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Neuroscience

Imágenes en vivo de doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Abstract

Las células madre se dividen asimétricamente para generar dos células hijas con desigual potencial destino: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celular. Dada su importancia para el desarrollo y la enfermedad, la comprensión de los mecanismos que gobiernan la división de células madre asimétrica ha sido un área sólida de estudio. Debido a que son genéticamente manejable y se someten a rondas sucesivas de la división celular aproximadamente una vez cada hora, las células madre del sistema nervioso central de Drosophila, o neuroblastos, son modelos indispensables para el estudio de la división de células madre. Acerca de 100 células madre neurales se encuentran cerca de la superficie de cada uno de los dos lóbulos cerebrales de larvas, por lo que este modelo de sistema particularmente útil para estudios de microscopía de formación de imágenes en vivo. En este trabajo se revisan los enfoques ampliamente utilizados para visualizar las divisiones de células madre, y nos dirigimos a las ventajas y desventajas de las técnicas que emplean disocian frente a los tejidos cerebrales intactas relativos. También detalle nuestra simplifprotocolo ied utiliza para explantar cerebros enteros de larvas del tercer estadio de imágenes de células vivas y aplicaciones de análisis fijos.

Introduction

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Las células madre mantienen un equilibrio de la diferenciación y autorrenovación para generar diversidad celular durante el desarrollo temprano y reemplazar las células dañadas en los tejidos adultos. Reglamento de esta homeostasis impide que tanto la pérdida como la expansión excesiva de la población de células madre, lo cual puede resultar en la degeneración del tejido perjudicial o tumorigénesis.

Los neuroblastos (NBS) son las células madre neurales ampliamente estudiadas del sistema nervioso central de Drosophila (Figura 1A) que primero forma durante las etapas embrionarias 1, 2. RN sometidos a rondas repetidas de división celular asimétrica (ACD) para producir dos células desigual predestinados: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celulares. ACD es guiado por centrosomas, los orgánulos no membranosos que actúan como los centros de organización de microtúbulos de la mayoría de las células 3. Durante la mitosis, los centrosomas NB organizan y orientan el huso mitótico bipolar a lo largo del polo apical-basaleje dad. Tras la escisión de la división de NB, determinantes destino apicales que especifican el destino de células madre, y los determinantes del destino basales que especifican la diferenciación, son segregados en las células hijas desiguales.

En el cerebro central de las larvas, dos tipos de RN se pueden distinguir por su número, la posición, la expresión del factor de transcripción, y el linaje celular (Figura 1 A) 4-6. Tipo I NBS son los más abundantes, y sobre 90 de los pueblan los lados anterior y posterior de cada lóbulo óptico del cerebro 7. Estos NBS expresan el factor de transcripción Asense (ASE), y que característicamente se dividen en una auto-renovación NB y uno ganglio de células madre más pequeña (GMC; Figura 1B). Cada GMC se somete a una sola división de terminal para generar dos neuronas o la glía (Figura 1B). Por el contrario, los RN ocho de tipo II que pueblan la parte posterior de cada lóbulo óptico carecen Ase expresión 5. Se someten a ACDpara producir un auto-renovación NB y uno progenitoras neurales intermedio (INP).

El INP, a su vez, divide asimétricamente tres a cinco veces. Cada una de estas divisiones resultados en la regeneración de la INP y la producción de un solo GMC 4. En conjunto, la identidad específica NB y el orden temporal de GMC nacimiento da lugar a la diversidad neuronal asombrosa del sistema nervioso central adulto.

La comprensión de la biología celular que subyace NB ACD se ha mejorado enormemente mediante el uso de técnicas de imágenes de células vivas. Publicado protocolos utilizados por los investigadores a imagen RN vivos varían ampliamente. En general, sin embargo, estos métodos se pueden agrupar en dos categorías generales que se distinguen por si el cerebro de larvas se deja intacta o mecánicamente disociado. Ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, dependiendo de la solicitud del investigador.

Los primeros informes que revelan vivo división celular NBnes implican algún grado de disociación manual de la cerebro de larvas. Estos protocolos de detalle se corra 8 o burlas aparte 9 del cerebro para crecer cultivos primarios a corto plazo de la RN sobre cubreobjetos de vidrio. Para mejorar la imagen, las NBS redondas son generalmente aplanados en los cubreobjetos, ya sea con placas de vidrio 8 o almohadillas de agarosa 9. Aunque las células aplanadas han mejorado la óptica, estas técnicas conducen a menudo a defectos mitóticos NB, incluyendo la regresión del surco de segmentación y la incapacidad para dividir más de una vez. Por lo tanto, los protocolos que implican tanto la disociación manual y distorsión física del tejido cerebral de larvas generalmente sólo se adaptan a muy corto plazo (es decir., Ciclo de una célula o menos) aplicaciones. Del mismo modo, semi-aplastamiento o aplanar completamente cerebros intactos entre las diapositivas de cristal y cubreobjetos limita el tiempo que uno puede pasar la imagen de una modelo que figura como a un período de aproximadamente 30 min 10. A pesar de esta limitación, this enfoque ha sido utilizado con éxito 11-14.

