Live avbildning av Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51756

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Dorothy A. Lerit¹, Karen M. Plevock¹, Nasser M. Rusan¹

¹National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Summary

Detta protokoll detaljer en strömlinjeformad metod som används för att utföra levande cell imaging i samband med en intakt larver hjärna. Levande cell imaging metoder är ovärderlig för studier av asymmetriska neurala stamcells divisioner samt andra neurogena och utvecklingsprocesser, konsekvent avslöja mekanismer som tidigare förbisetts.

Abstract

Stamceller delar asymmetriskt för att generera två avkomma celler med olika öde potential: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. Med tanke på deras betydelse för utveckling och sjukdom, att förstå de mekanismer som styr asymmetriska stamcells division har en robust område av studien. Eftersom de är genetiskt lätthanterlig och genomgår successiva celldelning ungefär en gång i timmen, stamcellerna i Drosophila centrala nervsystemet, eller neuroblaster, är oumbärliga modeller för studier av stamceller division. Om 100 neurala stamceller är placerade nära ytan av vardera av de två larvhjärnlober, vilket gör detta modellsystem särskilt användbara för levande avbildning mikroskopiska studier. I detta arbete, granskar vi flera metoder som ofta används för att visualisera stamcells divisioner, och vi itu med de relativa fördelarna och nackdelarna med de tekniker som anställer dissocieras kontra intakta hjärnvävnader. Vi också detalj vår simplifIED protokoll som används för att explantera hela hjärnor från tredje stadiet larver för levande cell imaging och fasta applikationer analys.

Introduction

Stamceller upprätthålla en balans av differentiering och självförnyelse för att generera cellulära mångfald under tidig utveckling och ersätta skadade celler i vuxna vävnader. Reglering av denna homeostas bygger både förlust och överexpansion av stamceller befolkningen, vilket kan leda till skadlig vävnadsdegeneration eller tumörbildning.

Neuroblaster (NBS) är de i stor utsträckning studerats neurala stamceller av Drosophila centrala nervsystemet (Figur 1A) som första formen under embryonala stadier ^{1, 2.} NBs genomgå upprepade omgångar av asymmetrisk celldelning (ACD) för att producera två ojämnt ödesbestämda celler: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. ACD styrs av centrosomes, icke-membranorganeller som fungerar som de mikrotubuli-organiseringscentrum flesta celler ^3. Under mitos, NB centrosomes organisera och orientera den bipolära mitotiska spindeln längs apikal-basala polartetsaxeln. Vid klyvning av dela NB, apikala öde bestämningsfaktorer som anger stamceller öde, och basala öde bestämningsfaktorer som anger differentiering, är uppdelade i de ojämlika dottercellerna.

I larver centrala hjärnan, kan två typer av NBs särskiljas genom sitt antal, placering, transkriptionsfaktor uttryck, och cellinje (Figur 1A) ^4-6. Typ I NBs är de mest förekommande och cirka 90 av dem befolka de främre och bakre sidorna av varje optik loben av hjärnan ^7. Dessa NBs uttrycker transkriptionsfaktor aSENSE (ASE), och de karakteristiskt dela in i en självförnyande NB och en mindre ganglion modercellen (GMC, Figur 1B). Varje GMC genomgår en enda terminal division för att generera två nervceller eller glia (Figur 1B). Däremot har de åtta typ II NBs som befolkar den bakre sidan av varje optisk lob saknar Ase uttryck ^5. De genomgår ACDatt tillverka en själv förnya NB och en mellanliggande neurala progenitorceller (INP).

Den INP i sin tur delar asymmetriskt tre till fem gånger. Var och en av dessa divisioner leder till regenerering av INP och produktionen av ett enda GMC ^4. Kollektivt ger de specifika NB identitet och den tidsmässiga ordningen GMC födelse upphov till den häpnadsväckande neuronal mångfald av den vuxna centrala nervsystemet.

Förstå cellbiologi som ligger bakom NB ACD har kraftigt förbättrats genom användning av levande cellavbildningstekniker. Publicerade protokoll som används av forskare till bild levande NBs varierar kraftigt. Totalt sett är dock dessa metoder kan delas in i två allmänna kategorier kännetecknas av huruvida larv hjärnan lämnas intakt eller mekaniskt dissocierade. Båda teknikerna har olika fördelar och nackdelar beroende på forskarens ansökan.

Tidiga rapporter avslöjar levande NB celler diviserna inbegriper en viss grad av manuell dissociation av larv hjärnan. Dessa protokoll detalj smetar ⁸ eller retas isär ⁹ hjärnan för att växa kortsiktiga primära kulturer av NBS på täckglas. För att förbättra avbildning, är de runda NBs vanligen tillplattad på täckglas med antingen glasskivor ⁸ eller agaros kuddar ^9. Även om tillplattade celler har förbättrad optik, är dessa tekniker ofta leda till NB mitotiska defekter, inklusive regression av klyvnings fåra och oförmågan att fördela mer än en gång. Därför är protokoll som innebär både manuell dissociation och fysisk snedvridning av larver hjärnvävnad i allmänhet endast lämpar sig för mycket kortfristiga (dvs., En cellcykel eller mindre) tillämpningar. Likaså semi-squash eller helt plattas intakta hjärnor mellan objektglas och täck begränsar den tid man kan spendera avbildning ett givet exemplar till en ca 30 min period ^10. Trots denna begränsning, this tillvägagångssätt har använts med framgång ^11-14.

