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Neuroscience

Immagini dal vivo di doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Abstract

Le cellule staminali si dividono asimmetricamente per generare due cellule progenie con disparità di potenziale destino: una cellula staminale auto-rigenerante e una cellula di differenziazione. Data la loro rilevanza per lo sviluppo e la malattia, la comprensione dei meccanismi che governano la divisione delle cellule staminali asimmetrica è stata una zona robusta di studio. Perché sono geneticamente trattabili e sottoposti a cicli successivi di divisione cellulare circa una volta ogni ora, le cellule staminali del sistema nervoso centrale Drosophila, o neuroblasti, sono modelli indispensabili per lo studio di divisione delle cellule staminali. Circa 100 cellule staminali neurali sono situati vicino alla superficie di ciascuno dei due lobi cerebrali larvali, rendendo questo sistema modello particolarmente utile per studi di microscopia imaging dal vivo. In questo lavoro, passiamo in rassegna diversi approcci ampiamente utilizzati per visualizzare le divisioni di cellule staminali, e ci rivolgiamo i relativi vantaggi e gli svantaggi di queste tecniche che impiegano dissociano contro i tessuti cerebrali intatti. Abbiamo anche il nostro particolare simplifprotocollo IED utilizzato per espiantare cervelli interi da larve terzo instar per l'imaging cellulare dal vivo e applicazioni di analisi fisse.

Introduction

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Le cellule staminali mantenere un equilibrio di differenziazione e di auto-rinnovamento per generare diversità cellulare durante lo sviluppo iniziale e sostituire le cellule danneggiate nei tessuti adulti. Regolamentazione di tale omeostasi impedisce sia la perdita e eccessiva espansione della popolazione di cellule staminali, che può provocare la degenerazione dei tessuti deleterio o tumorigenesi.

Neuroblasti (NBS) sono le cellule staminali neurali ampiamente studiati del sistema Drosophila nervoso centrale (Figura 1A), che prima forma durante le fasi embrionali 1, 2. NBs sottoposti a ripetuti cicli di divisione cellulare asimmetrica (ACD) per produrre due cellule inegualmente fatidici: una cellula staminale auto-rinnovare e una cella di differenziazione. ACD è guidata dai centrosomi, gli organelli non membranose che fungono da centri di microtubuli organizzazione della maggior parte delle cellule 3. Durante la mitosi, centrosomi NB organizzano e orientano il fuso mitotico bipolare lungo la polare apicale-basaleAsse lità. Dopo la scissione della divisione NB, determinanti destino apicali che specificano il destino delle cellule staminali, e determinanti destino basali che specificano la differenziazione, sono segregati nelle cellule figlie disuguali.

Nel cervello centrale larvale, due tipi di NBs si distinguono per il loro numero, posizione, espressione del fattore di trascrizione, e la linea cellulare (Figura 1A) 4-6. Tipo I NBs sono il più abbondante, e circa 90 di essi popolano i lati anteriore e posteriore di ciascun lobo ottica del cervello 7. Questi NBs esprimono il fattore di trascrizione Asense (Ase), e tipicamente dividono in una auto-rinnovo NB e un ganglio cella più piccola madre (GMC; Figura 1B). Ogni GMC subisce una sola divisione terminale per generare due neuroni o glia (Figura 1B). Al contrario, la Banca nazionale slovacca otto di tipo II che popolano il lato posteriore di ciascun lobo ottico mancano espressione Ase 5. Subiscono ACDper produrre un NB auto-rigenerante e un progenitore neuronale intermedio (INP).

Il INP, a sua volta, divide asimmetricamente tre a cinque volte. Ciascuna di queste divisioni risultati nella rigenerazione del INP e la produzione di un singolo GMC 4. Collettivamente, l'identità specifica NB e l'ordine temporale di GMC nascita dà origine alla diversità stupefacente neuronale del sistema nervoso centrale adulto.

Capire la biologia cellulare che è alla base NB ACD è stata notevolmente migliorata attraverso l'uso di tecniche di imaging cellulare dal vivo. Protocolli pubblicati utilizzate dai ricercatori per l'immagine NBs dal vivo variano molto. Nel complesso, tuttavia, questi metodi possono essere raggruppate in due categorie generali che si distinguono per se il cervello larvale è lasciata intatta o meccanicamente dissociato. Entrambe le tecniche presentano vantaggi e svantaggi a seconda dell'applicazione del ricercatore.

I primi rapporti che rivelano in tempo reale divisione cellulare NBsioni implicano un certo grado di dissociazione manuale del cervello larvale. Questi protocolli dettaglio sbavature 8 o prendere in giro a parte 9 il cervello per crescere colture primarie a breve termine della NBs su vetrini. Per migliorare l'imaging, la Banca nazionale slovacca rotondo di solito sono appiattiti sulle coprioggetto sia con vetrini 8 o pad agarosio 9. Sebbene le cellule appiattite hanno migliorato ottica, queste tecniche spesso portano a difetti mitotici NB, compreso regressione del solco scissione e l'incapacità di dividere più di una volta. Pertanto, i protocolli che coinvolgono sia dissociazione manuale e distorsione fisica del tessuto cerebrale larvale sono generalmente adatti solo a brevissimo termine (cioè., Un ciclo di cella o meno) applicazioni. Allo stesso modo, semi-schiacciamento o appiattire completamente il cervello intatto fra vetrini e vetrini limita il tempo si può trascorrere l'imaging un dato campione, ad un periodo di circa 30 min 10. Nonostante questa limitazione, this approccio è stato utilizzato con successo 11-14.