Los recientes esfuerzos para vivir imagen disocian límite RN distorsión física de las células aisladas. Estas técnicas son particularmente útiles para aplicaciones en las que es necesario para mantener cultivos de células para múltiples ciclos de división celular. Por ejemplo, las células dispersas de cerebros disociados manualmente pueden estar parcialmente incrustadas en un coágulo a partir de la mezcla de fibrinógeno y trombina 15 para formación de imágenes a largo plazo 16. Alternativamente, los cerebros explantados pueden ser primero químicamente disociado con la enzima colagenasa, junto interrumpido manualmente por el paso repetido a través de una punta de pipeta, y posteriormente se sembraron en platos de fondo poli-L-lisina-revestido de vidrio 17, 18. Revestimiento de platos de vidrio, ya sea con el fibrinógeno o poli-L-lisina promueve el apego y ligera propagación de células redondas, llevándolos tan cerca del cubreobjetos posible sin distorsión importante físico. En additien adelante, estos métodos implican el cultivo de la NBS en medio que puede intercambiarse fácilmente para los experimentos de perturbación farmacológicas 18. En general, enchapado directamente dispersados ​​RN mejora óptica de imagen sin sacrificar la capacidad de imagen a largo plazo. Recientemente, un protocolo que describe el cultivo a largo plazo de NB disociada se ha detallado 19.

Sin embargo, este enfoque no es sin sus limitaciones. Hay varias advertencias a las imágenes RN disociadas en vivo. En un campo de células dispersas, por ejemplo, es difícil identificar linajes NB específicos que se organizan espacialmente en el cerebro intacto 1. Del mismo modo, distinguir el tipo I frente II NB dentro del tejido disociado tipo también es difícil sin la expresión de marcadores de linaje o transgenes específicos de subtipo, tales como Worniu-GAL4, GAL80-aSENSE 20. Aunque estos transgenes son muy útiles para algunas aplicaciones, no se limitan a los investigadores a los transgenes expresionado bajo el control del elemento promotor de UAS 21 y requieren esquemas genéticos más complejos. Los estudios que se refieren al desarrollo espacial o temporal de los RN, por lo tanto, requieren de imágenes in vivo, en el contexto de un tejido intacto.

Por otra parte, los estudios de NBS embrionarias disociadas indican que el contacto físico de las células adyacentes es crítica para la localización de la interfase polaridad clave determinantes 22, 23. Estos estudios muestran completamente aislado RN ya no mantener el eje del huso mitótico invariante. En su lugar, estas células presentan un eje de husillo más aleatorios y amplios ángulos de separación entre los sucesivos brotes de GMC, tal vez debido a la pérdida de posicionamiento del centrosoma apical 22. Aunque la relación entre el BNE larvales y sus células vecinas no ha sido ampliamente estudiado, vale la pena considerar que el microambiente de células madre de larvas puede incidir en la polaridad celular u otrocomportamientos. Para mantener el contexto fisiológico de larvas NBS, que la imagen de ACD a partir de cerebros enteros.

Dadas las limitaciones inherentes asociados con la formación de imágenes disociadas RN, nuestro laboratorio y otros han establecido protocolos para imágenes sucesivas rondas de NB ACD de cerebros larvales enteros. Técnicas a la imagen cerebros intactos a menudo sustituyen la superficie rígida de vidrio en un lado de la cámara de cultivo con una membrana flexible para evitar la distorsión o daño de tejido y permitir el intercambio de gases. Algunos métodos implican montaje cerebros explantados en una mezcla de medio de insecto de cultivo, suero, y ácido ascórbico con los cuerpos grasos aislados de diez larvas 24. Los cuerpos grasos aislados se añaden porque secretan un mitógeno sabe que estimula la división celular NB 25. Este protocolo preserva la integridad de los tejidos durante más de 3 horas y es, por lo tanto, susceptibles de formación de imágenes a largo plazo 24, 26-28. Recientemente, un protocolo que describe la lonimágenes g plazo de cerebros larvas intactas en presencia de ácido ascórbico, suero y los órganos de grasa se ​​ha detallado 29. Es importante destacar que, debido a que el tejido está expuesto ni tampoco inmovilizado, este enfoque es menos útil para aplicaciones en las que se intercambia medio de cultivo (por ejemplo, estudios de la droga, la inmunodepleción, etc.).

Nuestro laboratorio ha simplificado todo el monte de la preparación de los cerebros de larvas vivas para la imagen a largo plazo 30, 31. La principal ventaja de nuestro protocolo sobre los demás es su simplicidad: nuestras observaciones indican ni el suero, el ácido ascórbico, la insulina, ni cuerpos gordos son aditivos necesarios a imagen de rondas sucesivas de NB ACD. Aunque aditivos, tales como la insulina, han sido útiles para la formación de imágenes prolongada de divisiones celulares vástago 32 y la migración celular colectiva en los ovarios de Drosophila 33, que parecen ser prescindible para NB de ACD, como nuestro medio de formación de imágenes se compone de una mezcla simple de Standard medio de cultivo de células de insecto suplementado con antibiótico-antimicótico para evitar la contaminación. Mediante el uso de placas de cultivo de fondo permeable al gas o de vidrio reutilizables, hemos sido capaces de sostener varias rondas sucesivas de ACD NB. Las mismas muestras explantados fácilmente se pueden utilizar para inmunofluorescencia y otros procedimientos con tejido fijado. En este protocolo, detallamos la disección del cerebro de larvas intactas, así como la preparación de los cerebros para el análisis tanto en directo como fijo.