Nya insatser för bild levande dissocierade NBs gräns fysisk snedvridning av de isolerade cellerna. Dessa tekniker är särskilt användbara för applikationer där det är nödvändigt för att upprätthålla cellkulturer för flera celldelningscykler. Exempelvis kan dispergerade celler från manuellt dissocierade hjärnor vara delvis inbäddade i en propp framställd av en blandning av fibrinogen och trombin ¹⁵ för långvarig avbildning ^16. Alternativt kan explanterade hjärnor vara första kemiskt dissocierade med enzymet kollagenas, nästa manuellt sönder genom upprepad passage genom en pipettspets och därefter ströks ut på poly-L-lysin-belagda glas botten rätter ^{17, 18.} Beläggning glas rätter med antingen fibrinogen eller poly-L-lysin främjar kvarstad och liten spridning av runda celler, föra dem så nära täckglaset som möjligt utan stora fysiska distorsion. I additiom dessa metoder innebär odling NBS i medium som lätt kan bytas ut mot farmakologiska störningsförsök ^18. Sammantaget direkt plätering spridda NBs förbättrar avbildningsoptik utan att offra långsiktiga bildhanteringsfunktioner. Nyligen har ett protokoll som beskriver den långsiktiga odling av dissocierade NBs blivit närmare ^19.

Emellertid är detta tillvägagångssätt inte utan begränsningar. Det finns flera varningar för avbildning levande dissocierade NBs. I ett fält av spridda celler, till exempel, är det svårt att identifiera specifika NB härstamningar som rumsligt är organiserade i den intakta hjärnan ^1. Likaså skilja typ I kontra typ II NBs inom dissocierade vävnaden är också en utmaning utan ett uttryck för härstamning spårämnen eller subtyp-specifika transgener, såsom worniu-GAL4, aSENSE-GAL80 ^20. Även om dessa transgener är ganska bra för vissa tillämpningar, de begränsar forskare till dem transgener expressas under kontroll av UAS förstärkarelement ²¹ och kräver mer komplexa genetiska system. Studier som rör rumslig eller tidsmässig utveckling av NBs därför kräva in vivo imaging i samband med en intakt vävnad.

Vidare studier av dissocierade embryonala NBs indikera att den fysiska kontakten mellan angränsande celler är kritisk för interfas lokalisering av nyckel polaritet faktorer ^{22, 23.} Dessa studier visar helt isolerade NBs upprätthålla inte längre den invarianta mitotiska spindelaxeln. Istället visar dessa celler en mer randomiserade spindelaxeln och breda vinklar av separation mellan successiva GMC knoppar, kanske på grund av förlusten av apikala centro placering ^22. Även förhållandet mellan larv NBs och deras angränsande celler inte har studerats, är det värt att överväga att larvstamcellsmikromiljö kan träffa cellpolaritet eller annanbeteenden. För att bibehålla den fysiologiska sammanhang larver NBs, vi bild ACD från hela hjärnor.

Med tanke på de begränsningar i samband med bildbehandling dissocierade NBs, har vårt labb och andra etablerade protokoll för bild successiva NB ACD från hela larver hjärnor. Teknik för bild intakta hjärnor ersätta ofta den stela ytan av glaset på ena sidan av odlingskammare med ett flexibelt membran för att förhindra vävnad distorsion eller skada och medger gasutbyte. Vissa metoder innefattar montering explanterade hjärnor i en blandning av insektsodlingsmedium, serum och askorbinsyra med fett kroppar som isolerats från tio larver ^24. De isolerade fett organ läggs till, eftersom de utsöndrar en mitogen känd för att stimulera NB celldelning ^25. Detta protokoll bevarar integriteten av vävnaden i över 3 timmar och är därför mottaglig för långsiktig avbildning ^{24, 26-28.} Nyligen, ett protokoll som beskriver long sikt avbildning av intakta larv hjärnor i närvaro av askorbinsyra, serum och fett organ har närmare ^29. Viktigt, eftersom vävnaden är varken utsatt eller immobiliserade, är detta tillvägagångssätt är mindre användbart för applikationer där odlingsmediet är utbytta (t.ex. läkemedelsstudier, immunotömning osv.).

Vårt labb har förenklat hela berget beredningen av levande larver hjärnor för långsiktig avbildning ^{30, 31.} Den största fördelen med våra protokoll över andra är dess enkelhet: våra observationer indikerar varken serum, askorbinsyra, insulin, eller fett organ är nödvändiga tillsatser till bild successiva rundor av NB ACD. Även tillsatser, såsom insulin, har varit till nytta för långvarig avbildning av stamceller divisioner ³² och kollektiv cell migration i Drosophila äggstockarna ^33, de verkar vara umbärliga för NB ACD, som vår bildalstringsmedium består av en enkel blandning av standard insektscellodlingsmedium kompletterat med antibiotisk-antimykotisk att förhindra förorening. Genom att använda återanvändningsbara gas-permeabla eller glas botten kultur rätter, har vi kunnat upprätthålla flera omgångar av varandra NB ACDs. Samma explanterade prov kan lätt användas för immunofluorescens och andra förfaranden med fast vävnad. I detta protokoll, vi detalj dissektion av intakta larv hjärnor, liksom beredningen av hjärnor för både live och fast analys.