I recenti sforzi di immagine dal vivo dissociate limite NBs distorsione fisica delle cellule isolate. Queste tecniche sono particolarmente utili per applicazioni in cui è necessario sostenere colture cellulari per più cicli di divisione cellulare. Per esempio, le cellule disperse dal cervello dissociate manualmente possono essere parzialmente incorporati in un coagulo ottenuto dalla miscela di fibrinogeno e trombina 15 per l'imaging a lungo termine 16. In alternativa, possono essere espiantati cervelli primo dissociato chimicamente con l'enzima collagenasi, accanto interrotto manualmente ripetuto passaggio attraverso una punta di pipetta, e successivamente placcato su poli-L-lisina rivestite con vetro piatti inferiori 17, 18. Rivestimento piatti di vetro o con fibrinogeno o poli-L-lisina favorisce l'attaccamento e leggero diffusione delle cellule rotonde, portando loro il più vicino al vetrino possibile senza grave distorsione fisica. In additisu, questi metodi comportano coltura NBS in mezzo che può essere facilmente scambiato per esperimenti farmacologici perturbativi 18. Nel complesso, placcatura direttamente dispersi NBs migliora l'ottica delle immagini senza sacrificare la funzionalità di imaging a lungo termine. Recentemente, un protocollo che descrive la coltura a lungo termine di dissociata NBs è stato dettagliato 19.

Tuttavia, questo approccio non è privo di limiti. Ci sono diversi avvertimenti all'imaging NBs vivo dissociate. In un campo di cellule disperse, per esempio, è difficile identificare specifici lignaggi NB che sono spazialmente organizzati nel cervello intatto 1. Allo stesso modo, distinguendo il tipo I rispetto al tipo NBs II all'interno del tessuto dissociato è anche una sfida, senza l'espressione di traccianti lignaggio o transgeni specifico sottotipo, come worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Sebbene questi transgeni sono molto utili per alcune applicazioni, che limitano ricercatori a quelli transgeni expremuto sotto il controllo dell'elemento UAS enhancer 21 e richiedono regimi genetiche più complesse. Gli studi che riguardano lo sviluppo spaziale o temporale di NBs, quindi, richiedono imaging in vivo nel contesto di un tessuto intatto.

Inoltre, studi di NBs embrionali dissociate indicano che il contatto fisico di celle adiacenti è critica per la localizzazione interfase di polarità chiave determinanti 22, 23. Questi studi mostrano completamente isolato NBs mantenere più l'asse mitotico mandrino invariante. Invece, queste cellule mostrano un più randomizzati asse mandrino e ampi angoli di separazione tra gemme successive GMC, forse a causa della perdita di posizionamento apicale centrosome 22. Anche se il rapporto tra i NBs larvali e le loro cellule vicine non è stato ampiamente studiato, vale la pena considerare che il larvale microambiente delle cellule staminali potrebbe ricadere su polarità cellulare o altrocomportamenti. Per mantenere il contesto fisiologico di larve NBs, abbiamo un'immagine ACD da cervelli interi.

Dati i limiti intrinseci associati a immagini dissociato NBs, il nostro laboratorio e altri hanno stabilito protocolli per immagine cicli successivi di NB ACD da interi cervelli larvali. Tecniche all'immagine cervello integro spesso sostituiscono la superficie rigida di vetro su un lato della camera di coltura con una membrana flessibile per evitare la distorsione del tessuto o danneggiamento e consentire lo scambio di gas. Alcuni metodi coinvolgono montaggio cervelli espiantati in una miscela di insetto mezzo di coltura, il siero, e acido ascorbico con i corpi grassi isolati da dieci larve 24. I corpi grassi isolati vengono aggiunti perché secernono un mitogeno nota per stimolare la divisione cellulare NB 25. Questo protocollo preserva l'integrità del tessuto per oltre 3 ore ed è, quindi, suscettibili di immagini a lungo termine 24, 26-28. Recentemente, un protocollo che descrive la lonImaging g-termine intatte cervelli larvali in presenza di acido ascorbico, siero, e corpi grassi è stato dettagliato 29. Importante, perché il tessuto non è né esposto né immobilizzato, questo approccio è meno utile per applicazioni in cui viene scambiato medio di coltura (per esempio, studi di droga, immunodeplezione, ecc.).

Il nostro laboratorio ha semplificato tutta la preparazione monte di cervelli larvali vivi per l'imaging a lungo termine 30, 31. Il vantaggio principale per il nostro protocollo sugli altri è la sua semplicità: le nostre osservazioni indicano né sierica, acido ascorbico, l'insulina, né corpi grassi sono additivi necessari a immagine cicli successivi di NB ACD. Sebbene additivi, come l'insulina, sono stati utili per l'imaging prolungato di divisioni cellulari staminali 32 e la migrazione delle cellule collettivo in Drosophila ovaie 33, sembrano essere indispensabili per NB ACD, come il nostro mezzo di imaging consiste in una semplice miscela di standard insetto mezzo di coltura cellulare integrato con antibiotico-antimicotico per prevenire la contaminazione. Attraverso l'uso di piatti della cultura di fondo del gas-permeabili o vetro riutilizzabili, siamo stati in grado di sostenere diverse fasi di successivi NB ACD. Gli stessi campioni espiantati facilmente utilizzabile per immunofluorescenza e altre procedure con tessuto fissato. In questo protocollo, si dettaglio la dissezione di cervelli larvali intatte, così come la preparazione di cervello per l'analisi sia vivo e fisso.

