Summary
このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。
Abstract
自己再生する幹細胞と分化細胞：幹細胞は等しくない運命電位を有する2つの子孫細胞を生成するために非対称的に分割する。開発と疾病との関連性を考えると、非対称幹細胞分裂を支配するメカニズムを理解することは、研究の強固な地域となっている。それらは遺伝的に扱いであり、約時間ごとに細胞分裂の連続ラウンドを受けるので、 ショウジョウバエ中枢神経系、または神経芽細胞の幹細胞は、幹細胞分裂の研究に不可欠なモデルである。約100神経幹細胞は、ライブイメージング顕微鏡研究のために、このモデル系は、特に有用なものつ幼虫の脳葉の表面付近に位置する。本研究では、幹細胞分裂を視覚化するために広く使われているいくつかのアプローチを検討し、我々は完全な脳組織に対する解離し採用するこれらの技術の相対的な利点と欠点を解決する。また、細部たちsimplifIEDプロトコルは、生細胞イメージングのための3齢幼虫と固定分析アプリケーションからの全脳を外植するために使用する。
Introduction
幹細胞は、初期の開発中に、携帯多様性を生成し、成体組織に損傷を受けた細胞を置き換えるために、分化のバランスと自己再生を維持する。この恒常性の調節は損失および過剰膨張有害な組織変性又は腫瘍形成をもたらすことができる幹細胞集団の両方を防止する。
神経芽細胞（NBS）は、 ショウジョウバエの中枢神経系（ 図1A）は、胚の段階1、2中にその第1の形態の広く研究されている神経幹細胞である。自己再生する幹細胞と分化細胞：NBには、2つの不均等運命細胞を産生する非対称細胞分裂（ACD）の反復ラウンドを受ける。 ACDは、中心体、ほとんどのセル3の微小管組織化中心として作用する非小器官膜状に案内される。有糸分裂の際に、NBの中心体は、整理し、頂端 - 基底極性に沿って双極紡錘体の向きをITY軸。除するNBの切断の際に、幹細胞の運命を指定し、頂端の運命決定因子、および分化を指定し、基礎の運命決定因子は、不均等な娘細胞に分離される。
幼虫の中央の脳では、2つのタイプのNBは、それらの数、位置、転写因子の発現、及び細胞系統（ 図1A）4-6によって区別することができる。私のNBが最も豊富で入力して、約90それらの脳7の各視葉の前面及び後面を移入します。これらのNBSが転写因子Asense（ASE）を発現し、それらは特徴的に1自己再生NBに分割し、1より小さな神経母細胞（GMC、 図1B）。それぞれのGMCは、2つのニューロンまたはグリア細胞（ 図1B）を生成するために、単一の端末分裂を受ける。対照的に、各視葉の後側に移入8タイプIIのNBは、アセ発現を欠いている5。彼らは、ACDを受ける1自己再生NBと1の中間神経前駆（INP）を生成する。
INPは、順番に、非対称的に3〜5回に分割する。 INPの再生および単一GMC 4の製造におけるこれらの部 門の結果の各。総称して、特定のNBのIDとGMCの誕生の時間的順序は、成人の中枢神経系の驚異的な神経細胞の多様性を生じさせる。
NB ACDが大幅生細胞イメージング技術の使用によって改善されている根底にある細胞生物学を理解する。画像のライブのNBに研究者によって使用される公開されたプロトコルは、大きく異なります。全体的に、しかしながら、これらの方法は、幼虫の脳は無傷のままか、機械的に分離されているか否かによって区別2つの一般的なカテゴリにグループ分けすることができる。両方の技術は、研究者の用途に応じて明確な利点と欠点がある。
ライブNB細胞ディビを明らかに初期の報告排出は、幼虫の脳のマニュアル解離のある程度を伴う。これらのプロトコルの詳細は、8を塗りつけたり、カバーガラス上のNBの短期初代培養を成長させるために離れて9の脳をからかう。画像化を改善するために、円形のNBは、通常、ガラススライド8またはアガロースパッド9のいずれかを有するカバースリップ上に平坦化されている。扁平細胞は、光学系を改善してきたが、これらの技術は、多くの場合、分裂溝の回帰および複数回に分割することができないことを含め、NB有糸分裂の欠陥をもたらす。そのため、手動の解離と幼虫の脳組織の物理的な歪みの両方を伴うプロトコルは、一般的に非常に短期的な（ すなわち 、1細胞周期以下）用途に適しています。同様に、半退治または完全にガラススライドとカバースリップとの間で完全な脳を平坦化することは、時間1は、約30分の間10に与えられた標本を画像化過ごすことが制限されます。この制限にもかかわらず、THI複数のアプローチが成功裏に使用されてきた11-14。
画像のライブへの最近の努力は、ニッポン放送の限界に単離された細胞の物理的な歪みを解離さ。これらの技術は、複数の細胞分裂周期のための細胞培養物を維持する必要がある用途に特に有用である。例えば、手動で解離した脳由来の分散した細胞は、部分的に、長期的画像化のための16のフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物15から作られた血餅中に埋め込 まれてもよい。外植脳は最初の化学的酵素コラゲナーゼで解離していてもよい別の方法として、次の手動ピペットチップ繰り返し通すことによって破壊し、続いてポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ17、18上にプレー。フィブリノゲンまたはポリ-L-リジンのいずれかでガラス食器をコーティングすることは添付ファイルや主要な物理的な歪みのない、できるだけカバーガラスに近い、それらを持って来る、丸い細胞の広がりのわずかを促進する。 additi中に、これらの方法は、容易に、薬理学的摂動実験18のために交換することができる培地でのNBを培養することを含む。全体的に、直接的に分散されたNBにめっきすることは、長期的な撮像能力を犠牲にすることなく、結像光学系を改善する。最近では、解離のNBの長期培養を記述するプロトコルは19で詳述されている。