Protocol

1. Beredning av Material som behövs till explantation Tredje Instar Larvernas hjärnor

1. Förbered verktyg som krävs för microdissection.
   1. Forge två dissekera verktyg (en skalpell och en krok) genom att först placera ett enda dissekera stift i varje stift hållaren. Säkra stiften tätt för hand eller med en tång (Figur 1C).
   2. Använd ett par gamla tång för att böja en dissekera stift till en cirka 120 ° vinkel. Gör detta under ett dissektionsmikroskop för att se till att den övre halvan av stiftet blir plant när stifthållaren hålls i handen. Detta verktyg kommer att användas som en skalpell för att hålla ned eller skära genom vävnaden.
   3. Använd ett par gamla pincett för att böja det andra stiftet i en krok som kommer att användas för att hålla och skrapa bort vävnad.
   4. Täck varje dissekera verktyg med en pipett för att skydda verktygen från skador. Med omsorg, kan välformade verktyg användas för dissektion på obestämd tid. Byt ut skadade eller deformerade stift efter behov.
   </ Li>
2. Förbered dissekera medium.
   1. I en vävnadskultur huva, späd antibiotika-antimykotika komplement till Schneiders odlingsmediet. Snurra media att införliva tillägget.
   2. Förbered flera 5 ml alikvoter av de kompletterade media. Förvara alla medier vid 4 ° C tills produkten ska användas.
   3. Värm en 5 ml alikvot av kompletterat medium till rumstemperatur. Draw mediet i en steril 5 ml spruta och skruva på en steril 0,2 | im sprutfilter.
3. Välj larver för dissekering. Använd en dissekera sond för att välja krypa tredje stadiets larver som hjärnan blir lättast att dissekera. Tillval: inlånings larver på en druva agarplatta.
   OBS: Använd inte alltför trångt ampuller eller flaskor med "våt mat," eftersom dessa tenderar att tvinga andra eller första stadiet larver att krypa ut i förtid.
   Notera: Vissa genetiska bakgrunder kommer att kräva hjälp av yngre larver. Detta påverkar inte protokollet, men gör det dissection svårare.

2. Dissekering av det centrala nervsystemet

1. På en enda glasskiva, skapa två 50 ml pooler av varma dissekera media separerade med ca 3 cm. En pool kommer att användas för grov dissekering och andra används för fina dissektion (Figur 1C).
2. Överför flera larver till ett av media droppar.
3. Flytta täckglas med larver till en dissekera mikroskop. Zoom i poolen innehållande larverna, så att de främre och bakre ändarna av larver är skönjbar.
4. Använd ett par av pincett för att ta tag i mittområdet av en enda larv. Ta en andra pincett i den andra handen och gripa larven nära samma region. Dra de två par pincett isär för att försiktigt riva larven på mitten. Upprepa ovanstående två steg för alla larver på täckglas.
5. Kassera de bakre halvorna av larvkroppen genom att överföra dem till en vävnad.
6. Zooma in en larv så att the främre mouthhooks syns tydligt. Använd båda paren av pincett för att skapa ett litet snitt eller skåra, på motsatta sidor av larv mouthhooks mellan den tredje bröstkorg och första anterior LITEN TAND band.
7. Ta tag i mouthhooks med pincetten i den icke-dominanta handen. Använd pincett i den andra handen för att försiktigt skala bort nagelband i en anterior-till-posterior riktning. Fortsätt att sakta skala bort nagelband tills det centrala nervsystemet exponeras.
8. Isolera det centrala nervsystemet från resten av larven genom rivning vävnader med pincett. Iakttag försiktighet för att inte störa det centrala nervsystemet.
   Kritiska steg: Inte ryck på det centrala nervsystemet! Släng skadade prover med en sönderriven ventrala nerv sladd (Figur 2A) eller förvrängda optiska lober (figur 2B och 2B).
9. Upprepa ovanstående två steg för alla larver på täckglas. Överför friska explanterade vävnaden tillandra (ren) pool av medium på täckglas för den fina dissektion skede.
10. Använd dissekera stift verktyg för att rensa bort de perifera vävnader (t.ex. ögon, vingar och ben skivor) från hjärnan. Skjut skalpell mellan den önskade (hjärnan) och den oönskade vävnaden, sätter den bindväv till coverglass. Använd kroken för att försiktigt retas bort den oönskade vävnaden samtidigt som du trycker skalpellen till täckglas i såg-liknande rörelser.
11. Kritiska steg: Arbeta långsamt och medvetet för att ta bort alla skivor från varje hjärna. Var försiktig att inte störa hjärnans morfologi. En frisk hjärna kommer att ha en intakt ventrala nerv sladd och symmetriska, runda optiska lober (figur 2C).