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Protocol

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1. Preparazione dei materiali necessari per espianto Brains al terzo stadio larvali

  1. Preparare gli strumenti necessari per microdissezione.
    1. Forge due strumenti di dissezione (un bisturi e un gancio) in primo luogo mettendo un unico perno dissezione in ciascun supporto del perno. Assicurare le spine saldamente a mano o con pinze (Figura 1C).
    2. Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare un pin dissezione ad un angolo di circa 120 °. Eseguire questa sotto un microscopio da dissezione per garantire che la metà superiore del perno sia piatto quando il supporto del perno è tenuto in mano. Questo strumento sarà utilizzato come un bisturi per tenere premuto o tagliare attraverso il tessuto.
    3. Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare il secondo perno in un gancio che verrà utilizzato per contenere e raschiare via il tessuto.
    4. Coprire ogni strumento di dissezione con un puntale per proteggere gli utensili da danneggiamenti. Con cura, strumenti ben formati possono essere utilizzati per la dissezione a tempo indeterminato. Sostituire i perni danneggiati o deformati, se necessario.
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  2. Preparare dissezione mezzo.
    1. In una cappa di coltura tissutale, diluire il supplemento antibiotico-antimicotico nel mezzo di coltura di Schneider. Agitare il supporto per incorporare il supplemento.
    2. Preparare diverse aliquote di 5 ml dei media integrati. Conservare tutti i mezzi a 4 ° C fino al momento dell'uso.
    3. Scaldare una aliquota 5 ml di mezzo integrato a temperatura ambiente. Disegnare il mezzo in una sterile siringa da 5 ml e avvitare un filtro 0,2 micron siringa sterile.
  3. Selezionare larve per la dissezione. Utilizzare una sonda dissezione per selezionare strisciando terzo instar larve come il cervello sarà più facile da sezionare. Optional: deposito di larve su una piastra di agar uva.
    Nota: Non usare i flaconcini eccessivamente affollati o bottiglie con "cibo umido", in quanto questi tendono a forzare seconda o prima larve instar a strisciare fuori prematuramente.
    Nota: alcuni background genetico richiederanno utilizzando larve più giovani. Questo non pregiudica il protocollo, ma non rendono il dissection più difficile.

2. Dissezione del Sistema Nervoso Centrale

  1. Su un singolo vetrino, creare due 50 ml piscine di media dissezione caldi separati da circa 3 cm. Una piscina sarà utilizzata per la dissezione lordo e l'altro utilizzato per fini dissezione (Figura 1C).
  2. Trasferire più larve di una delle gocce media.
  3. Spostare il vetrino con larve di un microscopio da dissezione. Zoom della piscina contenente le larve tale che le estremità anteriori e posteriori delle larve sono riconoscibili.
  4. Utilizzare una coppia di pinze per afferrare il mid-regione di un singolo larva. Prendere una seconda coppia di pinze nell'altra mano e afferrare la larva vicino alla stessa regione. Tirare le due coppie di pinze a parte per strappare delicatamente la larva a metà. Ripetere i due passaggi precedenti per tutte le larve sul vetrino.
  5. Smaltire le metà posteriore del corpo larvale trasferendoli ad un tessuto.
  6. Zoom in una larva in modo che esimoe mouthhooks anteriori sono chiaramente visibili. Utilizzare entrambe le coppie di pinze per creare una piccola incisione, o tacca, su lati opposti delle mouthhooks larvali tra il terzo toracica e primi gruppi denticle anteriori.
  7. Afferrare le mouthhooks con la pinza in mano non dominante. Utilizzare le pinze nell'altra mano per staccare delicatamente la cuticola in senso antero-posteriore. Continua a sbucciare lentamente cuticola finché il sistema nervoso centrale è esposto.
  8. Isolare il sistema nervoso centrale dal resto della larva strappando tessuti con le pinze. Fare attenzione a non disturbare il sistema nervoso centrale.
    Passaggio critico: Non rimorchiatore sul sistema nervoso centrale! Scartare campioni danneggiati con una corda strappata nervo ventrale (Figura 2A) o lobi distorte ottica (Figure 2B e 2B ').
  9. Ripetere i due passaggi precedenti per tutte le larve sul vetrino. Trasferire il tessuto espiantato sano allasecondo (pulito) piscina di media sul vetrino per la fase di dissezione multa.
  10. Utilizzare gli strumenti pin dissezione per eliminare i tessuti periferici (ad esempio, degli occhi, ala, e gambe dischi) dal cervello. Far scorrere il bisturi tra il voluto (cervello) e il tessuto indesiderato, appuntare il tessuto connettivo al coprioggetti. Utilizzare il gancio a stuzzicare delicatamente il tessuto indesiderato contemporaneamente premuto il bisturi per il vetrino movimenti sega-like.
  11. Passaggio fondamentale: Lavorare lentamente e deliberatamente per rimuovere tutti i dischi da ciascuna cervello. Fare attenzione a non disturbare la morfologia del cervello. Un cervello sano avrà un cordone intatto ventrale dei nervi e simmetrica, lobi ottici rotondi (Figura 2C).