しかし、このアプローチには限界がないわけではない。のNB解離ライブイメージングには、いくつかの注意点があります。分散した細胞の分野では、例えば、それは、空間的に無傷の脳1に編成されている特定のNB系統を識別することは困難である。同様に、タイプ解離した組織内のIIのNBに対してタイプIとを区別することは、worniu-GAL4、asense-GAL80 20などの系列のトレーサーまたはサブタイプ特異的導入遺伝子の発現なしにも困難である。これらの導入遺伝子はいくつかのアプリケーションのために非常に有用であるが、それらは、それらの導入遺伝子EXに研究者を制限しないUASエンハンサーエレメント21の制御の下に押されて、より複雑な遺伝的スキームを必要とする。のNBの空間的、時間的発展に関係する研究は、従って、無傷の組織の文脈におけるin vivoイメージングに必要とする。
また、解離した胚のNBの研究は、主要な極性の相間局在22,23を決定基に隣接するセルの物理的な接触が重要であることを示している。これらの研究は完全に分離されたNBにはもはや不変紡錘体軸を維持示さない。その代わりに、これらの細胞は、よりランダム化されたスピンドル軸と根尖中心体ポジショニング22の損失のため、おそらく、連続GMCの芽、との分離の広い角度を表示します。幼虫のNBおよびその隣接セルとの関係は広く研究されていないが、それは幼虫の幹細胞の微小環境が細胞極性又は他に衝突してもよいことを考慮する価値がある行動。幼虫のNBの生理的コンテキストを維持するために、全脳からの我々のイメージのACD。
イメージング解離したNBSで、それに関連する生来の制限を考えると、私たちの研究室などが全体の幼虫脳からNBのACDの画像連続ラウンドにプロトコルを確立しています。画像無傷の脳への技術は、多くの場合、組織の歪みや損傷を防止し、ガス交換を可能にするために、可撓性膜と培養チャンバーの一方の側のガラス表面の剛性を置き換える。いくつかの方法は、10幼虫24から分離され、脂肪組織と昆虫培養培地、血清、アスコルビン酸の混合物に取り付け外植脳を伴う。それらはNB細胞の分裂25を刺激することが知らマイトジェンを分泌するため、単離された脂肪体を添加する。このプロトコルは、3以上の時間、組織の一体性を維持し、長期的なイメージング24、26〜28の影響を受けやすいことである。最近では、プロトコルは、経度を記述するアスコルビン酸、血清、および脂肪体の存在下で、無傷の幼虫の脳gの長期イメージングは29で詳述されている。組織が 露出することも、固定化もされていないため、重要なのは、このアプローチは、培養培地（ 例えば 、薬剤の研究、免疫除去など ）で交換されるアプリケーションにはあまり有用である。
私たちの研究室では、長期的なイメージング30、31、ライブ幼虫の脳の全体のマウントの準備を簡素化しました。他のものよりも我々のプロトコルの主な利点は、その単純です：我々の観察は、どちらも、血清、アスコルビン酸、インスリン、また脂肪体はNBのACDの画像連続ラウンドに必要な添加剤であることを示す。我々のイメージング媒体は、駅の単純な混合物からなるように、インスリンのような添加剤は、 ショウジョウバエ卵巣における幹細胞の分裂32と集合細胞遊走33の延長されたイメージングのために有用であったが、それらは、NB ACDのために不要であると思われるndard昆虫細胞培養培地は、汚染を防ぐために抗生物質 - 抗真菌を補充した。再利用可能なガス透過性又はガラス底培養皿を用いることにより、我々は連続したNB ACDの数ラウンドを持続することができた。同じ試料は、容易に外植免疫蛍光及び固定された組織との他の手順のために使用することができる。このプロトコルでは、細部そのまま幼虫の脳の解剖だけでなく、ライブおよび固定の両方の分析のための脳の準備。
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Protocol
1。必要なものの調製三齢幼虫の脳を外植する
- マイクロダイセクションのために必要なツールを準備します。
- まず各ピンホルダーに一つの解剖ピンを配置することによって、2解剖のツール（小刀とフック）を偽造。手やペンチ（ 図1C）でしっかりとピンを固定します。
- 約120°の角度に1解剖のピンを曲げ古いピンセットを使用してください。ピンホルダーを手で保持されている場合、ピンの上半分が平らになることを確認するために解剖顕微鏡下でこれを行います。このツールは、押したままにしたり、組織を通ってスライスする、メスとして使用されます。
- 保持し、組織を削り取るために使用されるフックに第二のピンを曲げ古いピンセットを使用してください。