3. Montering explanterade hjärnor för Live avbildning

1. Vänd en 50 mm gasgenomtränglig odlingsskål med den klara filmen uppåt (figur 2D). Tryck sprutan att sätta in en liten droppe (ca 30 l) av medium på than centrum av skålen.
2. Överför de isolerade hjärnorna, ett i taget, till droppen av medium på skålen. Använd kroken verktyg för att ösa upp en hjärna under de optiska lober. Alternativt kan du använda pincett för att förstå axoner som skjuter ut från den ventrala nerv sladd.
3. Samla 5-10 hjärnor i droppe mediet. Sänk hjärnorna genom att använda dissekera stiftverktyg för att driva enskilda hjärnor till botten av droppen av medium såsom många av dem kommer att fastna vid menisken (Figur 2E).
4. Orientera hjärnor med hjälp av dissekera stift verktyg för att anpassa hjärnor beroende på NBS att avbildas (Figur 3A). Till bilden ryggens NBs, placera den ventrala nerv sladd nedåt (längs membranet). För att bilden av anterio-ventrala NBs placerar hjärnorna med den ventrala nerv sladd uppåt (bort från membranet). Rikta hjärnorna sådan att alla de ventrala nerv korder peka i samma riktning i xy-planet.
5. Använd en spruta eller plast överförings pipette att placera 4 Halocarbon (HC) oljedroppar (ca 30 l vardera) på gasen membran. Volymen av varje droppe olja bör motsvara varandra och till droppen av medium. Space droppar olja att motsvara de fyra hörnen av ett täckglas centrerad kring droppe odlingsmedium. När du är klar, kommer de fem droppar (fyra droppar olja och en droppe av medium i mitten) liknar de fem fasetter på västerländsk tärning (Figur 3B).
6. Sänk en # 1,5 22 mm täckglas på montering, så att den träffar alla 5 droppar samtidigt. Att upprätthålla ett jämnt tryck tvärs över proverna minskar sannolikheten att de kommer att störas. Vänta ungefär 3 minuter såsom olje-och medel dispergera under tyngden av täckglas. En cross-liknande form av media bildar (figur 3C och 3D).
7. Kritiska steg: Sänk täckglas på ytan av hjärnan genom att ta bort en del av materialet med hjälp av en mjukpappers veke (Figure 3C). Gör detta medan du tittar på prov under dissekera omfattning. Eftersom media tas bort, kommer täck lägre. Stanna när täck berör hjärnan. Inte över-veke eftersom detta kommer att orsaka vävnads förvrängning eller hjärn explosioner.
8. Om avbildning rygg NBs (figur 3E), gå till steg 3,9. Om avbildnings anterio-ventral NBs måste täckglaset skall flyttas något (genom att försiktigt knuffar det med pincett) i riktningen för de ventrala nerv sladd tips. Detta orsakar hjärnan för att rotera, vilket medför hjärnlober i direkt kontakt med täckglas för att underlätta avbildning (Figur 3F).
9. Försegla kammaren genom omslutande täckglas med små mängder av Halocarbon olja (figur 3D). Överflödig olja sipprar från täckglaset bör minimeras och blottades bort med en vävnad.

4. Live avbildning av Central Brain neuroblaster

OBS: För detta arbete, en Nikon Eclipse Ti spinning-diskkonfokalmikroskop (inverterat mikroskop) användes för live-avbildning; information om vår inställning har tidigare publicerats ^31. Alternativt kan provet avbildas med en upprätt-systemet.

1. Tillsätt en droppe immersionsolja på täckglas precis ovanför de monterade hjärnor. Detta kommer att bidra till centrera mål direkt ovanför provet.
2. Kritiska steg: Behåll hjärnor vid en konstant temperatur på 25 ° C med en scen inkubator. Placera försiktigt den monterade provet i scenen inkubatorn och täcker kammaren med locket.
3. Leta centrala hjärn NBs genomfallande ljus genom att fokusera på de stora, runda celler som finns i de centrala och mediala områden i de optiska loberna, använd inte epi-fluorescens. Det blir lättare med praktiken. Det är mycket viktigt för att exponera provet till den minsta mängden av ljus som möjligt. Slösa inte tid imaging hjärnor som är skadade.
4. Väl på plats, ta snabba exponeringar använder konfokala tillbestämma lämplig plats och djup. Begränsa djup till den första 10-15 um. Justera efter behov, och ta en annan testbild.
   1. Valfritt steg: Samla ett test film av den ventrala nerv sladd för att se till att det inte finns någon xy drift. Om drift upptäcks, vänta 15-30 minuter för provet att lösa. Om driften inte bosätta sig i 30 min, förbereda ett nytt prov. Större drift kan oftast spåras tillbaka till tillägg av överflödig olja, eller olika storlek på oljedroppar under montering.
5. För att eliminera axiell drift (z-drift) använda en kontinuerlig automatisk fokusering enhet som använder en infraröd lysdiod. Alternativt, korrigera fokalplanet manuellt.
6. När en NB av intresse identifieras, fortsätt med bildbehandling regim. Som med alla levande cell imaging, mängden laserljus, exponeringstid, kamera binning, objektivförstoring, tid och / eller z-steg intervallet måste alla vara empiriskt optimeras för ett visst experiment för att svara på frågan till hands. Målet är att minimera ljus dammenålder samtidigt samla användbara data. Se diskussionen för ytterligare vägledning.
   1. Bild hela volymen av NB genom att samla 12-14 bilder fördelade med 1 mikrometer i z-axeln. Justera tidsupplösning för att fånga en eller flera cellcykler samma NB. Som en allmän riktlinje, använd 10-30 sek intervaller för enkelcellcykeln avbildning och 1-3 min intervall för flera cellcykler.
7. Kritiska steg: Kontrollera att provet är frisk genom att övervaka hur länge mitos. Om mitos tar mer än 15 minuter, gå vidare till en annan hjärna. En frisk hjärna kommer att visa många NBs inom samma synfält som genomgår flera omgångar av mitos. Observera att varje cellcykeln är något längre än den tidigare en på grund av ljusskada.
8. När avbildning är klar, plocka isär inkubationskammaren, och kasta allt utom gas genomsläppodlingsrätter. Skölj odlingsskålen ytan med 95% etanol och torka väl med en vävnad. Upprepa ytterligare två gånger.

