬된다. HC 오일과 매체의 중심 드롭의 네 방울 놀이, 주사위의 다섯 가지 측면을 닮은. 커버 슬립은 기름 방울로 하강 한 후, (C) 심지 킴 와이프 조직 중 구식 및 증발을 중단 과잉 유체. D) 커버 슬립의 외부 가장자리는 오일의 얇은 층에 의해 둘러 쌓여을 흠뻑 젖은하는 데 사용 배양 배지. 이러한 뇌). 이제 E와 F 현미경에 대한 준비가 커버 슬립에 뇌 상대의 방향은. E) 지느러미 neuroblasts가 가스 투과 막 감동 복부 측면과 두뇌를 배열하여 이미지를 만들 neuroblasts 라이브 셀 이미징에 대한 액세스를 결정합니다 . F) 전방 - 복부 neuroblasts가 도착하여 이미지화 할 수있다몸 윗면은 복부 신경 코드 팁의 방향으로, 가스 투과 막 터치 한 후 커버 슬립을 이끌어 및 기본 조직으로 뇌를 anging. 이 운동은 약간 같은 완벽한 정렬 (녹색 선)에 원하는 이미지 축을 가져 anterio 등쪽 표면에 접촉 coverslip에, 그 광 엽 (叶)을 올라옵니다.
그림 4. 분할 neuroblasts NB의. A와 B) 라이브 영상 40 배, 1.3 NA 오일 침지 목표를 사용하여 전체 마운트 준비에 세포 분열 줄기의 라이브 영상에서 대표 결과. . GFP-Moesin을 표현하는 NB에서 단일 세포주기의 시간 경과 영상에서 시간 경과) 스틸의 시작 초 상대 : 시간을 분으로 표시됩니다(GFP - 모에). 단일 세포주기의 화상 취득 속도는 GFP-모에 및 GFP-표지 중심체 마커 모두를 발현하는 NB에서의 연속적인 세포 분열주기의 시간 경과 이미징). B 광 손상을 유발하지 않고 시간적 해상도 바로 스틸을 증가 될 수있다. 여러 세포주기와 관련된 장기간은 광 손상을 피하기 위해 감소 된 시간적 해상도를 필요로한다. 영상. CE)의 과정 동안 각 세포 분열이 증가 사이의 시간의 길이가 모두 광 엽 (叶)에있는 이미지의 모든 NBS에 전체 마운트 준비. C))에서 고정 된 줄기 세포의 공 촛점 돌기, 20X 배율을 사용합니다. 이 분석은 하나의 광섬유 로브에서 NBS (핑크)의 대부분은 40 배 배율로 가시화 될 수 전체 뇌의 형태를 검토하고 NB 번호 (하늘색), 등. D)을 정량화하는 것이 특히 유용합니다. 미세 소관 (녹색). E)
영화 1. 하나의 NB의 세포주기의 라이브 영상. 세포 피질에 라벨을 GFP - 모에을 표현하는 뇌에서 하나의 NB 세포 분열의 시간 경과 이미지. 이미지는 40 배 배율로 단일 광 비행기에서 취득했다. 이 영화에서, 프레임은 매 15 초를 촬영했다. 인수의 약 7 분 후, 속도는 하나의 프레임 매 5 초마다 증가했다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2. 라이브 영상 연속 라운드 오F NB ACD. GFP - 모에와 GFP - 라벨 중심체 마커를 발현하는 뇌 세포 분열의 3 라운드를 겪고 NB의 시간 경과 이미지. 이미지는 60X 배율에서 2 분 시간 간격으로 취득한 것은. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 라인 | 레이블 세포 구조 | 형광 | 식 / 발기인 | 소환 |
| YFP - Asterless | 중심 소체 | YFP | 유비퀴틴 | Rebollo, 외. (2007) 데브. 셀 (12) :. 467. |
| SAS6-mCherry | 중심 소체 | mCherry | 내생 | Rusan 및 페이퍼 (2007) J. 휴대 BIOL. 177 |
| GFP-SAS6 | 중심 소체 | GFP | 내생 (BAC) | Lerit 및 Rusan (2013) J. 휴대 BIOL 202 :. 1013. |
| GFP-PACT | 중심 소체 | GFP | 유비퀴틴 | 마르티네즈 - 캄 푸스, 등. J. 휴대 BIOL 165 :. 673. |
| GFP-SAS4 | 중심체 | GFP | 유비퀴틴 | 딕스와 하층 사회 (2007 년)의 문헌 [Curr. BIOL 17. 1759. |