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Protocol

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1. Preparación de los materiales requeridos para explante Brains tercer estadio larval

  1. Preparar las herramientas necesarias para microdisección.
    1. Forjar dos herramientas de disección (un bisturí y un gancho) colocando primero un único pin de disección en cada soporte de pasador. Asegure los pasadores firmemente con la mano o con pinzas (Figura 1C).
    2. Use un par de pinzas de edad para doblar un pin de disección para un ángulo de aproximadamente 120 °. Haga esto bajo un microscopio de disección para asegurar que la mitad superior de la espiga quede plana cuando el soporte de pasador se mantiene en su mano. Esta herramienta se utilizará como un bisturí para sujetar o cortar a través del tejido.
    3. Use un par de pinzas de edad para doblar el segundo pasador en forma de gancho que se utiliza para mantener y raspar el tejido.
    4. Cubra cada herramienta de disección con una punta de pipeta para proteger las herramientas de deterioro. Con cuidado, herramientas bien formados pueden ser utilizados para la disección de forma indefinida. Reemplace los pins dañados o deformados según sea necesario.
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  2. Preparar la disección de medio.
    1. En una campana de cultivo de tejidos, diluir el suplemento antibiótico-antimicótico en medio de cultivo de la Schneider. Agitar los medios para incorporar el suplemento.
    2. Prepare varias alícuotas de 5 ml de los medios suplementados. Guarde todos los medios a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
    3. Calentar una alícuota de 5 ml de medio suplementado a temperatura ambiente. Dibuje el medio en una estéril jeringa de 5 ml y el tornillo en un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril.
  3. Seleccione larvas para la disección. Utilice una sonda de disección para seleccionar arrastrándose larvas de tercer estadio como el cerebro será más fácil de diseccionar. Opcional: las larvas se depositan sobre una placa de agar de uva.
    Nota: No utilizar los viales o frascos excesivamente concurridos con "alimentos húmedos", ya que estos tienden a forzar segundos o larvas de primer instar a gatear antes de tiempo.
    Nota: Algunos antecedentes genéticos requerirán el uso de larvas de menos. Esto no afecta el protocolo, pero hace que el dissection más difícil.

2. Disección del Sistema Nervioso Central

  1. En una sola lámina de vidrio, cree dos piscinas de 50 ml de medios de disección cálidos separadas por unos 3 cm. Una de las piscinas será utilizada para la disección bruto y otra utilizada para la disección fina (Figura 1C).
  2. Transferir varios larvas a una de las gotas de medios de comunicación.
  3. Mueva el cubreobjetos con larvas a un microscopio de disección. Zoom en la piscina que contiene las larvas de tal manera que los extremos anterior y posterior de las larvas son discernibles.
  4. Use un par de pinzas para agarrar la región media de una sola larva. Tome un segundo par de pinzas en la otra mano y agarrar la larva cerca de la misma región. Tire de los dos pares de pinzas, aparte de romper suavemente la larva en el medio. Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos.
  5. Deshágase de las mitades posteriores del cuerpo de la larva, transfiriéndolos a un tejido.
  6. Zoom en una larva por lo que thmouthhooks anteriores correos son claramente visibles. Utilice ambos pares de pinzas para crear una pequeña incisión, o muesca, en lados opuestos de los mouthhooks de larvas entre la tercera y la primera torácica bandas denticle anteriores.
  7. Agarre las mouthhooks con las pinzas en la mano no dominante. Utilice las pinzas en la otra mano para que despegar la cutícula en una dirección antero-posterior a. Continuar para pelar lentamente cutícula hasta el sistema nervioso central está expuesto.
  8. Aislar el sistema nervioso central del resto de la larva por desgarro tejidos con los fórceps. Tenga cuidado de no alterar el sistema nervioso central.
    Paso crítico: No tire en el sistema nervioso central! Desechar las muestras dañadas con un cable roto ventral del nervio (Figura 2A) o lóbulos ópticos distorsionadas (Figuras 2B y 2B ').
  9. Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos. Transferir el tejido explantado saludable para lasegunda piscina (limpia) de media sobre el portaobjetos para la etapa de la disección fina.
  10. Utilice las herramientas de pasador de disección para limpiar los tejidos periféricos (por ejemplo, los ojos, las alas y las piernas discos) desde el cerebro. Deslice el bisturí entre la quería (cerebro) y el tejido no deseado, sujetando el tejido conectivo del cubreobjetos. Utilice el gancho para embromar suavemente el tejido no deseado mientras pulsa simultáneamente el bisturí para el cubreobjetos en los movimientos de sierra similares.
  11. Paso crítico: Trabaje despacio y deliberadamente para eliminar todos los discos de cada cerebro. Tenga cuidado de no alterar la morfología del cerebro. Un cerebro saludable tendrá un cordón ventral del nervio intacto y simétrico, lóbulos ópticos redondos (Figura 2C).