3. Montaggio Brains espiantati per Live Imaging

  1. Invertire un piatto di cultura gas-permeabili 50 millimetri con la pellicola trasparente rivolta verso l'alto (Figura 2D). Premere la siringa a depositare una piccola goccia (circa 30 ml) di media su tegli centro del piatto.
  2. Trasferire il cervello isolato, uno alla volta, la goccia di mezzo sul piatto. Utilizzare lo strumento gancio per raccogliere un cervello sotto i lobi ottici. In alternativa, utilizzare pinze per afferrare assoni sporgenti dal cordone nervoso ventrale.
  3. Raccogliere 5-10 cervelli nella goccia di medium. Immergere il cervello utilizzando gli strumenti pin dissezione di spingere cervelli individuali al fondo della goccia di mezzo come molti di loro saranno intrappolati al menisco (Figura 2E).
  4. Orientare il cervello utilizzando gli strumenti pin dissezione per allineare il cervello a seconda della NBs per essere ripreso (Figura 3A). Per l'immagine NBS dorsale, posizionare il cordone nervoso ventrale rivolto verso il basso (lungo la membrana). Per l'immagine NBS antero-ventrale, posizionare il cervello con il cordone nervoso ventrale rivolto verso l'alto (lontano dalla membrana). Allineare i cervelli tale che tutti i cordoni nervosi ventrali puntano nella stessa direzione nel piano xy.
  5. Utilizzare una siringa o il trasferimento di plastica pipette a posto 4 halocarbon (HC) gocce di olio (circa 30 ml ciascuno) sulla membrana permeabile ai gas. Il volume di ciascuna goccia di olio deve essere equivalenti tra loro e al calo di mezzo. Spazio le gocce di olio corrispondono ai quattro angoli di un coprioggetto centrata intorno alla goccia di mezzo di coltura. Una volta completato, i cinque gocce (quattro gocce di olio e una goccia di mezzo al centro) sarà simile al cinque sfaccettature di stile occidentale dadi (Figura 3B).
  6. Abbassare un # 1.5 22 millimetri coprioggetto sul gruppo tale che colpisce tutti 5 gocce contemporaneamente. Il mantenimento di una pressione uniforme di tutti i campioni riduce la probabilità che essi saranno interrotti. Attendere circa 3 min come l'olio e mezzo disperdono sotto il peso del coprioggetto. Una forma a croce dei media formerà (Figure 3C e 3D).
  7. Passaggio fondamentale: Abbassare il vetrino sulla superficie del cervello, eliminando l'eccesso multimediale utilizzando una carta stoppino tessuto (Figuri 3C). Fate questo mentre si guarda il campione nell'ambito di applicazione dissezione. Come supporto viene rimosso, il vetrino si abbasserà. Fermare una volta che il vetrino tocca il cervello. Non esagerare con stoppino in quanto questo causerà distorsioni o tessuti cerebrali esplosioni.
  8. Se l'imaging dorsale NBs (Figura 3E), passare al punto 3.9. Se immagini NBs antero-ventrale, il vetrino deve essere leggermente spostato (da spingendo delicatamente con una pinza) in direzione delle punte cordone nervoso ventrale. Questo fa sì che il cervello per ruotare, che porta i lobi cerebrali in contatto diretto con il coprioggetto per facilitare l'imaging (Figura 3F).
  9. Sigillare la camera circondando il vetrino con piccole quantità di olio Halocarbon (Figura 3D). Un eccesso di olio che trasuda dal vetrino dovrebbe essere minimizzato e cancellato via con un fazzoletto di carta.

4. Imaging Live del Central Brain neuroblasti

Nota: Per questo lavoro, una filatura disco Nikon Eclipse Timicroscopio confocale (microscopio invertito) è stato utilizzato per l'imaging in tempo reale; dettagli della nostra configurazione precedentemente sono stati pubblicati 31. In alternativa, il campione può essere ripreso con un sistema verticale.

  1. Aggiungere una goccia di olio di immersione al vetrino appena sopra i cervelli montati. Ciò contribuirà a centrare l'obiettivo direttamente sopra il campione.
  2. Passaggio fondamentale: mantenere il cervello ad una temperatura costante di 25 ° C con un incubatore palcoscenico. Posizionare delicatamente il campione montato nell'incubatore palco e coprire la camera con il suo coperchio.
  3. Individuare NBs cerebrali centrali a luce trasmessa, concentrandosi sui grandi cellule rotonde che si trovano nelle zone centrali e mediali dei lobi ottici, non utilizzare epi-fluorescenza. Questo diventa più facile con la pratica. È molto importante esporre il campione per la minor quantità di luce possibile. Non sprecate il cervello di imaging di tempo che sono danneggiati.
  4. Una volta sul posto, prendere le esposizioni rapide utilizzando il confocale adeterminare la corretta posizione e la profondità. Limitare profondità al primo 10-15 micron. Regolare, se necessario, e prendere un'altra immagine di prova.
    1. Passaggio facoltativo: Raccogliere un filmato di prova del cordone nervoso ventrale per garantire che non vi è alcuna deriva xy. Se viene rilevato deriva, attendere 15-30 minuti per il campione di stabilirsi. Se la deriva non si stabilizza in 30 min, preparare un nuovo campione. Maggiore deriva di solito può essere fatta risalire l'aggiunta di olio in eccesso, o la dimensione ineguale delle gocce d'olio durante il montaggio.
  5. Per eliminare la deriva assiale (z-drift) utilizzano un dispositivo di continua messa a fuoco automatica che utilizza un LED a infrarossi. In alternativa, correggere manualmente il piano focale.
  6. Una volta che un NB di interesse è identificato, procedere con regime di imaging. Come con tutti cellule vive, la quantità di luce laser, tempo di esposizione, fotocamera binning, ingrandimento dell'obiettivo, tempo e / o l'intervallo di z-passo devono essere tutti empiricamente ottimizzato per un particolare esperimento per rispondere alla domanda in questione. L'obiettivo è di ridurre al minimo diga di luceetà, mentre ancora raccogliendo dati utili. Si veda la discussione per ulteriori indicazioni.
    1. Immagine l'intero volume del NB raccogliendo 12-14 immagini intervallate da 1 micron a l'asse z. Regolare la risoluzione temporale per catturare cicli singoli o multipli di cellule della stessa NB. Come regola generale, utilizzare gli intervalli di 10-30 secondi per l'imaging di un singolo ciclo cellulare e 1-3 min intervalli per più cicli cellulari.
  7. Passaggio fondamentale: Verificare che il campione è sano monitorando la durata della mitosi. Se mitosi richiede più di 15 minuti, passare a un altro cervello. Un cervello sano mostrerà molti NBs nello stesso campo visivo subire diversi round di mitosi. Si noti che ogni ciclo cellulare è leggermente più lungo del precedente a causa di danni luce.
  8. Una volta che l'imaging è completa, smontare la camera di incubazione, ed eliminare tutto, ma i piatti di coltura di gas-permeabili. Sciacquare la superficie cultura piatto con il 95% di etanolo e asciugare bene con un fazzoletto. Ripetere altre due volte.