| GFP - 폴로 | 중심체 | GFP | 내생 | . 무티 뉴 - 산토스, 외 (1999) BIOL 셀 91 :. 585. |
| GFP-γ-튜 블린 (23C) | 중심체 | GFP | 유비퀴틴 | Lerit 및 Rusan (2013) J. 휴대 BIOL 202 :. 1013. |
| GFP-Centroso분 | 중심체 | GFP | UAS | Megraw, 외. (2002) J. 과학 셀 115 :. 4707. |
| GFP-SPD-2 | 중심체 | GFP | 유비퀴틴 | 딕스와 하층 사회 (2007 년)의 문헌 [Curr. BIOL 17. 1759. |
| mCherry-α-튜 블린 | 미세 소관 | mCherry | 유비퀴틴 | Rusan 및 페이퍼 (2007) J. 휴대 BIOL 177 :. 13. |
| GFP-α-튜 블린 | 미세 소관 | GFP | 유비퀴틴 | . Rebollo, 외 (2004)의 PLoS BIOL 2. E8. |
| 목성-GFP ( "G147") | 미세 소관 | GFP | 내생 | 모린, 외 (2001) PNAS 98 :.. 15050. |
| mCherry - 목성 | 미세 소관의 | mCherry | UAS | Cabernard 및 미상 (2009) 데브. 셀 17 : 134. |
| H2AvD-MRFP | DNA | MRFP | 내생 | Pandey 다음, 외. (2005) J. 과학 셀 118 :. 733. |
| H2AvD-GFP | DNA | GFP | 내생 | 클락슨과 생 (1999) DNA 세포 BIOL 18. 457. |
| Moesin-GFP | 외피 말라 | GFP | 스파게티 스쿼시 | Kiehart, 외. (2000) J. 휴대 BIOL 149 :. 471. |
표 1. ACD의 연구에 유용 유전자 변형 라인 중 하나를 선택합니다.이 융합 구조는 세포 분열을 공부에 특히 유용하다. 그들은 일상적으로 NB 라이브 영상 연구에 사용됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
라이브 세포 이미징은 줄기 세포의 ACD, 세포 계통의 분화를 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 귀중한 방법, 복잡한 조직의 형태 형성이다. 연구 그룹은 역사적 NB ACD를 시각화하는 다양한 기술을 채택하고 있지만, 이러한 방법은 일반적으로 주로 뇌 조직은 그대로 유지 또는 해리되어 있는지 여부에 대하여 다른 두 가지 범주로 분류 될 수있다.
영상은 NBS는 장점을 가지고 해리. 하나, 그들이 배양 접시에서 가장 큰 (직경 약 12 μm의) 세포로 식별 특히 쉽기 때문에 NBS 이미지에 쉽게 해리. 또한, 유리 표면에 배양 거의 모든 줄기 세포는 화상 획득 기간 동안 현미경 대물 부근에 동일하게 될 것이다. 타임 랩스 영상의 광학 품질은 상기 SEM을 유도하는 폴리-L-라이신 또는 피브리노겐 코팅 글라스 하나의 사용으로 개선된다라운드 NBS (16, 17)의 I-평탄화. 배양에서 자란 해리 NBS을 이미징하는 또 다른 장점은 배양 매체가 교환 될 수있는 용이성이다. 세포 등 약리 효능 제, 길항제, 또는 immunoblocking 항체, 임의의 개수를 포함하는 배양 배지를, 피복 된 유리의 표면에 부착되면. 추가하거나 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, 해리 NBS를 시각화하는 최근의 접근 방식이 기술은, 참으로, 장기간의 이미지 수집 (18, 19) 의무가 있음을 증명하고있다.
그럼에도 불구하고, 촬상에 단점 NBS는 프로토콜의 복잡성을 포함 해리. 대부분의 방법 세부 사항 긴 (30 ~ 60 분)으로 분산 된 세포가 정착 배양 접시 17, 19을 준수 할 수 있도록 긴 배양 단계 (60 분) 다음에 화학 소화.