   5. Beredning av hjärnor för immunofluorescens

   1. Samla 20 eller mer explanterade hjärnor i ett 1,5 ml rör innehållande ca 0,2 ml av kompletterat medium.
   2. Avlägsna mediet från röret och skölj hjärnor en gång med 0,5 ml PBSTx (fosfatbuffrad saltlösning, PBS med 0,3% Triton X-100). Låt hjärnor sjunka till botten av röret mellan alla utbyten av vätska. Det Triton X-100 detergent används för att permeabilisera vävnaden. Sköljning vanligtvis tar mindre än 30 sek; helt enkelt ta bort PBSTx gång hjärnor har sjunkit till botten av röret.
   3. Ersätt lösningen med 0,5 ml av en 9% elektronmikroskopi grade paraformaldehyd utspädd i PBSTx. Inkubera med nickning under 15 minuter vid rumstemperatur.
   4. Släng fixativ enligt föreskrifter farligt avfall.
   5. Tvätta proven med 0,5 ml PBSTx i 15 min. Upprepa tvättsteg med färsk PBSTx två gånger till.
   6. Ersätt lösningen med 0,5 ml PBT (PBS, 1% Bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% Tween-20). Inkubera med nickning under 1 timme vid rumstemperatur. Detta steg blockerar icke-specifik bindning av antikroppen till vävnaden.
   7. Ersätt lösningen med 0,5 ml primär antikropp utspädd i PBT kompletterat med 4% normalt getserum (NGS). Inkubera med nickning över natten vid 4 ° C.
   8. Kasta eller spara den utspädda primära antikroppen.
   9. Tvätta proven med 0,5 ml PBT i 15 min. Upprepa tvättsteg med färskt PBT två gånger till.
   10. Ersätt lösningen med 0,5 ml modifierat PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 och 4% NGS). Inkubera med nickning under 1 timme vid rumstemperatur.
   11. Byt ut lösningen med 0,5 ml sekundär antikropp utspädd i modifierad PBT. Inkubera med nickning under 2 h vid rumstemperatur.
   12. Ersätt lösningen med 0,5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween-20). Inkubera med nickning under 15 minuter vid rumstemperatur. Upprepa tvättsteg med färsk PBST två gånger till.
   1. Försiktigt överföra proverna som en droppe på en glasskiva, begränsa nedgången till vänster om mitten av bilden.
   2. Lägg till en stor droppe (cirka 2 cm i diameter) av monteringsmedium (exempelvis Aqua-Poly/Mount) till mitten av objektglaset. Undvik den pool av PBST som är åt vänster.
   3. Använd pincett för att överföra hjärnor från poolen av PBST till poolen för monteringsmedel. Lägga monteringsmedium direkt ovanpå hjärnorna kan störa deras orientering och bör undvikas.
   4. Under ett ljusmikroskop, ordna proverna i monteringsmedium med den sida som kommer att avbildas vänd uppåt.
   5. Med sliden under ljusmikroskop, långsamt sänka en # 1,5 täckglas ovanpå proverna. Valfritt steg: få bort små luftbubblor genom att lätt trycka på täckglas.
   6. Låt monteringsmedel för att polymerisera under flera timmar, eller över natten, genom att ligga slides platt, lätt-skyddade, vid rumstemperatur.
   7. Objektglasen kan avbildas nästa dag, eller lagras före avbildning.

Representative Results

Live avbildning har belyst ett antal mekanismer som reglerar NB ACD. Före bild förvärv, är det nödvändigt att bestämma de optimala avbildningsförhållanden. Det är nödvändigt att balansera ram fånga takt med längden på levande cell imaging. För fina cellulär analys, till exempel ökad tids och optisk upplösning kan krävas. När visualisera ett enda NB cellcykeln (Figur 4A), kan den takt som bilderna tas ökas utan att införa fotoskador. Vanligtvis kan enstaka celldelningshändelser övervakas på ca 10-30 sek tidsintervall. Ett sätt att öka den temporala upplösningen utan att skada vävnad är att modulera bilden förvärvet hastigheten. Exempelvis kan tidsförlopp avbildning inledas med en lägre bildhastighet, som sedan ökas vid observation av en intressant funktion eller tidpunkt (film 1).

Imaging successiva omgångar av celldelning ( (Figur 4B). Vi typiskt bild flera (två eller flera) rundor av ACD genom hela NB cellvolym vid 1-3 min intervall över en period av 2-3 timmar. Både tidsupplösning och bildinhämtningsperioden kan förbättras genom att begränsa den mängd ljus som träffar provet. Exempelvis kan tidsförlopp avbildning av successiva NB divisioner förlängas över 8 timmar om bara en enda optisk plan avbildas. Ett urval av särskilt användbara transgena linjer för studiet av NB ACD listas (Tabell 1) ^{16, 31, 34-38.}

För analys av ett stort antal prover, är det ofta nödvändigt att analysera fasta NBs. Vår fixering protokoll bevarar den totala morfologi NBS och är kompatibel med immunofluorescens analyser (figur 4C-4E). Hela montera fast brains kan avbildas vid låg förstoring (Figur 4C) för att visualisera den övergripande hjärnans storlek och form eller för att upptäcka NBs. Att visualisera NBs eller deras avkomma GMC i mer detalj, måste högre förstoring användas. Vid måttlig förstoring (Figur 4D), kan hela NB härstamning kluster observeras. För detaljerad cellulär analys, är högre förstoring används (Figur 4E).