- 損傷からツールを保護するために、ピペットチップで各解剖ツールをカバーしています。注意して、整形ツールは、無期限に切開に使用することができる。必要に応じて破損したり、変形ピンを交換してください。
- メディアを解剖準備します。
- 組織培養フードでは、シュナイダーの培養培地に抗生物質 - 抗真菌サプリメントを希釈する。サプリメントを組み込むために、メディアを旋回。
- 補充培地のいくつかの5ミリリットルのアリコートを準備します。使用するまで4℃ですべてのメディアを保管してください。
- 室温に添加した培地の5ミリリットルの分量を温める。無菌5ミリリットル注射器にメディアを描画し、滅菌0.2μmのシリンジフィルターのネジ。
- 解剖のための幼虫を選択します。脳が解剖するのが最も簡単なように3齢幼虫のクロールを選択するために解剖プローブを使用してください。オプション：ブドウの寒天プレート上の堆積物の幼虫。
注：これらが途中で出クロールする第二または第一齢幼虫を強制する傾向があるので、「ウェットフード」が過度に混雑したバイアルまたはボトルを使用しないでください。
注：一部の遺伝的背景には、若い幼虫を使用して必要となります。これは、プロトコルには影響しませんが、Dを作るんissectionより難しい。
中枢神経系の2。解剖
- シングルスライドガラス上に、約3cmで区切って暖かい解剖メディアの2 50ミリリットルプールを作成します。 Oneプールは、微細な切開（ 図1C）のために使用肉眼解剖およびその他のために使用される。
- メディア滴の1にいくつかの幼虫を転送します。
- 解剖顕微鏡に幼虫をカバースリップを移動します。幼虫の前部と後部の端が識別可能であるように、幼虫を含むプールに拡大します。
- シングル幼虫の中間領域を把握するために鉗子のペアを使用してください。一方で鉗子の第二の対を取り、同じ領域に近い幼虫を把握する。そっと半分に幼虫を引き裂くために離れて鉗子の2ペアを引き出します。カバーガラス上のすべての幼虫のために上記の2つの手順を繰り返します。
- 組織にそれらを転送することにより、幼虫の体の後半分を処分。
- 目のように幼虫を拡大Eの前方mouthhooksがはっきりと見える。第三の胸部と第前歯歯状突起のバンド間の幼虫mouthhooksの反対側に小さな切開、またはノッチを作成するために鉗子の両方のペアを使用してください。
- 非利き手での鉗子でmouthhooksを把握。そっと前方から後方方向にキューティクルを離れて剥離する一方で鉗子を使用してください。中枢神経系が露出するまで、ゆっくりとキューティクルをはがし続けています。
- 鉗子で組織を引き裂くことによって幼虫の他の部分から、中枢神経系を分離します。中枢神経系を乱さない、十分に注意してください。
重要なステップ：中枢神経系に引っ張るしないでください！破れた腹側神経索（ 図2A）または歪んだ光ファイバのローブ（ 図2Bおよび2B '）で損傷したサンプルを廃棄します。 - カバーガラス上のすべての幼虫のために上記の2つの手順を繰り返します。に健全な移植組織を転送細かい解剖段階のためのカバーガラス上に媒体の第2の（きれいな）プール。
- 脳から末梢組織（ 例えば 、眼、羽、脚ディスク）を一掃するために解剖ピンツールを使用してください。カバーガラスに結合組織を固定、思った（脳）と、不要な組織との間のメスをスライドさせます。同時にのこぎりのような動きでカバースリップにメスを押しながらゆっくりと望ましくない組織を離れていじめるのフックを使用しています。
- 重要なステップ：各脳からすべてのディスクを削除するには、ゆっくりと意図的に操作する。脳の形態を乱さないように、十分に注意してください。健康な脳はそのまま腹側神経索および対称、丸い光のローブ（ 図2C）を持つことになります。
3。ライブイメージング用取付外植脳を
- 上に向けて透明なフィルム（ 図2D）と50ミリメートルのガス透過性培養皿を反転します。 Tの上に、媒体の小滴（約30μL）を堆積させるために注射器を押し下げる皿の彼が中心に。
- 皿上の培地のドロップに孤立した頭脳を1つずつ、転送します。視神経葉の下に頭をすくい上げるようにフックツールを使用します。代わりに、腹側神経索から突出する軸索を把握する鉗子を使用しています。
- 培地のドロップに5月10日脳を収集します。それらの多くは、メニスカス（ 図2E）にトラップされるように、培地のドロップの底に、個々の脳をプッシュする解剖ピンツールを使用して脳を沈める。
- 撮像されるのNBに応じて脳を整列させるために解剖ピンツールを使用して、東洋は脳（ 図3A）。イメージに背のNB、（膜に沿って）を下に向け腹側神経索を配置。イメージにanterio腹NBSを、（離れて膜から）上に向けて腹神経索で脳を置く。すべての腹側の神経コードがxy平面内で同じ方向を指すように脳の位置を合わせます。
- 注射器やプラスチックの転送Pを使用して、ipetteは、ガス透過性膜上に4ハロカーボン（HC）の油滴（約30μLずつ）配置します。オイルのそれぞれの滴の体積は、互いに、中のドロップと同等でなければなりません。空間の油滴が、培養培地の液滴を中心にカバースリップの四隅に対応する。完了したら、5滴（オイルを4滴、センター内の媒体の1滴）洋風サイコロ（ 図3B）上の5小面のようになります。