    5. Preparazione di cervelli per immunofluorescenza

    1. Raccogliere 20 o più espiantati cervelli in una provetta da 1,5 ml contenente circa 0,2 ml di mezzo supplementato.
    2. Rimuovere mezzo dal tubo e risciacquare cervelli una volta con 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS con 0,3% Triton X-100). Let cervelli depositano sul fondo della provetta tra tutti gli scambi di liquido. Il detergente Triton X-100 è utilizzato per permeabilize tessuto. Risciacquo in genere richiede meno di 30 secondi; è sufficiente rimuovere il PBSTx volta cervelli si sono stabiliti sul fondo della provetta.
    3. Sostituire la soluzione con 0,5 ml del 9% elettronica del grado di microscopia paraformaldeide diluito in PBSTx. Incubare con nutazione per 15 min a temperatura ambiente.
    4. Smaltire fissativo secondo i regolamenti rifiuti pericolosi.
    5. Lavare i campioni con 0,5 ml PBSTx per 15 min. Ripetere la fase di lavaggio con PBSTx fresco due volte.
    6. Sostituire la soluzione con 0,5 ml PBT (PBS, 1% Di sieroalbumina bovina (BSA), e lo 0,1% Tween-20). Incubare con nutazione per 1 ora a temperatura ambiente. Questo passo blocca il legame non specifico di anticorpi al tessuto.
    7. Sostituire la soluzione con 0,5 ml di anticorpo primario diluito in PBT integrato con il 4% siero normale di capra (NGS). Incubare con nutazione notte a 4 ° C.
    8. Eliminare o salvare l'anticorpo primario diluito.
    9. Lavare i campioni con 0,5 ml PBT per 15 min. Ripetere la fase di lavaggio con PBT fresco due volte.
    10. Sostituire la soluzione con 0,5 ml di modifica PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20, e il 4% NGS). Incubare con nutazione per 1 ora a temperatura ambiente.
    11. Sostituire la soluzione con 0,5 ml di anticorpo secondario diluito in PBT modificati. Incubare con nutazione per 2 ore a temperatura ambiente.
    12. Sostituire la soluzione con 0,5 ml di PBST (PBS con 0,1% di Tween-20). Incubare con nutazione per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio con PBST fresco due volte.

    1. Trasferire accuratamente i campioni come una goccia su un vetrino, limitando la goccia verso la sinistra del centro della diapositiva.
    2. Aggiungere una goccia (circa 2 cm di diametro) di mezzo di montaggio (per esempio, Aqua-Poly/Mount) al centro della diapositiva. Evitare il pool di PBST che è verso sinistra.
    3. Usare pinze per trasferire i cervelli dal pool di PBST al pool di mezzo di montaggio. Aggiunta mezzo di montaggio direttamente sopra cervello può interrompere il loro orientamento e deve essere evitato.
    4. Sotto un microscopio ottico, disporre i campioni nel liquido di montaggio con il lato che verrà ripreso rivolto verso l'alto.
    5. Con il vetrino al microscopio luce, abbassare lentamente un bicchiere coprioggetto # 1.5 sulla cima dei campioni. Passaggio facoltativo: Eliminare le bolle d'aria minori esercitando una leggera pressione sul vetrino.
    6. Lasciare che il mezzo di montaggio per polimerizzare per diverse ore, o durante la notte, mentendo scivoli piatto, light-protetto, a temperatura ambiente.
    7. I vetrini possono essere ripreso il giorno dopo, o immagazzinato prima di imaging.

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Representative Results

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Immagini dal vivo ha chiarito una serie di meccanismi che regolano NB ACD. Prima di acquisizione delle immagini, è necessario determinare le condizioni ottimali di imaging. È necessario bilanciare la velocità di acquisizione cornice con la durata di cellule vive. Per l'analisi cellulare fine, per esempio, l'aumento temporale e può essere richiesto risoluzione ottica. Quando visualizzare un singolo ciclo cellulare NB (Figura 4A), la velocità con cui le immagini vengono catturate può essere aumentata senza introdurre fotodanneggiamento. In genere, i singoli eventi divisione cellulare possono essere controllati ad intervalli di tempo di circa 10-30 secondi. Un modo per aumentare la risoluzione temporale senza danneggiare il tessuto è di modulare la velocità di acquisizione delle immagini. Ad esempio, time-lapse imaging può essere iniziata in un frame rate più basso, che viene poi aumentato sull'osservazione di una caratteristica interessante o punto temporale (Movie 1).

Imaging successivi cicli di divisione cellulare ( (Figura 4B). Noi di solito multiple immagini (due o più) cicli di ACD attraverso l'intero volume delle cellule NB ad intervalli di 1-3 minuti di tempo per un periodo di 2-3 ore. Sia la risoluzione temporale e il periodo di acquisizione di immagini possono essere migliorate riducendo la quantità di luce che colpisce il campione. Ad esempio, time-lapse imaging di divisioni NB successivi potrà essere prorogata di oltre 8 ore se solo un unico piano ottico è ripreso. Selezione di linee transgeniche particolarmente utile per lo studio di NB ACD è presente (Tabella 1) 16, 31, 34-38.

Per l'analisi di un gran numero di campioni, è spesso necessario analizzare NBs fissi. Il nostro protocollo fissazione conserva la morfologia complessiva del NBs ed è compatibile con saggi di immunofluorescenza (figure 4C-4E). Tutta brai montaggio fissons possono essere esposte a basso ingrandimento (Figura 4C) per visualizzare la dimensione complessiva del cervello e la forma o per rilevare NBs. Per visualizzare NBs oi loro GMC progenie più in dettaglio, deve essere utilizzato ingrandimento maggiore. Alla moderata ingrandimento (Figura 4D), si possono osservare interi grappoli NB lignaggio. Per un'analisi dettagliata cellulare, più alto ingrandimento viene utilizzato (Figura 4E).