Figur 1. Explantera hela hjärnor för levande cell imaging av NB ACD. A) Den larver centrala nervsystemet består av två optiska lober och en ventral nerven sladden. Två undertyper av NBs befolka den optiska loben i stereotypa positioner:. Typ I (mörkblå) och typ II (ljusblå) B) NBs genomgår ACD. Med varje celldelning, denNB klyver att ge upphov till en GMC (eller INP, ej visad) och återskapar den stamcells NB. GMC kommer att dela sig för att ge upphov till två neuroner (eller glia, ej visad). C) Två microdissection verktygen monteras genom införing dissekera stift i stifthållarna. Bock stiften skapar unika verktyg, en skalpell och en krok, som används för att avskilja, tränga igenom, och tränga undan oönskad vävnad utan att skada det underliggande hjärnan. D) Hjärnor är uttagna till en av två pooler av dissekera media (blå cirklar). En pool av medium används för att avlägsna det centrala nervsystemet från larver (grov dissektion), och den andra poolen används för fina mikrodissektion av perifera vävnader från de explanterade hjärnor (fina dissektion).

Figur 2. Preservation av hjärn morfologi under microdissection. Hasty hjärnan dissektion kan orsaka svår vävnadsskada som omfattar (A) rivna ventrala nerv sladdar eller (B) förvridna optiska lober. Ännu mer subtila vävnadsskada (B ') bör undvikas för levande cell imaging. (C) Ett exempel på en frisk vävnad prov lämpligt för live-avbildning. D) En optiskt klar, gas membran. E) En samling av flera friska hjärnor arrangerade i odling av medium på ett gaspermeabelt maträtt. Dessa hjärnor är klar att monteras för mikroskopi. Scale bar: (AC), 100 ^ m; (D), 25 mm; (E) 1 mm.

Figur 3. Montage hjärnor för levande cell imaging. A) Brains är inriktade i rader i en droppe av odlingsmediet avsattes i centrum av skålen. B) droppe av mediet är omgiven av droppar av HC olja av ungefär lika volym. De fyra droppar HC olja och den centrala droppe medel likna de fem aspekter av att spela tärning. Efter ett täck sänks ned på de droppar av olja, (C) en veke fashioned av KimWipe vävnad och används för att sop upp överflödig vätska. D) Den yttre kanten av täckglas är omgivet av ett tunt skikt av olja för att stoppa evaporering av odlingsmediet. Dessa hjärnor är nu redo för mikroskopi. E och F) Orienteringen av hjärnan i förhållande till täck avgör vilka neuroblaster är åtkomliga för levande cell imaging. E) ryggfenan neuroblaster avbildas genom att arrangera hjärnorna med den ventrala sidan vidröra gaspermeabla membranet . F) Anterior-ventrala neuroblaster kan avbildas av arranging hjärnorna med ryggsidan vidröra gaspermeabla membranet och därefter puffa på täckglas, och den underliggande vävnaden, i riktningen för de ventrala nerv sladd tips. Denna rörelse lutar något de optiska loberna så att anterio-dorsala yta i kontakt med täckglas, föra de önskade avbildningsaxeln i perfekt anpassning (grön linje).

Figur 4. Representativa resultat från levande avbildning av delande neuroblaster. A och B) Live avbildning av NB stamcells divisioner i hela montera preparat med en 40X, 1,3 NA oljeimmersionsobjektiv. Tiden visas som min: s förhållande till början av tidsförlopp A) Stillbilder från tidsförlopp avbildning av ett enda cellcykeln från en NB uttrycker GFP-Moesin.(GFP-Moe). Bilden förvärvstakten av en enda cellcykeln kan ökas för att öka tidsupplösning utan att inducera fotoskador. B) Stillbilder från time-lapse avbildning av successiva celldelningscykler från en NB som uttrycker både GFP-Moe och en GFP-märkta centro markör. Den långvariga perioden i samband med flera cellcykler kräver minskad tidsupplösning för att undvika fotoskador. Observera att tiden mellan varje celldelning ökar under avbildning. CE) Konfokala projektioner av fasta stamceller från hela berget förberedelser. C)) Till bild alla NBs på båda optiska lober är 20x förstoring används. Denna analys är särskilt användbart för att undersöka den övergripande hjärnans morfologi och att kvantifiera NB nummer (ljusblå), osv. D) Majoriteten av NBs (rosa) från en enda spegel lob kan visualiseras med 40X förstoring. Mikrotubuli, (grön). E)

Film 1. Live avbildning av en enda NB cellcykeln. Time-lapse bilder av en enda NB celldelning från en hjärna som uttrycker GFP-Moe att märka cell cortex. Bilder förvärvades från en enda optisk plan vid 40X förstoring. I den här filmen, var bildrutor fångades var 15 sek. Efter ca 7 min av förvärv, var hastigheten ökas till en bild var 5 sek. Klicka här för att se filmen.

Movie 2. Live avbildning successiva rundor of NB ACD. Time-lapse bilder av en NB genomgår tre rundor av celldelning i en hjärna som uttrycker GFP-Moe och en GFP-märkta centro markör. Bilder förvärvades vid 2 min tidsintervall på 60X förstoring. Klicka här för att se filmen.