- それは同時にすべての5滴を打つように、アセンブリの＃1.5 22ミリメートルのカバーガラスを下げます。サンプル全体に均一な圧力を維持することは、彼らが中断される可能性を低減します。石油や媒体がカバーガラスの重みで分散して約3分待ちます。媒体の断面のような形状は、（ 図3Cおよび3D）を形成する。
- 重要なステップ：ティッシュペーパーの芯を使って余分なメディアを削除することで脳の表面上にカバースリップを下げ（ ふぃぎゅ）3Cを再び。解剖スコープの下にサンプルを見ながら、これを行う。培地が除去されるように、カバースリップを下げるであろう。カバースリップが脳に触れるいったん停止します。過ぎないことウイックこれは、組織の歪みや脳爆発の原因になります。
- イメージング背NBS（ 図3E）は 、3.9のステップに移動した場合。イメージングanterio腹のNB場合は、カバーガラスが少し腹神経索先端の方向に（静かにピンセットでそれを少しずつ動かし）移動させなければならない。これは、イメージング（ 図3F）を容易にするためにカバースリップに直接接触して脳ローブをもたらしている、脳を回転させる。
- ハロカーボンオイル（ 図3D）少量のカバーガラスを囲むことによって、チャンバをシール。カバースリップからにじみ出る余分な油は最小限にし、ティッシュで吸い取っする必要があります。
中央脳神経芽細胞の4。ライブイメージング
注意：この作品は、ニコンのEclipseのTi回転ディスク共焦点顕微鏡（倒立顕微鏡）をライブイメージングのために使用した;私たちのセットアップの詳細は、以前に31を発表されている。あるいは、サンプルは、直立システムを用いて画像化することができる。
- ただマウント脳の上にカバーガラスにイマージョンオイルの滴を追加します。これは直接サンプル上記目的を中心に役立ちます。
- 重要なステップ：ステージインキュベーターで25℃の一定温度で脳を維持する。そっとステージインキュベーターに搭載されたサンプルを配置し、その蓋をチャンバーをカバーしています。
- 光のローブの中心と内側の領域に存在する大規模な、丸い細胞に着目し、透過光を利用し、中央の脳のNBの位置を確認し、 落射蛍光を使用しないでください 。これは実際に容易になる。これは、可能な限り光の最小量にサンプルを露出させるために非常に重要である。損傷している時間イメージング脳を無駄にしないでください。
- 一度場所で、共焦点をするために使用して迅速なエクスポージャーを取る適切な場所と深さを決定する。最初の10から15μmの深さを制限する。必要に応じて調整し、別のテスト画像を撮影。
- オプションのステップ：なしXYドリフトがないことを確認するために腹側神経索のテストムービーを収集します。ドリフトが検出された場合、安定するまでのサンプル用に15〜30分待ちます。ドリフトが30分に定住していない場合、新しいサンプルを準備します。主なドリフトは通常、余分な油を添加にまで遡ることができ、油の不均等な大きさは、実装時に削除されます。
- 軸のドリフト（Zドリフト）を除去するには、赤外線LEDを使用しています連続自動焦点調節装置を使用しています。代わりに、手動で焦点面を修正します。
- 興味のあるNBが識別されると、イメージング療法を進める。すべての生細胞イメージング、レーザー光の量と同様に、露光時間、カメラビニング、対物倍率、時間及び/又はzステップ間隔は、すべての実験的に手元の質問に答えるために、特定の実験のために最適化されなければならない。目標は、光のダムを最小化することである加齢まだ有用なデータを収集しながら。追加的なガイダンスのための議論を参照してください。
- 画像のZ軸方向の1程度だけ離れた12月14日の画像を収集することで、NBの全体積。同じNBの単一または複数の細胞周期を捕捉する時間分解能を調整する。一般的なガイドラインとして、単一の細胞周期のイメージングと複数の細胞サイクルの1〜3分間隔のために10から30秒間隔を使用しています。
- 重要なステップ：サンプルは、有糸分裂の継続時間を監視することにより、健康であることを確認します。有糸分裂は、15分以上かかる場合は、別の脳に移動します。健康な脳は、有糸分裂のいくつかのラウンドを受けて同じ視野内の多くのNBが表示されます。各細胞周期が少し長く、光損傷に前のものよりであることに注意してください。
- イメージングが完了すると、インキュベーションチャンバーを分解し、ガス透過性培養ディッシュ以外のすべてを破棄します。 95％エタノールで培養皿の表面を洗い流してティッシュでよく拭いてください。さらに2回繰り返します。
免疫蛍光のために脳の5。準備
- 添加培地の約0.2ミリリットルを含む1.5 mlチューブに20以上の外植頭脳を集める。
- チューブから培地を除去し、0.5ミリリットルPBSTx（0.3％トリトンX-100を含むリン酸緩衝生理食塩水、PBS）で一回の脳をすすぐ。脳は、液体のすべての取引所間のチューブの底に沈殿してみましょう。トリトンX-100界面活性剤は、組織を透過性にするために使用される。通常、リンスすると、30秒未満かかります。脳は、チューブの底に沈殿した後、単純にPBSTxを削除します。
- PBSTxで希釈された9％の電子顕微鏡グレードホルムアルデヒドの0.5ミリリットルで溶液を交換してください。室温で15分間インキュベートして章動。