3. Montaje Brains explantado para imágenes en vivo

  1. Invierta una placa de cultivo de gas permeable 50 mm con la película clara hacia arriba (Figura 2D). Presione la jeringa para depositar una pequeña gota (aproximadamente 30 l) de medio sobre tél centro del plato.
  2. Transfiera los cerebros aislados, uno a la vez, a la gota de medio en el plato. Utilice la herramienta de gancho para sacar un cerebro debajo de los lóbulos ópticos. Por otra parte, el uso de fórceps para agarrar los axones que se proyectan desde el cordón nervioso ventral.
  3. Recoger 5-10 cerebros en la gota de medio. Sumerja el cerebro mediante el uso de las herramientas de pasador de disección para empujar los cerebros individuales a la parte inferior de la gota de medio ya que muchos de ellos serán atrapados en el menisco (Figura 2E).
  4. Orientar los cerebros utilizando las herramientas pin de disección para alinear cerebros dependiendo de la RN en ser fotografiado (Figura 3A). Para la imagen de la RN dorsal, coloque el cordón nervioso ventral hacia abajo (a lo largo de la membrana). Para la imagen de las NBS-Antério ventral, ponen el cerebro con el cordón nervioso ventral hacia arriba (alejándose de la membrana). Alinear los cerebros de tal manera que todos los cordones nerviosos ventrales apuntan en la misma dirección dentro del plano XY.
  5. Utilice una jeringa o de transferencia de plástico pipette para colocar 4 halocarbonos (HC) gotas de aceite (unos 30 l cada uno) sobre la membrana permeable a los gases. El volumen de cada gota de aceite debería ser equivalentes entre sí y a la gota de medio. Espacio de las gotas de aceite para que correspondan a las cuatro esquinas de un cubreobjetos centrada alrededor de la gota de medio de cultivo. Una vez completo, los cinco gotas (cuatro gotas de aceite y una gota de medio en el centro) se parecerán a las cinco facetas en estilo occidental dados (Figura 3B).
  6. Bajar un # 1.5 22 mm cubreobjetos sobre el conjunto de tal manera que realiza todas las 5 gotas al mismo tiempo. El mantenimiento de una presión uniforme a través de las muestras reduce la probabilidad de que serán interrumpidos. Espere aproximadamente 3 min como el aceite y el medio disperso bajo el peso del cubreobjetos. Se forma una forma de cruz de los medios de comunicación (Figuras 3C y 3D).
  7. Paso crítico: Baje el cubreobjetos sobre la superficie del cerebro, eliminando el exceso de medios usando una mecha de papel de seda (Figure 3C). Haga esto mientras ve la muestra bajo el microscopio de disección. Como se retiró el medio, el cubreobjetos bajará. Detener una vez que el cubreobjetos toca el cerebro. No se exceda en la mecha, ya que esto hará que la distorsión del tejido del cerebro o explosiones.
  8. Si dorsal imágenes NBS (Figura 3E), se mueven al paso 3.9. Si de formación de imágenes NBS-Antério ventral, el cubreobjetos se debe mover ligeramente (por suavemente empujándola con fórceps) en la dirección de las puntas de cordón nervioso ventral. Esto hace que el cerebro para girar, lo que trae los lóbulos cerebrales en contacto directo con el cubreobjetos para facilitar la formación de imágenes (Figura 3F).
  9. Sellar la cámara rodeando el cubreobjetos con pequeñas cantidades de aceite de halocarbono (Figura 3D). El exceso de aceite de la exudación de los cubreobjetos debe reducirse al mínimo y borró de distancia con un pañuelo de papel.

4. Imágenes en vivo de Central Brain neuroblastos

Nota: Para este trabajo, un hilado de disco Nikon Eclipse Timicroscopio confocal (microscopio invertido) se utilizó para la formación de imágenes en vivo; detalles de nuestra instalación se han publicado previamente 31. Alternativamente, la muestra puede ser reflejado usando un sistema en posición vertical.