Linje	Märkt cellstruktur	Fluorofor	Expression / Promoter	Citation
YFP-Asterless	Centriole	YFP	Ubiquitin	Rebollo et al. (2007) Dev. Cell 12:. 467.
SAS6-mCherry	Centriole	mCherry	Endogent	Rusan och Peifer (2007) J. Cell Biol. 177
GFP-SAS6	Centriole	GFP	Endogen (BAC)	Lerit och Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-PACT	Centriole	GFP	Ubiquitin	Martinez-Campos et al. J. Cell Biol 165:. 673.
GFP-SAS4	Centro	GFP	Ubiquitin	Dix och Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
GFP-Polo	Centro	GFP	Endogent	. Moutinho-Santos et al (1999) Biol Cell 91:. 585.
GFP-γ-tubulin 23C	Centro	GFP	Ubiquitin	Lerit och Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-Centrosomin	Centro	GFP	UAS	Megraw, et al. (2002) J. Cell Sci 115:. 4707.
GFP-SPD-2	Centro	GFP	Ubiquitin	Dix och Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
mCherry-α-tubulin	Microtubules	mCherry	Ubiquitin	Rusan och Peifer (2007) J. Cell Biol 177:. 13.
GFP-α-tubulin	Microtubules	GFP	Ubiquitin	. Rebollo et al (2004) PLoS Biol 2:. E8.
Jupiter-GFP ("G147")	Microtubules	GFP	Endogent	Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-Jupiter	Mikrotubuluser	mCherry	UAS	Cabernard och Doe (2009) Dev. Cell 17: 134.
H2AvD-mRFP	DNA	mRFP	Endogent	Pandey et al. (2005) J. Cell Sci 118:. 733.
H2AvD-GFP	DNA	GFP	Endogent	Clarkson och Saint (1999) DNA Cell Biol 18:. 457.
Moesin-GFP	Kortikal aktin	GFP	Spaghetti squash	Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471.

Tabell 1. Ett urval av användbara transgena linjer för studiet av ACD. Dessa fusionskonstruktioner är särskilt användbara för att studera celldelning. De används rutinmässigt i NB levande imaging studier.

Discussion

Levande cell imaging är en ovärderlig metod för att studera de mekanismer som reglerar ACD av stamceller, differentiering av cellinjer, och morfogenes av komplexa vävnader. Även forskargrupper har historiskt sett används en mängd olika tekniker för att visualisera NB ACD, kan dessa metoder vara generellt delas in i två kategorier som främst skiljer sig åt med avseende på om hjärnvävnaden lämnas intakt eller dissocierade.

Imaging dissocierade NBs har sina fördelar. För en, dissocierades NBs är lättare att bilden eftersom de är särskilt lätta att identifiera som de största (ca 12 pm i diameter) celler i en odlingsskål. Dessutom kommer nästan alla stamceller som odlas på en glasyta vara lika nära till mikroskopobjektivet under hela bildförvärvperiod. Den optiska kvaliteten på tidsförlopp bilder förbättras ytterligare med användning av antingen poly-L-lysin eller fibrinogen belagda glaset för att inducera den semi-plattning av rundan NBs ^{16, 17.} En annan fördel för att avbilda dissocierade NBs odlade i kultur är den lätthet med vilken odlingsmediet kan utbytas. När celler vidhäfta till den belagda glasytan, odling medium innehållande något antal farmakologiska agonister, antagonister eller immunoblocking antikroppar etc. kan tillsättas eller avlägsnas. Slutligen har nya metoder för att visualisera dissocierade NBs visat att denna teknik är, sannerligen, bli föremål för långvarig bildtagning ^{18, 19.}

Trots nackdelarna till avbildning dissocierade NBs innefattar komplexiteten i protokollet. De flesta metoder detalj långa (30-60 min) kemisk nedbrytning, följt av en lång inkubationstid steg (60 min) för att tillåta spridda celler att bosätta sig och ansluta sig till odlingsskål ^{17, 19.}

Däremot avbildnings NBs från en intakt hjärna bevarar bådefysiologiskt sammanhang och morfologi av vävnaden. Fördelarna med detta tillvägagångssätt innefattar förmågan att identifiera specifika NB linjer som utvecklas i stereotypa arrangemang eller vid definierade utvecklings gånger ^1. Därför har vår förenklade protokoll verktyg som sträcker sig utanför studier av ACD, eftersom den gör det också möjligt för den levande utredning av differentiering och morphogenesis händelser. En nackdel med denna metod är dock, är en oförmåga att byta ut odlingsmediet. Därför måste forskarna är intresserade av långsiktig avbildning av successiva stamcells divisioner överväga tillvägagångssätt (dissocierade primär kultur kontra hela berget) som bäst passar deras tillämpning. Likaså behovet av odlings tillsatser, såsom insulin eller serum, bör bestämmas empiriskt baserad på avbildningsförhållanden (varaktighet avbildning, mängd ljus som träffar provet, osv.) Och experimentuppställning.

I allmänhet rekommenderar vi att använda avståndd NBs för studier där det är nödvändigt att bedöma akut respons NBs till införandet av små molekyler (t.ex. hämmare etc.), för hög genomströmning program när fina microdissection av hjärnor kan vara för betungande, och för avancerade imaging studier att kräva att NB att vara i fysisk kontakt med täckglas. Däremot rekommenderar vi att använda intakta hjärnor för tillämpningar där det är användbart att bilden några NBs från samma hjärnan, och särskilt för studier som berör cell-cell interaktioner, autonomi, klonal analys, cellformförändringar, och andra undersökningar där de infödda miljön av cellerna är viktig.