- 有害廃棄物規制条例に従った固定液を廃棄してください。
- 15分間0.5ミリリットルPBSTxでサンプルを洗浄します。新鮮PBSTx 2回以上に洗浄ステップを繰り返します。
- 0.5ミリリットル、PBT（PBS、1とソリューションを交換してください％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び0.1％のTween-20）。室温で1時間ニューテーションでインキュベートする。組織への抗体の非特異的結合、このステップをブロックします。
- 4％正常ヤギ血清（NGS）を補充したPBT中に希釈した0.5ミリリットル一次抗体とソリューションを交換してください。 4℃で一晩章動でインキュベート
- 希釈した一次抗体を破棄または保存します。
- 15分間0.5ミリリットルPBTでサンプルを洗浄します。新鮮PBT 2回以上と洗浄ステップを繰り返します。
- 変性PBT（PBS、2％のBSA、0.1％のTween-20、および4％NGS）の0.5ミリリットルとソリューションを交換してください。室温で1時間ニューテーションでインキュベートする。
- 変性PBTに希釈0.5ミリリットル二次抗体とソリューションを交換してください。室温で2時間ニューテーションでインキュベートする。
- 0.5ミリリットルのPBST（0.1％のTween-20を含むPBS）で溶液を交換してください。室温で15分間インキュベートして章動。新鮮PBSTで洗浄ステップを2回繰り返します。
- 慎重にスライドの中央より左に向かって降下を制限する、スライドガラス上のドロップなどの試料を移す。
- スライドの中心に封入大粒（直径約2cm）（例えば、Aqua-Poly/Mount）を追加します。左にあるのPBSTプールを避ける。
- 封入剤のプールにPBSTのプールから脳を転送するために鉗子を使用してください。脳の上に直接封入剤を追加すると、その方向が中断されると、避けるべきである。
- 光学顕微鏡下で、上に向けて結像される側と封入剤のサンプルを配置する。
- 光学顕微鏡下でスライドして、徐々にサンプルの上に＃1.5ガラスカバースリップを下げる。オプションのステップ：軽くカバースリップを押すことによって、マイナーな気泡を取り除く。
- 光、フラットスライドを横にすることにより、一晩封入剤を数時間重合することができるように、または室温で、保護された。
- スライドは翌日画像化、またはそれ以前の画像に保存することができる。
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Representative Results
ライブイメージングは、NB、ACDを制御するメカニズムの数を明らかにしました。画像取得の前に、最適な撮影条件を決定する必要がある。これは、生細胞イメージングの持続時間を有するフレームキャプチャレートのバランスをとることが必要である。微粒子の細胞分析のために、例えば、一時的な増加と光学分解能が必要とされ得る。単一NB細胞周期（ 図4A）を可視化する際に、画像が取り込まれる速度は、光損傷を導入することなく増加させることができる。典型的には、単一細胞分裂事象は、約10〜30秒の時間間隔で監視することができる。組織を損傷することなく時間分解能を増大させる1つの方法は、画像取得速度を調節することである。例えば、タイムラプス撮影次いで興味深い特徴又は時点（ 映画1）の観察に増加する下部フレームレートで開始することができる。
（細胞分裂の連続ラウンドを撮像する
多数のサンプルの分析のために、それは固定のNBを分析することがしばしば必要である。当社の固定プロトコールはのNBの全体的な形態を維持し、免疫蛍光アッセイ（ 図4C-4E）と互換性があります。ホールマウント固定BRAIナノは、全体的な脳の大きさと形状を視覚化するか、のNBを検出するために低倍率（ 図4C）で画像化されてもよい。より詳細にNBに、またはその子孫ののGMCを可視化するために、より高い倍率を使用する必要があります。中程度の倍率（ 図4D）では、全体NB系統クラスターが観察されてもよい。詳細な細胞分析のために、より高い倍率（ 図4E）が使用される。
図1。NB ACDの生細胞イメージングのための全脳を外植。 A）幼虫の中枢神経系は2光のローブと腹側神経索で構成されています。のNBの二つのサブタイプは、ステレオタイプな位置に視葉を移入：I型（ダークブルー）およびタイプII（ライトブルー）、B）NBSをACDを受ける。各細胞分裂と、1 GMCを生じさせるためのNBを切断（またはINPは、図示せず）及びNB幹細胞を再生する。 GMCは（図示されていない、またはグリア）2つのニューロンを生じるように分割する。C）二つの顕微解剖ツールがピンホルダーに解剖ピンを挿入することによって組み立てられる。ピンを曲げユニークなツール、小刀や、ピアスを切断し、基盤となる脳に損傷を与えることなく、不要な組織を置換するために使用されるフックを作成します。D）に脳を解剖メディア（青丸）の2つのプールに外植されています。媒体の一つのプールは、幼虫（肉眼解剖）から中枢神経系を除去するために使用され、他のプールは外植脳（微細切開）から末梢組織の微細マイクロダイセクションのために使用される。