  1. Añadir una gota de aceite de inmersión para el cubre justo por encima de los cerebros montados. Esto ayudará a centrar el objetivo directamente sobre la muestra.
  2. Paso crítico: Mantener el cerebro a una temperatura constante de 25 ° C con una incubadora de etapa. Coloque suavemente la muestra montada en la incubadora escenario y cubrir la cámara con su tapa.
  3. Localice RN centrales del cerebro con luz transmitida, centrándose en las células grandes y redondos que residen en las zonas central y medial de los lóbulos ópticos y no utilice epi-fluorescencia. Esto se hace más fácil con la práctica. Es muy importante para exponer la muestra a la menor cantidad de luz posible. No pierda tiempo cerebros de imágenes que se encuentren dañados.
  4. Una vez en su lugar, tomar exposiciones rápidas utilizando el confocal paradeterminar la ubicación y profundidad adecuada. Límite de profundidad a la primera 10-15 micras. Ajuste según sea necesario, y tomar otra imagen de prueba.
    1. Paso opcional: Se recoge una película de prueba del cordón nervioso ventral para asegurar que no hay deriva xy. Si se detecta la deriva, espere 15-30 minutos para la muestra a un acuerdo. Si la tendencia no se asienta en 30 min, preparar una nueva muestra. Major deriva generalmente se remonta a la adición de un exceso de aceite, o el tamaño desigual de aceite cae durante el montaje.
  5. Para eliminar la deriva axial (z-drift) utiliza un dispositivo de enfoque automático continuo que utiliza un LED infrarrojo. Alternativamente, corregir manualmente el plano focal.
  6. Una vez que se identifica una Nota de interés, continuar con el régimen de formación de imágenes. Al igual que con todas imágenes de células vivas, la cantidad de luz láser, tiempo de exposición, la cámara hurgar en la basura, aumento del objetivo, el tiempo y / o el intervalo z pasos deben ser todas empíricamente optimizado para un experimento en particular para responder a la cuestión que nos ocupa. El objetivo es reducir al mínimo la presa luzedad, mientras que todavía la recogida de datos útiles. Véase la discusión para orientación adicional.
    1. Imagen de todo el volumen de la NB mediante la recopilación de 12-14 imágenes espaciados por 1 m en el eje z. Ajuste la resolución de tiempo para capturar los ciclos de células individuales o múltiples de la misma NB. Como regla general, utilice intervalos de 10-30 seg para la imagen única del ciclo celular y de 1-3 minutos durante varios ciclos celulares.
  7. Paso crítico: Confirme que la muestra es saludable mediante el control de la duración de la mitosis. Si mitosis tarda más de 15 minutos, pasar a otro cerebro. Un cerebro sano mostrará muchas notebooks en el mismo campo de visión de someterse a varias rondas de mitosis. Tenga en cuenta que cada ciclo celular es ligeramente más larga que la anterior debido a daño de la luz.
  8. Una vez que la imagen está completa, desmontar la cámara de incubación, y desechar todo, pero los platos de cultivo permeables al gas. Enjuague la superficie del plato de cultivo con 95% de etanol y limpie bien con un pañuelo de papel. Repita dos veces más.

    5. Preparación de Brains por inmunofluorescencia

    1. Recoger 20 o más explantados cerebros en un tubo de 1,5 ml que contiene aproximadamente 0,2 ml de medio suplementado.
    2. Retire medio del tubo y enjuague cerebros una vez con 0,5 ml de PBSTx (salina tamponada con fosfato, PBS, con 0,3% de Triton X-100). Deje cerebros se depositan en el fondo del tubo entre todos los intercambios de líquido. El detergente de Triton X-100 se utiliza para permeabilizar el tejido. El enjuague normalmente toma menos de 30 segundos; basta con quitar el PBSTx una vez cerebros se han asentado en el fondo del tubo.
    3. Reemplace la solución con 0,5 ml de un 9% de electrones paraformaldehído grado microscopía diluido en PBSTx. Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente.
    4. Deshágase de fijador de acuerdo a las regulaciones de desechos peligrosos.
    5. Lavar las muestras con 0,5 ml de PBSTx durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBSTx fresca dos veces más.
    6. Reemplace la solución con 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albúmina de suero bovino (BSA), y 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente. Bloquea el unión no específica de anticuerpos contra el tejido de este paso.
    7. Reemplazar la solución con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido en PBT suplementado con 4% de suero de cabra normal (NGS). Incubar con nutación noche a 4 ° C.
    8. Deseche o guardar el anticuerpo primario diluido.
    9. Lavar las muestras con 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBT fresca dos veces más.
    10. Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBT modificado (PBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween-20, y 4% de NGS). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente.
    11. Reemplace la solución con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido en PBT modificado. Incubar con nutación durante 2 horas a temperatura ambiente.
    12. Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado con PBST fresca dos veces más.

    1. Transferir cuidadosamente las muestras como una gota en un portaobjetos de vidrio, la restricción de la caída hacia la izquierda del centro de la corredera.
    2. Añadir una gota grande (alrededor de 2 cm de diámetro) de medio de montaje (por ejemplo, Aqua-Poly/Mount) al centro de la corredera. Evitar la piscina de PBST que es hacia la izquierda.
    3. El uso de fórceps para transferir los cerebros de la piscina de PBST a la piscina de medio de montaje. Adición de medio de montaje directamente sobre el cerebro puede alterar su orientación y se debe evitar.
    4. Bajo un microscopio de luz, disponer las muestras en el medio de montaje con la parte que será reflejado hacia arriba.
    5. Con el portaobjetos bajo el microscopio de luz, baje lentamente un cubreobjetos de vidrio # 1.5 en la parte superior de las muestras. Paso opcional: Desalojar las burbujas de aire de menor importancia presionando ligeramente sobre el cubreobjetos.
    6. Dejar que el medio de montaje para polimerizar durante varias horas, o durante la noche, por las diapositivas que miente completamente, la luz-protegida, a temperatura ambiente.
    7. Los portaobjetos pueden tomarse imágenes al día siguiente, o se almacena antes de la imagen.