Figura 1
Figura 1. Espianto cervelli interi per l'imaging cellulare dal vivo di NB ACD. A) Il sistema nervoso centrale larvale consiste di due lobi ottici e un cordone nervoso ventrale. Due sottotipi di NBs popolano il lobo ottico in posizioni stereotipate:. Tipo I (blu scuro) e tipo II (blu chiaro) B) NBs subiscono ACD. Con ogni divisione cellulare, laScinde NB per dare vita ad uno GMC (o INP, non mostrato) e rigenera la cellula staminale NB. GMC divide per dare origine a due neuroni o glia (non illustrato). C) Due strumenti microdissezione sono assemblati inserendo spilli sezionare in supporti pin. Piegano i piedini crea strumenti unici, un bisturi e un gancio, che vengono utilizzati per tagliare, forare, e spostare il tessuto indesiderati senza danneggiare il cervello sottostante. D) I cervelli sono espiantati in una delle due piscine di media dissezione (cerchi blu). Un pool di terreno è usato per rimuovere il sistema nervoso centrale dalla larve (dissezione lordo), e l'altra piscina è usato per microdissezione fini di tessuti periferici dai cervelli espiantati (dissezione fine).

Figura 2
Figura 2. Preservzione della morfologia cerebrale durante microdissezione. Hasty dissezione del cervello può indurre gravi danni ai tessuti che comprende (A) strappato cordoni nervosi ventrali o (B) distorte lobi ottici. Ancora più sottile danni ai tessuti (B ') deve essere evitato per l'imaging cellulare dal vivo. (C) Un esempio di un campione di tessuto sano adatto per l'imaging in tempo reale. D) Un otticamente trasparente, gas membrana permeabile. E) una raccolta di diversi cervelli sani disposti in coltura medio su un piatto gas-permeabile. Questi cervelli sono pronti per essere montati per microscopia. Barra della scala: (AC), 100 micron; (D), 25 millimetri; (E) 1 mm.

Figura 3
Figura 3. Cervello per imaging cellulare dal vivo di montaggio. A) Cervellos sono allineate in righe all'interno di una goccia di mezzo di coltura depositato al centro del piatto. B) La goccia della soluzione è circondato da gocce d'olio di HC approssimativamente uguale volume. Le quattro gocce di olio HC e la goccia centrale di media assomigliano alle cinque sfaccettature del gioco dei dadi. Dopo un coprioggetto viene abbassata sulle gocce di olio, (C) uno stoppino è modellato su tessuto KimWipe e utilizzato fino a Sop liquido in eccesso. D) Il bordo esterno del vetrino è circondato da un sottile strato di olio per fermare l'evaporazione del mezzo di coltura. Questi cervelli sono ora pronti per la microscopia. E ed F) L'orientamento del relativo cervello al vetrino determina quali neuroblasti sono accessibili per l'imaging cellulare dal vivo. E) neuroblasts dorsali vengono esposte organizzando il cervello con il lato ventrale toccare la membrana permeabile ai gas . F) neuroblasts antero-ventrale può essere ripreso da arrAnging cervelli con il lato dorsale toccare la membrana permeabile ai gas e quindi spingendo coprioggetti, e il tessuto sottostante, in direzione delle punte cordone nervoso ventrale. Questo movimento si inclina leggermente i lobi ottici tale che i contatti della superficie antero-dorsale il vetrino, portando l'asse delle immagini desiderate in perfetto allineamento (linea verde).

Figura 4
Figura 4. Risultati rappresentativi di immagini dal vivo della divisione neuroblasti. A e B) Risultati in diretta delle immagini di NB staminali divisioni cellulari in tutto preparati montaggio utilizzando un 40X, 1.3 NA obiettivo ad immersione in olio. Ora viene visualizzata come min: sec relativo all'inizio del time-lapse A) Stills da time-lapse imaging di un singolo ciclo cellulare da un NB esprimere GFP-Moesin.(GFP-Moe). La velocità di acquisizione delle immagini di un singolo ciclo cellulare può essere aumentata per migliorare la risoluzione temporale senza indurre fotodanneggiamento. B) Stills di time-lapse imaging di cicli di divisione cellulare successivi da un NB esprime sia GFP-Moe e un pennarello cntrosoma GFP-etichettata. Il periodo di prolungata associata a cicli cellulari più richiede una ridotta risoluzione temporale per evitare fotodanneggiamento. Si noti che l'intervallo di tempo tra ogni divisione cellulare aumenta nel corso della rappresentazione. CE) proiezioni confocale di cellule staminali fissi da intere preparazioni di montaggio. C)) a tutte le immagini NBs poste su entrambi i lobi ottici, viene utilizzato 20X di ingrandimento. Questa analisi è particolarmente utile per esaminare la morfologia generale del cervello e per quantificare i numeri NB (azzurro), ecc. D) La maggior parte dei NBs (rosa) da un unico lobo ottico può essere visualizzato con 40X di ingrandimento. I microtubuli, (verde). E)

Movie 1. Immagini dal vivo di un singolo ciclo cellulare NB. Immagini Time-lapse di una singola divisione cellulare NB da un cervello che esprimono GFP-Moe per etichettare la corteccia cellulare. Le immagini sono state acquisite da un unico piano ottico a 40X ingrandimento. In questo film, fotogrammi sono stati catturati ogni 15 sec. Dopo circa 7 minuti di acquisizione, il tasso è stato aumentato a un fotogramma ogni 5 secondi. Clicca qui per vedere film.

Movie 2. Immagini in diretta turni successivi of NB ACD. time-lapse immagini di un NB sottoposti a tre cicli di divisione cellulare in un cervello che esprimono GFP-Moe e un pennarello cntrosoma GFP-etichettata. Le immagini sono state acquisite a intervalli di 2 minuti di tempo a 60X di ingrandimento. Clicca qui per vedere film.