대조적으로, 뇌 손상에서 촬상 NBS 모두 유지생리 학적 상황과 조직의 형태. 이 방법의 장점은 틀에 박힌 계약 또는 정의 개발 회 1에서 개발 특정 NB 계통을 식별 할 수있는 기능을 포함합니다. 따라서, 우리의 단순화 된 프로토콜은 또한 분화와 형태 형성 이벤트의 라이브 조사를 허용하는, ACD의 연구를 넘어 확장 유틸리티를 가지고 있습니다. 이 방법의 단점은, 그러나, 매체를 배양 교환 할 수 없다는 것입니다. 따라서 연속적인 줄기 세포 부문의 장기 영상에 관심이 연구원은 가장 자신의 응용 프로그램에 맞는 접근 방식 (전체 마운트 대 해리 차 문화)를 고려해야합니다. 마찬가지로, 인슐린 또는 혈청과 같은 배양 첨가제에 대한 필요성은, 촬상 조건 (등 영상의 재생 시간, 샘플을 때리는 빛의 양.) 및 실험 구성을 기반으로 경험적으로 결정되어야한다.
일반적으로, 우리는 해리를 활용하는 것이 좋습니다이 작은 분자 (예를 들면, 억제제, 등.)의 도입에 NBS의 급성 반응을 평가하는 데 필요한 연구를위한 D NBS는 높은 처리량의 응용 프로그램에 대한 뇌의 미세 미세 절제가 너무 복잡 할 수있는 경우에, 고급 이미징 연구를위한 커버 슬립 물리적 접촉하도록 NB이 필요한. 반면에, 우리는 이미지에 유용한 응용 프로그램에 그대로 뇌를 활용하는 것이 좋습니다 같은 뇌, 특히 연구에서 몇 NBS 우려 세포 - 세포 상호 작용, 자율성, 클론 분석, 세포의 모양 변경 및 기타 조사 곳 네이티브 그 세포의 환경이 중요하다.
라이브 이미징 그대로 두뇌의 성공적인 준비를 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계는 신중하게 실행해야합니다. 무엇보다도 불필요한 외상에 조직을 노출되지 않도록하는 것이 필수적이다. 특히, 뇌를 explanting와 주변 조직을 제거하는 치료와 함께 수행해야합니다. 한해부 도구와 뇌 사이의 직접 접촉을 최소화해야합니다. 또, 하나 당기는 또는 뇌 조직에 부착 당겨 피해야한다. 조직을 잘못 취급하면 쉽게 찢어 지거나 왜곡 두뇌가 발생할 수 있습니다. 우리 손에, 손상된 뇌에서 NBS는 거의 구분하지 않습니다. 애벌레 뇌 해부에 새로운 개인은 종종 라이브 영상에 대한 샘플을 준비하기 전에 해부 마스터에서 혜택을 누릴 수 있습니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 세포 이미징을 살 이전에 뇌의 장착입니다. 배양 배지 및 HC 오일 모두의 올바른 볼륨 유용한 준비를 마칠 수 있습니다. 정확하게 피펫으로 HC 점성 오일을 측정하기 어렵지만, 사람의 눈에 의해 올바른 볼륨 (30 μL)를 근사있다. 너무 많은 액체가 제자리에 정착에서 커버 슬립을 방지 할 수 있습니다. 종종,이 배양 접시의 표면에 움직이는 뇌 초래한다. 라이브 영상 중에 불안정한 커버 슬립은 EVI입니다덴트 때 조직이 감도 또는 광 엽 (叶) 롤. 장소에 배치되지 않은 샘플은 피해야한다. 반대로, 너무 작은 배양 매체 또는 버스트 광 엽 (叶) 등의 치명적인 조직 손상에서 HC 오일 결과를 추가. 커버 슬립이 슬라이드의 원인이 너무 많은 액체를 사용하여 대 커버 슬립의 무게를 처리하기에 충분한 액체 매체와 기름을 사용 사이에서 균형을 이룬다. 이 밸런스가 가장 좋은 방법을 알게된다. 일반적으로는 이미지와 같은 그대로 복부 신경 코드와 대칭, 둥근 광 엽 (叶)으로 건강한 형태를 가지고 그 두뇌에 최고입니다.