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Representative Results

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Formación de imágenes en vivo ha dilucidado una serie de mecanismos que regulan NB ACD. Antes de la adquisición de la imagen, es necesario determinar las condiciones óptimas de formación de imágenes. Es necesario equilibrar la tasa de captura de imágenes con la duración de imágenes de células vivas. Para el análisis celular fina, por ejemplo, aumentó temporal y la resolución óptica puede ser requerida. Cuando la visualización de un solo ciclo celular NB (Figura 4A), la velocidad a la que se capturan las imágenes puede incrementarse sin introducir fotodaño. Por lo general, los eventos individuales de la división celular pueden ser monitoreadas en aproximadamente 10 a 30 intervalos de tiempo seg. Una forma de aumentar la resolución temporal sin dañar el tejido es para modular la tasa de adquisición de la imagen. Por ejemplo, time-lapse puede iniciarse a una velocidad más baja, que se incrementó luego de la observación de una característica interesante o punto (Película 1) hora.

Imágenes sucesivas rondas de división celular ( (Figura 4B). Por lo general múltiples imagen (dos o más) rondas de ACD a través de todo el volumen de la celda NB en 1-3 min intervalos de tiempo durante un período de 2-3 horas. Tanto la resolución temporal y el período de adquisición de imágenes pueden ser mejoradas mediante la limitación de la cantidad de luz que golpea la muestra. Por ejemplo, time-lapse de divisiones sucesivas NB se puede extender en exceso de 8 horas si sólo un único plano óptico se forma la imagen. Una selección de líneas transgénicas particularmente útiles para el estudio de NB ACD está en la lista (Tabla 1) 16, 31, 34-38.

Para el análisis de gran número de muestras, a menudo es necesario para analizar NBS fijos. Nuestro protocolo de fijación conserva la morfología general de la NBS y es compatible con los ensayos de inmunofluorescencia (Figuras 4C-4E). Whole brai montaje fijons pueden obtener imágenes a bajo aumento (Figura 4 C) para visualizar el tamaño total del cerebro y la forma de detectar o RN. Para visualizar los RN o sus GMCs progenie con más detalle, se debe utilizar un aumento mayor. En ampliación moderada (Figura 4D), se pueden observar grupos enteros NB linaje. Para el análisis celular detallada, un aumento mayor se utiliza (Figura 4E).

Figura 1
Figura 1. Explantar cerebros enteros de imágenes de células vivas de NB ACD. A) El sistema nervioso central larval consta de dos lóbulos ópticos y un cordón nervioso ventral. Dos subtipos de RN pueblan el lóbulo óptico en posiciones estereotipadas:. Tipo I (azul oscuro) y tipo II (azul claro) B) NB someten ACD. Con cada división celular, laNB escinde para dar lugar a un GMC (o INP, no presentados) y regenera las células madre NB. GMC dividirá para dar lugar a dos neuronas (o glía, que no se muestra). C) dos herramientas de microdisección se ensamblan mediante la inserción de los pins de disección en los soportes de pasador. Doblan las patas, crea herramientas únicas, un bisturí y un gancho, que se utilizan para cortar, perforar, y desplazar el tejido no deseado sin dañar el cerebro subyacente. D) Los cerebros se explantaron en uno de dos grupos de medios de disección (círculos azules). Una piscina de medio se utiliza para eliminar el sistema nervioso central de las larvas (disección bruto), y el otro de la piscina se utiliza para bien microdisección de tejidos periféricos de los cerebros explantados (disección fina).

Figura 2
Figura 2. Preservación de la morfología del cerebro durante la microdisección. disección cerebral Hasty puede inducir daño tisular severo que incluye (A) rasgados cordones nerviosos ventrales o (B) distorsionadas lóbulos ópticos. Aún más sutil daño tisular (B ') se debe evitar por imágenes de células vivas. (C) Un ejemplo de una muestra de tejido sano adecuado para imágenes en vivo. D) una membrana permeable a los gases ópticamente clara. E) Una colección de varios cerebros sanos dispuestos en el cultivo de medio en un plato permeable a los gases. Estos cerebros están listos para ser montados para microscopía. Barra de escala: (AC), 100 m; (D), 25 mm; (E) 1 mm.