För att säkerställa en framgångsrik beredning av intakta hjärnor för levande avbildning, måste flera viktiga steg noggrant utförda. Främst är det absolut nödvändigt att undvika att utsätta vävnaden för onödig trauma. Specifikt explantera hjärnan och ta bort perifer vävnad bör utföras med omsorg. Onebör minimera direktkontakt mellan de dissekera verktyg och hjärnan. Dessutom bör man undvika att rycka eller dra i vävnaden fäst till hjärnan. Felhantering vävnaden kan lätt resultera i trasiga eller förvridna hjärnor. I våra händer, NBs från skadade hjärnor sällan delar. Individer som är nya larver hjärnan dissektion gynnas ofta av att bemästra dissektionen innan du försöker att förbereda prover för live-avbildning.

Ett annat viktigt steg i protokollet är monteringen av hjärnan före levande cell imaging. Den korrekta volymer av både odlingsmediet och HC olja är viktigt att slutföra en god förberedelse. Även om det är svårt att exakt mäta den viskösa HC olja med en pipett, kan en ungefärlig korrekt volym (omkring 30 | al) genom ögat. För mycket vätska förhindrar täckglas från att landa på plats. Ofta resulterar detta i hjärnorna rör sig på ytan av odlingsskål. Under live-avbildning, är ett oroligt täck evibuckla när vävnads drivor eller den optiska lober rullen. Prov som inte är positionerade på plats bör undvikas. Tvärtom, att lägga för lite odlingsmedium eller HC olja leder till katastrofala vävnadsskada, inklusive brast optiska lober. Det finns en noggrann avvägning mellan att använda tillräckligt flytande medium och olja för att hantera vikten av täckglas kontra använder för mycket vätska, vilket gör att täck att glida. Denna balans är bäst lärt sig genom praktik. I allmänhet är det bäst att bara bilden de hjärnor som har en sund morfologi, till exempel en intakt ventrala nerv sladd och symmetriska, runda optiska lober.

När provet monteras utan detekterbar drift, hålla provet vid liv blir nästa kritiska aspekten av detta protokoll. Detta uppnås bäst genom att upprätthålla rätt temperatur och, viktigast av allt, minimera den mängd ljus som träffar provet. Mikroskopet inställning och urval är två variabler som styr framgången för live cell imaging. Hög kvalitetsmål, filter (~ 98% överföring) och kameror (back-tunnat elektron multiplicera och Complementary Metal-Oxide Semiconductor) på sidan utsläpp kommer att tillåta en att minska mängden ljus som träffar provet på exciteringssidan. Det är väl känt att blått ljus (som används för att avbilda GFP) är mycket giftiga för cellerna. Man måste bestämma hur mycket total ljus (total exponeringstider) ett visst prov kan tolerera och sedan sprida den totala tiden längs hela experimentet. Om till exempel ett prov endast kan tolerera 500 laserljusexponeringar bygger på en särskild mikroskop setup, då man kunde samla 50 x 10-slice stackar. Dessa stackar kan fördelas med 1 min för att samla in en enda NB cellcykeln, eller 2-3 minuter för att samla in ~ 3 cellcykler. Dessutom optimerar inställningar för varje genotyp är avgörande för lyckad live-avbildning. Under optimeringsperioden, är en bra utgångspunkt för 488 nm lasereffekt 25-50 iW kommer från en 100X, 1,4 NA &# 160; oljeimmersionsobjektiv. Slutligen måste man avgöra vad imaging tillstånd kommer på rätt svar på frågan till hands, eftersom det inte alltid så att de mest sofistikerade avbildning behövs.

För experiment med antingen levande eller fast vävnad, kan hjärnan vara monterade så att bildspecifika NB härstamningar. Till exempel, för att bilden av typ II NBs som stereotypt uppehåller sig i den bakre-mediala region av synnerven lob ⁷ skulle en monteringstid hjärnorna, såsom illustreras i figur 3E. Eftersom den rumsliga och tidsmässiga mönster av centrala hjärn NBs har väldokumenterade ¹ kan man använda våra protokoll till bilden en mängd specifika NB kluster samtidigt utnyttja valfritt antal av de allmänt tillgängliga transgena konstruktioner som uttrycks i allestädes närvarande eller, helst, endogena tagare (tabell 1). Ändå härstamning specifika teknologier märkning ²⁰ förblir användbara för ett antal applikationer.Med fast analys, hjärnor med mindre skador är allmänt vedertagna. Dessutom kan det fullständiga avlägsnandet av perifer vävnad skjutas upp till just före inbäddning hjärnorna i monteringsmedium. Studier med fast vävnad är speciellt användbara när ett stort antal NBs skall avbildas.

Sammanfattningsvis har studier av NB ACD stor nytta av användningen av både levande cell imaging och detaljerad fasta analys. Det protokoll som beskrivs här detaljer en strategi för att förbereda Drosophila larver för antingen levande eller fasta applikationer. Vi räknar med en fortsatt utredning av NB ACD genom detaljerade imaging studier kommer att avslöja nya och spännande resultat som kommer att öka vår förståelse av stamceller i utveckling och sjukdom. Tillämpningen av långsiktiga live-avbildning av intakta larv hjärnor har potential att upptäcka nya insikter i den temporala sekvensen av differentiering och morphogenesis händelser som styr utvecklingen (och degenbete) av centrala nervsystemet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe, 5 ml	BD Biosciences	309646
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.