샘플이 탐지되지 드리프트가 장착되면, 살아 샘플을 유지하는 것은이 프로토콜의 다음 중요한 측면이된다. 이것은 최선의 적정 온도를 유지하고, 가장 중요한 것은, 샘플을 안타 빛의 양을 최소화함으로써 달성된다. 현미경 설정 및 샘플 (L)의 성공을 규정 할 것이다 두 변수 아르세포 이미징을 필자. 고품질 목적, 필터 (~ 98 %의 전송) 및 카메라 (후면 씨닝 전자가 승산 및 상보성 금속 산화물 반도체) 배출 측의 하나가 여기 측에 샘플을 안타 빛의 양을 감소하는 것을 허용 할 것이다. 그것은 잘 (이미지 GFP에 사용) 푸른 빛이 세포에 독성이 강한 것으로 알려져있다. 하나는 전체 광 (총 노출 시간은) 주어진 샘플을 견딜 수있는 양을 확인하고 전파해야하는 실험 기간에 따라 총 시간. 샘플은 현미경 특정 설정을 기반으로 500 레이저 광 노출을 견딜 수있는 경우에 예를 들어, 하나의 50 × 10-슬라이스 스택을 상환 있었다. 이러한 스택은 3 ~ 세포주기를 수집하는 단일 NB 세포 사이클 또는 2-3 분을 수집 한 분에 의해 이격 될 수있다. 또, 각각의 유전자형에 대한 설정을 최적화하는 것은 성공적인 실시간 이미징을 위해 중요하다. 최적화 기간 동안, 488 nm의 레이저 파워에 대한 양호한 시작점은 100X, NA 및 1.4에서 집중적 25-50 μW이며# 160; 기름 침지 목표. 마지막으로, 하나는 항상 가장 정교한 영상이 필요한 경우가 아니라 같은 이미징 조건이 제대로 손에 질문에 대답 무슨 결정해야합니다.
라이브 또는 고정 어느 조직과 실험을 위해, 뇌에 장착 될 수있다 이미지 특정 NB 계통하도록. 그림 3E에 도시 된 바와 같이, 예를 들어, 진부 광 엽 (7)의 후방 - 중간 영역에있는 이미지 유형 II NBS에 위해, 하나는, 두뇌를 탑재합니다. 중앙 뇌 NBS의 공간과 시간적 패턴이 아니라 1을 기록 되었기 때문에 이상적으로, 유비쿼터스에서 표현되거나 널리 사용되는 유전자 변형 구조, 내생 발기인의 숫자를 사용하는 동안, 하나는 이미지에 특정 NB 클러스터의 다양한 우리의 프로토콜을 사용할 수 있습니다 (표 1). 그럼에도 불구하고, 혈통 특정 라벨링 기술 (20)는 응용 프로그램의 번호를 유용하게 남아있다.고정 분석, 작은 손상과 뇌는 일반적으로 허용됩니다. 또한, 주변 조직의 완전한 제거는 단지 매체를 장착의 두뇌를 포함 이전까지 연기 될 수있다. 고정 된 조직과 연구는 NBS 많은 수의 이미지가해야 할 때 특히 유용합니다.
결론적으로, NB ACD의 연구는 크게 라이브 셀 이미징 및 자세한 고정 분석 모두의 사용으로 혜택을했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 라이브 또는 고정하거나 응용 프로그램에 초파리 애벌레를 준비하는 한 가지 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 상세한 영상 연구를 통해 NB ACD의 지속적인 조사가 새로운 개발과 질병에 줄기 세포에 대한 우리의 이해를 사전 것입니다 흥미로운 결과를 발표 할 예정 기대하고 있습니다. 그대로 애벌레 뇌의 장기 라이브 영상의 응용 프로그램은 분화와 형태 형성의 개발을 관리하는 이벤트 (그리고 DEGEN의 시간적 순서로 새로운 통찰력을 발견 할 가능성이있다중추 신경계 .14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 DAL에 수여 건강 / NHLBI (1ZIAHL006126)와 Lenfant 생물 의학 박사 학위 취득 후 친교의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