図2。Preserv顕微解剖中の脳の形態のATION。性急な脳の解剖が、（A）引き裂か腹側神経コードまたは（B）を含む重篤な組織損傷を誘導することができる視神経ローブを歪め。さらにより繊細な組織の損傷（B '）は、生細胞イメージングのために避けるべきである。 （C）ライブイメージングD）光学的に透明な、ガス透過性膜。E）ガス透過性の皿に培地を培養中に配置されたいくつかの健康な脳の回収に適した健康な組織試料の例。これらの脳を顕微鏡用にマウントする準備ができている。スケールバー：（AC）、100ミクロン; （D）25mmで; （E）1ミリメートル。
図3。生細胞イメージングのための脳のマウント。 A）は、脳sが皿の中央に堆積培養培地の液滴内の行に配列されている。B）培地の液滴は、ほぼ等量HCオイル滴に囲まれている。 HC油の4滴と培地の中央低下はサイコロを再生する5ファセットは似ている。カバースリップは、油滴上に下降された後、（C）は、ウィックキムワイプ組織から作らおよび過剰の流体を吸収するために使用される。D）カバーガラスの外側エッジは、蒸発を停止するオイルの薄層に囲まれ培養培地。これらの脳は現在、顕微鏡観察のための準備ができました。EとF）カバースリップに対する脳の相対的な向きは、生細胞イメージングのためにアクセス可能である神経芽細胞を決定します。E）背側神経芽細胞が腹側は気体透過膜に触れて脳を配置することにより画像化される。F）前-腹側神経芽細胞は、ARRによって画像化することができる背側は腹側神経索のヒントの方向に、ガス透過膜に接触してからカバーガラスを少しずつ動かして、下にある組織と脳をanging。この運動は、わずかな完璧なアライメント（緑の線）に所望の撮影軸を持って来るanterio - 背側表面に接触するカバーガラス、その視神経ローブを傾ける。
図4で除神経芽細胞のライブイメージングから。代表的な結果。AとB）NBのライブイメージングは、40X、1.3 NA油浸対物レンズを用いて全体のマウントの準備に細胞分裂幹。時間は分として表示されます。タイムラプスの開始に秒を基準A）スティルス、GFP-モエシンを表現NBから単一細胞周期のタイムラプスイメージングから（GFP-MOE）。単一細胞周期の画像取得速度は、光損傷を誘導することなく時間分解能を高めるために増加させることができる。B）スティルスGFP-萌とGFP-標識された中心体マーカーの両方を発現NBから連続した細胞分裂周期のタイムラプスイメージングする。複数の細胞周期に関連した長期間の光損傷を避けるために還元時間分解能を必要とする。イメージングCE）の過程で、各細胞分裂が増加する間の時間の長さが両方の光学ローブ上に配置された画像のすべてのNBへ全載標本。C））から一定の幹細胞の共焦点突起は、20Xの倍率が使用されることに留意されたい。この分析は、単一の視葉からNBS（ピンク）の大半は40倍の倍率で可視化することができる全体的な脳の形態を検討し、NB番号（水色）、 など 。D）を定量化するために特に便利です。微小管（緑）、E）
映画の1。シングルNBの細胞周期のライブイメージング。細胞皮質にラベルを付けるために、GFP-萌えを表現する脳からの単一のNB細胞分裂のタイムラプス画像。画像は40倍の倍率で単一の光平面から取得した。この映画では、フレームは15秒ごとに撮影した。買収の約7分後、レートは、1フレームごとに5秒に増加した。 映画を見るにはここをクリックしてください。
映画の2。ライブイメージング連続ラウンドOGFP-萌えとGFP標識中心体マーカーを発現し、脳内の細胞分裂の3回を受けてNBのNB ACD。タイムラプス画像F。画像は60Xの倍率で2分の時間間隔で取得した。 映画を見るにはここをクリックしてください。
| ライン | ラベルされた細胞構造 | 蛍光色素分子 | 表現/プロモーター | 引用 |
| YFP-Asterless | 中心小体 | YFP | ユビキチン | Rebollo ら （2007） 開発。 467：セル 12。 |
| SAS6-mCherry | 中心小体 | mCherry | 内因性の | Rusanとペイファー（2007）J.セル·バイオロジー。177 |
| GFP-SAS6 | 中心小体 | GFP | 内因性（BAC） | LeritとRusan（2013）J.セル·バイオロジー202：1013。 |
| GFP-PACT | 中心小体 | GFP | ユビキチン | マルティネス·カンポス、 ら、J.セル·バイオロジー165：673。 |
| GFP-SAS4 | 中心体 | GFP | ユビキチン | DIXとラフ（2007）CURR。 1759：バイオロジカル 17。 |
| GFP-ポロ | 中心体 | GFP | 内因性の | 。モウチーニョ-サントスら （1999） バイオロジカル·セル91：585。 |
| GFP-γ-チューブリン23C | 中心体 | GFP | ユビキチン | LeritとRusan（2013）J.セル·バイオロジー202：1013。 |
| GFP-Centroso分 | 中心体 | GFP | UAS | Megraw、 ら（2002）J.セルサイエンス115：4707。 |
| GFP-SPD-2 | 中心体 | GFP | ユビキチン | DIXとラフ（2007）CURR。 1759：バイオロジカル 17。 |