Figura 3
Figura 3. Cerebros de imágenes de células vivas de montaje. A) Cerebros están alineados en filas dentro de una gota de medio de cultivo depositado en el centro del plato. B) La gota de medio está rodeado por gotas de aceite de HC de aproximadamente igual volumen. Los cuatro gotas de aceite de HC y la caída central del medio se parecen a las cinco facetas de jugar a los dados. Después de un cubreobjetos se baja sobre las gotas de aceite, (C) una mecha se forma a partir de tejido KIMWIPE y se utiliza para absorber el exceso de líquido. D) El borde exterior de la cubreobjetos está rodeada por una capa delgada de aceite para detener la evaporación del medio de cultivo. Estos cerebros están ahora listos para la microscopía. E y F) La orientación del cerebro en relación con el cubreobjetos determina que los neuroblastos son accesibles para imágenes de células vivas. E) neuroblastos dorsales son reflejados por la organización de los cerebros con el lado ventral tocar la membrana permeable a los gases . F) neuroblastos antero-ventral pueden ser reflejados por arranging los cerebros con el lado dorsal de tocar la membrana permeable a los gases y a continuación, empujando el cubreobjetos, y el tejido subyacente, en la dirección de las puntas de cordón nervioso ventral. Este movimiento se inclina ligeramente los lóbulos ópticos de tal manera que los contactos de la superficie-Antério dorsal del cubreobjetos, con lo que el eje de proyección de imagen deseados en perfecta alineación (línea verde).

Figura 4
Figura 4. Los resultados representativos de las imágenes en directo de neuroblastos en división. A y B) de imágenes en vivo de NB frenar las divisiones celulares en preparaciones de todo el montaje con un 40X, 1,3 NA objetivo de inmersión en aceite. La hora se muestra como min: seg con respecto al comienzo del lapso de tiempo A) Stills de time-lapse de un solo ciclo celular de un NB expresando GFP-Moesin.(GFP-Moe). La tasa de adquisición de imagen de un solo ciclo celular puede aumentarse para mejorar la resolución temporal sin provocar daño solar. B) Stills de time-lapse de los sucesivos ciclos de división celular de un NB expresan tanto las buenas prácticas agrarias-Moe y un marcador centrosoma GFP-etiquetados. El período prolongado asociado con múltiples ciclos celulares requiere resolución temporal reducida para evitar el fotodaño. Tenga en cuenta que la longitud de tiempo entre cada división celular aumenta durante el curso de formación de imágenes. CE) proyecciones confocal de células madre a partir de preparaciones fijas todo el montaje. C)) a la imagen de todos los RN se encuentran en ambos lóbulos ópticos, se utiliza la ampliación 20X. Este análisis es particularmente útil para examinar la morfología general del cerebro y cuantificar los números NB (azul claro), etc. D) La mayoría de los RN (rosa) de un lóbulo óptico solo se puede visualizar con un aumento de 40X. Los microtúbulos (en verde). E)

Película 1. Imágenes en vivo de un único ciclo celular NB. Imágenes lapso de tiempo de una sola división celular NB de un cerebro que expresan GFP-Moe para etiquetar la corteza celular. Las imágenes fueron adquiridas a partir de un solo plano óptica a 40 aumentos. En esta película, los marcos fueron capturados cada 15 seg. Después de unos 7 minutos de la adquisición, la tasa se ​​incrementó a un fotograma cada 5 seg. Haga clic aquí para ver la película.

Película 2. Imágenes en vivo rondas sucesivas of NB ACD. imágenes con lapso de tiempo de un NB sometidos a tres rondas de división celular en un cerebro que expresan GFP-Moe y un marcador centrosoma GFP-etiquetados. Las imágenes fueron adquiridas en 2 intervalos de tiempo min a 60X de aumento. Haga clic aquí para ver la película.

Línea Estructura Celular Etiquetada Fluoróforo Expresión / Promotor Citación
YFP-Asterless Centriolo YFP La ubiquitina Rebollo, et al. (2007) Dev.. . Móvil 12: 467.
SAS6-mCherry Centriolo mCherry Endógeno Rusan y Peifer (2007) J. Cell. 177
GFP-SAS6 Centriolo GFP Endógeno (BAC) Lerit y Rusan (2013) J. Cell Biol. 202:. 1013.
GFP-PACT Centriolo GFP La ubiquitina Martínez-Campos, et al. J. Cell Biol. 165:. 673.
GFP-SAS4 Centrosoma GFP La ubiquitina Dix y Raff (2007) Curr. . Biol. 17: 1759.
GFP-Polo Centrosoma GFP Endógeno . Moutinho-Santos et al (1999) Cell Biol. 91:. 585.
GFP-γ-tubulina 23C Centrosoma GFP La ubiquitina Lerit y Rusan (2013) J. Cell Biol. 202:. 1013.
GFP-Centrosomin Centrosoma GFP UAS Megraw, et al. (2002) J. Cell Sci. 115:. 4707.
GFP-Spd-2 Centrosoma GFP La ubiquitina Dix y Raff (2007) Curr. . Biol. 17: 1759.
mCherry α-tubulina Los microtúbulos mCherry La ubiquitina Rusan y Peifer (2007) J. Cell Biol. 177:. 13.
GFP-α-tubulina Los microtúbulos GFP La ubiquitina . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol. 2:. E8.
Jupiter-GFP ("G147") Los microtúbulos GFP Endógeno Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-Júpiter Microtúbuloss mCherry UAS Cabernard y Doe (2009) Des. Teléfono 17: 134.
H2AvD-mRFP ADN mRFP Endógeno Pandey, et al. (2005) J. Cell Sci. 118:. 733.
-GFP H2AvD ADN GFP Endógeno Clarkson y santo (1999) DNA Cell Biol. 18:. 457.
Moesin-GFP Actina cortical GFP Calabaza de espagueti Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol. 149:. 471.