Linea Etichettato struttura cellulare Fluoroforo Espressione / Promotore Citazione
YFP-Asterless Centriolo YFP Ubiquitin Rebollo, et al. (2007) Dev. Cella 12:. 467.
SAS6-mCherry Centriolo mCherry Endogeno Rusan e Peifer (2007) J. Biol Cella. 177
GFP-SAS6 Centriolo GFP Endogena (BAC) Lerit e Rusan (2013) J. Biol Cella 202:. 1013.
GFP-PACT Centriolo GFP Ubiquitin Martinez-Campos, et al. J. Biol Cella 165:. 673.
GFP-SAS4 Cntrosoma GFP Ubiquitin Dix e Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
GFP-Polo Cntrosoma GFP Endogeno . Moutinho-Santos, et al (1999) Biol Cella 91:. 585.
GFP-γ-tubulina 23C Cntrosoma GFP Ubiquitin Lerit e Rusan (2013) J. Biol Cella 202:. 1013.
GFP-Centrosomin Cntrosoma GFP UAS Megraw, et al. (2002) J. Cellulari Sci 115:. 4707.
GFP-Spd-2 Cntrosoma GFP Ubiquitin Dix e Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
mCherry-α-tubulina I microtubuli mCherry Ubiquitin Rusan e Peifer (2007) J. Biol Cella 177:. 13.
GFP-α-tubulina I microtubuli GFP Ubiquitin . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8.
Giove-GFP ("G147") I microtubuli GFP Endogeno Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-Giove Microtubulis mCherry UAS Cabernard e Doe (2009) Dev. Cella 17: 134.
H2AvD-MRFP DNA MRFP Endogeno Pandey, et al. (2005) J. Cellulari Sci 118:. 733.
H2AvD-GFP DNA GFP Endogeno Clarkson e San (1999) Biol DNA cellulare 18:. 457.
Moesin-GFP Actina corticale GFP Zucca Spaghetti Kiehart, et al. (2000) J. Biol Cella 149:. 471.

Tabella 1. Selezione di linee transgeniche utili per lo studio di ACD. Questi costrutti di fusione sono particolarmente utili per studiare la divisione cellulare. Essi sono abitualmente utilizzati in NB studi di imaging dal vivo.

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Discussion

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Imaging cellulare dal vivo è un approccio prezioso utilizzato per studiare i meccanismi che regolano ACD delle cellule staminali, la differenziazione delle linee cellulari, e la morfogenesi dei tessuti complessi. Sebbene gruppi di ricercatori hanno storicamente impiegato una varietà di tecniche per visualizzare NB ACD, questi approcci possono generalmente essere raggruppate in due categorie che differiscono principalmente per quanto riguarda se il tessuto cerebrale è lasciata intatta o dissociata.

Imaging dissociato NBs ha i suoi vantaggi. Per uno, dissociate NBs sono più facili da immagine perché sono particolarmente facili da identificare come più grandi (circa 12 micron di diametro), le cellule in un piatto di coltura. Inoltre, quasi tutte le cellule staminali che sono coltivati ​​su una superficie di vetro sarà ugualmente vicino all'obiettivo microscopio tutto il periodo di acquisizione dell'immagine. La qualità ottica di time-lapse immagini è ulteriormente migliorata con l'uso di una poli-L-lisina o fibrinogeno vetro rivestito di indurre la semi-appiattimento del round NBs 16, 17. Un altro vantaggio per l'imaging NBs dissociate in coltura è la facilità con cui mezzo coltura può essere scambiato. Una volta che le cellule aderiscono alla superficie del vetro rivestito, coltura terreno contenente qualsiasi numero di agonisti, antagonisti farmacologici o anticorpi immunoblocking, ecc. possono essere aggiunti o rimossi. Infine, recenti approcci per visualizzare NBs dissociate hanno dimostrato che questa tecnica è, infatti, suscettibile di acquisizione dell'immagine prolungato 18, 19.

Tuttavia, gli svantaggi all'imaging dissociate NBs includono la complessità del protocollo. La maggior parte dei metodi dettaglio lunga (30-60 min) digestione chimica, seguita da una lunga fase di incubazione (60 min) per permettere alle cellule disperse di insediarsi e aderire al piatto di coltura 17, 19.

Al contrario, NBs di imaging di un cervello intatto conserva sia l'contesto fisiologico e morfologia del tessuto. I vantaggi di questo approccio comprendono la capacità di identificare specifici lignaggi NB che si sviluppano in modalità stereotipate o in momenti di sviluppo definiti 1. Pertanto, il nostro protocollo semplificato ha utilità che va oltre gli studi di ACD, in quanto consente anche per l'indagine diretta di eventi differenziazione e morfogenesi. Uno svantaggio di questo metodo, tuttavia, è l'incapacità di scambiare coltura medie. Pertanto, i ricercatori interessati a immagini a lungo termine di divisioni cellulari staminali successive devono considerare l'approccio (coltura primaria dissociato rispetto a tutto il monte) che meglio si adatta alle loro applicazione. Analogamente, la necessità di additivi di coltura, come l'insulina o siero, deve essere determinato empiricamente sulla base delle condizioni di imaging (durata della rappresentazione, la quantità di luce che colpisce il campione, ecc.) E setup sperimentale.

In generale, si consiglia di utilizzare dissociateNBs d per gli studi in cui è necessario per valutare la risposta acuta della NBs all'introduzione di piccole molecole (ad esempio, inibitori, ecc.), per applicazioni high-throughput quando microdissezione multa di cervelli potrebbe essere troppo ingombrante, e per studi di imaging avanzate che richiedono la NB di essere in contatto fisico con il coprioggetto. Al contrario, si consiglia di utilizzare il cervello intatto per le applicazioni in cui è utile per l'immagine a pochi NBs dallo stesso cervello, e soprattutto per gli studi che riguardano le interazioni cellula-cellula, l'autonomia, l'analisi clonale, cambiamenti di forma delle cellule, e di altre indagini in cui il nativo ambiente delle cellule è importante.