| mCherry-α-チューブリン | 微小管 | mCherry | ユビキチン | Rusanとペイファー（2007）J.セル·バイオロジー177：13。 |
| GFP-α-チューブリン | 微小管 | GFP | ユビキチン | らRebollo、（2004）PLoSのバイオロジカル2：E8。 |
| JUPITER-GFP（「G147」） | 微小管 | GFP | 内因性の | モリンら（2001）PNAS 98：15050。 |
| mCherry-木星 | 微小管S | mCherry | UAS | CabernardとDOE（2009） 開発。セル 17：134。 |
| H2AvD-mRFPを | DNA | をmRFP | 内因性の | Pandeyさん、 ら（2005）J.細胞科学118：733。 |
| H2AvD-GFP | DNA | GFP | 内因性の | クラークソンサン（1999） のDNAセル·バイオロジー18：457。 |
| モエシン-GFP | 皮質アクチン | GFP | スパゲッティスカッシュ | Kiehart、 ら（2000）J.セル·バイオロジー149：471。 |
表1。ACDの研究のための有用なトランスジェニック系統を選択する。これらの融合構築物は、細胞分裂を研究するために特に有用である。それらは、日常的にNBライブイメージング研究に使用されている。
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Discussion
生細胞イメージングは、幹細胞のACD、細胞系統の分化を制御するメカニズムを研究するために使用される貴重なアプローチ、および複雑な組織の形態形成である。研究グループは、歴史的にNB ACDを視覚化するために様々な技法を採用しているが、これらのアプローチは、一般的に、主に脳組織が無傷のまま又は解離されているか否かに関して異なる2つのカテゴリーに分類することができる。
イメージングは、NBには、その利点を持って解離した。 1の場合は、それらが培養皿の中で最も大きい（直径約12μm）細胞として同定することが特に容易であるため、NBには、画像に簡単であるが解離。また、ガラス表面上に培養されるほぼすべての幹細胞は、画像取得期間を通して顕微鏡対物レンズにも同様に近くなる。タイムラプス画像の光学的品質は、さらに標準誤差を誘導するポリ-L-リジンまたはフィブリノーゲンでコーティングされたガラスのいずれかを用いて改善されるラウンドのNB 16、17のI-平坦。培養で増殖させ、解離のNBを撮像するための別の利点は、培養培地を交換することができる容易さである。細胞は、薬理などのアゴニスト、アンタゴニスト、または抗体immunoblocking、任意の数を含む培地を培養すること、コーティングされたガラス表面に付着した後。追加または除去することができる。最後に、解離のNBを可視化する最近のアプローチは、この技術は、実際に、長期の画像取得18,19に適していることを実証した。
それにもかかわらず、画像化には欠点のNBは、プロトコルの複雑さを含んで解離した。分散した細胞が定着し、培養皿に17、19に付着することを可能にするために、長いインキュベーション工程（60分）に続いてほとんどのメソッドの詳細に長い（30〜60分）、化学消化。
対照的に、無傷の脳からの撮像のNBの両方が保持生理的なコンテキストと組織の形態。このアプローチの利点は、ステレオタイプの構成で、または定義されている発達回1で開発し、特定のNB系統を特定する機能があります。そのため、私たちの単純化プロトコルは、それはまた、分化と形態形成イベントのライブの調査を可能にするので、ACDの研究を越えて延びているユーティリティを持っています。この方法の一つの欠点は、しかし、培地を培養交換することができないことである。そのため、連続した幹細胞分裂の長期イメージングに興味を持って研究者が最高の自分のアプリケーションに適したアプローチ（ホールマウントに対する解離し、初代培養）を考慮する必要があります。同様に、インスリンまたは血清などの培養添加剤の必要性は、撮影条件（撮影等の持続時間、試料に当たる光の量）および実験に基づいて、経験的に決定されるべきである。
一般的に、我々は、解離を利用することをお勧めそれは小分子（ 例えば 、阻害剤等 ）の導入のNBの急性反応を評価することが必要である研究のためのDのNBは、高スループットのアプリケーションのために脳の細いマイクロダイセクションがあまりにも煩雑になる可能性がある場合、および高度なイメージング研究のためのカバースリップと物理的に接触するようにNBを必要とする。これとは対照的に、我々はそれがネイティブの懸念の細胞間相互作用、自律性、クローン解析、細胞形状の変更、およびその他の調査場所のと同じ脳から、特に研究のためのいくつかのNBイメージに便利ですアプリケーションのための完全な頭脳を利用をお勧めします細胞の環境が重要です。
ライブイメージングのための完全な脳の正常な準備を確実にするために、いくつかの重要な手順を慎重に実行する必要があります。何よりも、それは不必要な外傷に組織を公開しないことが不可欠です。具体的には、脳を外植し、注意して行うべきである末梢組織を除去する。 1解剖ツールと脳との間の直接的な接触を最小限に抑えるべきである。また、1は、揺さぶるや脳に付着した組織を引っ張ることは避けてください。組織を間違えると容易に破れたり歪んだ脳で発生する可能性があります。私たちの手では、損傷した脳からのNBSがめったに分割ん。幼虫の脳の解剖を初めて使用する人は、多くの場合、ライブイメージングのためのサンプルを調製しようとする前に、解剖を習得するの恩恵を受ける。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、細胞イメージングを生きる前に脳の搭載である。培養培地およびHCの油の両方の正しいボリュームが役立つの準備を完了することが不可欠です。それは正確にピペットで粘性のHC油を測定することは困難であるが、人は目で正しいボリューム（約30μl）を近似することがあります。あまりにも多くの液体が所定の位置に沈降カバースリップを防止します。多くの場合、これは、培養皿の表面上を移動脳において生じる。ライブイメージング中、不安定なカバーガラスはEVIです凹みとき、組織が漂いまたは視神経葉ロール。適所に配置されていないサンプルは避けるべきである。逆に、少なすぎる培養培地またはバースト光学ローブを含む致命的な組織損傷におけるHC油結果を加算する。カバースリップをスライドさせるあまりにも多くの液体を用いて対カバースリップの量を処理するために十分な量の液体培地との間のオイルを用いて慎重にバランスが存在する。このバランスは、ベストプラクティスを通じて学習されている。一般に、このような完全な腹神経索と対称的な、円形の光のローブなどの健康的な形態を有するものの頭脳、画像のみのがベストです。
サンプルが検出可能なドリフトでマウントされると、生きているサンプルを維持することは、このプロトコルの次の重要な側面となります。これは、最高の適切な温度を維持し、最も重要なのは、試料に当たる光の量を最小にすることによって達成される。顕微鏡のセットアップとサンプルは、Lの成功を支配する2変数ですIVEの細胞イメージング。高品質目標、フィルタ（〜98％透過）、及びカメラ（裏面入射型電子乗算し、相補型金属酸化膜半導体）の発光側の一つは、励起側の試料に当たる光の量を低減することを可能にする。これはよく（GFP画像に使用される）、青色光が細胞に毒性が高いことが知られている。一つは、与えられたサンプルが許容して、実験期間中に沿って、その合計時間を広げることができますどのくらいの全光（総露光時間）を決定しなければならない。サンプルは、特定の顕微鏡のセットアップに基づいて、500のレーザー光のエクスポージャーを許容できる場合は、そのうちの1つの値が50×10スライススタックを収集することができます。これらのスタックは、2〜3の細胞周期を収集するために、単一のNB細胞周期、または2〜3分を収集するために1分まで間隔をあけてもよい。さらに、各遺伝子型の設定を最適化することに成功し、ライブイメージングのために重要である。最適化の期間中に、488nmのレーザパワーのための良い出発点は、100X、1.4のNA＆から発せられる25〜50μWである＃160;油浸対物レンズ。最後に、一つは、それが常に最も洗練された画像が必要な場合ではないように撮影条件を適切に、手元に質問に答えるもの定める必要があります。
ライブまたは固定のいずれかの組織を用いた実験では、脳は、画像の特定のNB系統に関してように取り付けてもよい。 図3Eに示すように、例えば、ステレオタイプ視葉7の後、中間領域に存在する画像タイプII、NBSするためには、人は、脳をマウントすることになります。中央の脳のNBの空間的および時間的パターンがよく1文書化されているので、どこにでもあるか、理想的には、内因性プロモーター下で発現され、広く利用可能なトランスジェニックコンストラクトの任意の数を利用しつつ、1画像に特定のNBクラスターの様々な我々のプロトコルを使用することができます（ 表1）。それにもかかわらず、系統特異的な標識技術20アプリケーションの数に有効のまま。固定分析で、軽微な損傷と脳は、一般的に許容される。また、末梢組織の完全な除去は、単に媒体を実装する際に脳を埋め込む前まで延期することができる。固定した組織を用いた研究は、多数のNBが画像化されなければならない場合に特に有用である。
結論として、NB ACDの研究では、大幅に生細胞イメージングおよび詳細な固定分析の両方を使用することから恩恵を受けています。ここで概説したプロトコルは、ライブまたは固定のどちらかのアプリケーションのためのショウジョウバエの幼虫を準備するための一つのアプローチについて詳しく説明します。我々は詳細なイメージング研究、開発および疾患における幹細胞の我々の理解を進める新規かつ刺激的な結果を明らかにしますを通じてNB ACDの継続的な調査を期待しています。無傷の幼虫の脳の長期的ライブイメージングの適用は、時間発展を支配分化と形態形成の一連のイベント（とデゲンに新たな洞察を明らかにする可能性を秘めている中枢神経系のeration）。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、DALに授与健康/ NHLBI（1ZIAHL006126）とランファン医学博士フェローシップの国立研究所の学内研究の一部門によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
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