Per garantire il successo della preparazione dei cervelli intatti per l'imaging dal vivo, diversi passaggi critici devono essere attentamente eseguite. Soprattutto, è indispensabile per evitare di esporre il tessuto trauma inutile. In particolare, espianto del cervello e rimuovere il tessuto periferico deve essere eseguito con cura. Unodovrebbe minimizzare il contatto diretto tra gli strumenti dissezione e cervello. Inoltre, si dovrebbe evitare tirando o tirando sul tessuto attaccato al cervello. L'uso scorretto del tessuto può facilmente provocare cervelli strappati o distorte. Nelle nostre mani, NBs dal cervello danneggiate raramente dividere. Gli individui che sono nuovi per larvale dissezione del cervello spesso beneficiano di padroneggiare la dissezione prima di tentare di preparare i campioni per l'imaging dal vivo.

Un altro passo fondamentale nel protocollo è il montaggio dei cervelli prima di vivere l'imaging cellulare. La corretta volumi dei media coltura e olio HC sono essenziali per completare un preparato utile. Sebbene sia difficile misurare con precisione l'olio HC viscoso con una pipetta, si può approssimare il volume corretto (circa 30 ml) ad occhio. Troppo liquido impedisce il vetrino da stabilirsi in sede. Spesso, ciò comporta i cervelli spostano sulla superficie del piatto di coltura. Durante l'imaging dal vivo, un vetrino instabile è evident quando le derive di tessuto o il rotolo lobi ottica. I campioni che non sono posizionati in luogo dovrebbero essere evitati. Al contrario, aggiungendo troppo poco mezzo di coltura o di risultati di petrolio HC in danno tissutale catastrofici, tra cui lobi ottici scoppio. C'è un attento equilibrio tra l'utilizzo abbastanza medio e olio liquido per gestire il peso del vetrino contro usando troppo liquido, che provoca il coprioggetto scorrimento. Questo equilibrio è meglio imparare attraverso la pratica. In generale, è meglio solo quei cervelli immagine che hanno una morfologia sano, ad esempio un cordone nervoso ventrale intatta e simmetriche, lobi rotondi ottiche.

Una volta che il campione è montato con nessuna deriva rilevabile, mantenendo vivo il campione diventa il prossimo aspetto critico di questo protocollo. Ciò si ottiene mantenendo la temperatura corretta e, soprattutto, minimizzando la quantità di luce che colpisce il campione. La configurazione microscopio e il campione sono le due variabili che disciplineranno il successo di live imaging cellulare. Obiettivi di alta qualità, filtri (~ trasmissione 98%), e macchine fotografiche (elettrone back-assottigliato moltiplicando e complementare a semiconduttore a ossido di metallo) sul lato di emissione si permettono di ridurre la quantità di luce che colpisce il campione sul lato di eccitazione. E 'noto che la luce blu (serve per immagine GFP) è altamente tossico per le cellule. Si può determinare la quantità di luce totale (tempi totali di posa) un dato campione può tollerare e poi diffusa che tempo totale lungo la durata dell'esperimento. Ad esempio, se un campione può tollerare solo 500 esposizioni alla luce laser basate su una particolare configurazione microscopio, allora si potrebbe raccogliere pile 50 x 10 slice. Queste pile potrebbero essere intervallate da 1 min a raccogliere un singolo ciclo cellulare NB, o 2-3 minuti per raccogliere ~ 3 cicli cellulari. Inoltre, ottimizzando le impostazioni per ciascun genotipo è un fattore critico per il successo imaging dal vivo. Durante il periodo di ottimizzazione, un buon punto di partenza per 488 nm potenza del laser è 25-50 μW proveniente da una 100X, 1.4 NA &# 160; obiettivo ad immersione in olio. Infine, si deve determinare quale condizione di imaging risponderà correttamente alla domanda in questione, in quanto non è sempre il caso che è necessario l'imaging più sofisticate.

Per gli esperimenti con il tessuto vivo o fisso, cervello possono essere montati in modo da immagine specifici lignaggi NB. Ad esempio, al fine di Tipo II NBs immagine, che stereotypically risiedono nella regione postero-mediale del lobo ottica 7, si potrebbe montare il cervello, come illustrato in Figura 3E. Poiché la distribuzione spaziale e temporale delle NBs cerebrali centrali sono stati ben documentati 1, si può usare il nostro protocollo per l'immagine una serie di specifici cluster di NB, mentre utilizzando un qualsiasi numero di costrutti transgenici ampiamente disponibili che sono espressi sotto onnipresente o, idealmente, i promotori endogeni (Tabella 1). Tuttavia, le tecnologie di etichettatura specifico lineage-20 restano utile per una serie di applicazioni.Con l'analisi fisso, cervelli con danni minori sono generalmente accettabili. Inoltre, la rimozione completa del tessuto periferico può essere rinviata fino a poco prima incorporamento cervello in mezzo di montaggio. Studi con tessuto fisso sono particolarmente utili quando un gran numero di NBs devono essere ripreso.

In conclusione, gli studi di NB ACD hanno notevolmente beneficiato l'uso di entrambi imaging cellulare dal vivo e di analisi fissa dettagliata. Il protocollo descritto qui DETTAGLI un approccio per preparare larve di Drosophila per applicazioni sia dal vivo o fissi. Anticipiamo la continua ricerca di NB ACD attraverso studi dettagliati di imaging rivelerà romanzo e risultati entusiasmanti che avanzeranno la nostra comprensione delle cellule staminali nello sviluppo e nella malattia. L'applicazione di lungo termine in vivo imaging di cervelli larvali intatti ha il potenziale per scoprire nuovi approfondimenti nella sequenza temporale di differenziazione e morfogenesi eventi che governano lo sviluppo (e degenerazionezione) del sistema nervoso centrale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla divisione di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) ed un Lenfant Biomedica Postdoctoral Fellowship attribuiti a DAL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

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Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

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