Tabla 1. Una selección de líneas transgénicas útiles para el estudio de la ACD. Estas construcciones de fusión son particularmente útiles para estudiar la división celular. Se utilizan habitualmente en NB estudios de imagen en vivo.

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Discussion

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Imágenes de células vivas es un enfoque inestimable utilizado para estudiar los mecanismos que regulan ACD de las células madre, la diferenciación de los linajes de células, y la morfogénesis de tejidos complejos. Aunque los grupos de investigación han utilizado históricamente una variedad de técnicas para visualizar NB ACD, estos enfoques pueden ser generalmente se agrupan en dos categorías que difieren principalmente con respecto a si el tejido cerebral se deja intacta o disociado.

Imaging disociado RN tiene sus ventajas. Por un lado, disociadas NBS son más fáciles de imagen, ya que son especialmente fáciles de identificar como las células más grandes (alrededor de 12 m de diámetro) en un plato de cultivo. Además, casi todas las células madre que son cultivadas en una superficie de vidrio serán igualmente cerca del objetivo del microscopio durante todo el período de adquisición de imágenes. La calidad óptica de imágenes con lapso de tiempo se mejora aún más con el uso de cualquiera de poli-L-lisina o fibrinógeno de vidrio recubierto para inducir la SEMi-aplanamiento de la ronda RN 16, 17. Otra de las ventajas de formación de imágenes NBS disociadas que crecen en cultivo es la facilidad con la que medio de cultivo puede ser intercambiado. Una vez que las células se adhieren a la superficie de vidrio revestido, el cultivo de medio que contiene cualquier número de agonistas farmacológicos, antagonistas o anticuerpos immunoblocking, etc. puede ser añadido o eliminado. Finalmente, los últimos enfoques para visualizar NBS disociadas han demostrado que esta técnica es, de hecho, susceptibles de adquisición de imagen prolongada 18, 19.

Sin embargo, las desventajas de formación de imágenes disociadas NBS incluyen la complejidad del protocolo. La mayoría de los métodos detalle larga (30-60 min) la digestión química, seguida de una etapa de incubación largo (60 min) para permitir que las células dispersas se asienten y se adhieren a la placa de cultivo 17, 19.

Por el contrario, los RN de imagen de un cerebro intacto conserva tanto lacontexto fisiológico y la morfología del tejido. Las ventajas de este enfoque incluyen la capacidad de identificar linajes NB específicos que se desarrollan en arreglos estereotipadas o en momentos de desarrollo definidas 1. Por lo tanto, nuestro protocolo simplificado tiene utilidad que se extiende más allá de los estudios de ACD, ya que también permite la investigación en vivo de eventos de diferenciación y la morfogénesis. Una desventaja de este método, sin embargo, es la incapacidad para intercambiar el cultivo de medio. Por lo tanto, los investigadores interesados ​​en la proyección de imagen a largo plazo de las divisiones sucesivas de células madre deben considerar el enfoque (cultivo primario disociado contra todo el montaje) que mejor se adapte a su aplicación. Del mismo modo, la necesidad de aditivos de cultivo, como la insulina o suero, se debe determinar empíricamente en base a las condiciones de la imagen (la duración de la proyección de imagen, la cantidad de luz que llega a la muestra, etc.) Y la configuración experimental.

En general, le recomendamos que utilice disocianNB d para los estudios en los que es necesario evaluar la respuesta aguda de RN a la introducción de pequeñas moléculas (por ejemplo, inhibidores, etc.), para aplicaciones de alto rendimiento cuando bien microdisección de cerebros pueden resultar demasiado complejos, y para los estudios de imagen avanzadas que requieren que el NB para estar en contacto físico con el cubreobjetos. Por el contrario, le recomendamos que utilice los cerebros intactos para las aplicaciones en las que es útil para la imagen de unos RN del mismo cerebro, y especialmente para los estudios que las interacciones célula-célula preocupación, la autonomía, el análisis clonal, cambios en la forma celular, y otras investigaciones en las que el nativo medio ambiente de las células es importante.

Para asegurar la preparación exitosa de cerebros intactos para imágenes en vivo, varios pasos críticos deben ser cuidadosamente ejecutados. Ante todo, es imperativo evitar la exposición del tejido a un trauma innecesario. Específicamente, la explantación el cerebro y la eliminación de los tejidos periféricos se debe realizar con cuidado. Unodebe minimizar el contacto directo entre las herramientas de disección y el cerebro. Además, se debe evitar tirar o tirando de tejido adherida al cerebro. El mal manejo del tejido fácilmente pueden dar lugar a cerebros rotos o distorsionados. En nuestras manos, los RN de cerebros dañados rara vez se dividen. Los individuos que son nuevos en la disección del cerebro de larvas a menudo se benefician de dominar la disección antes de intentar preparar muestras para imágenes en vivo.

Otro paso fundamental en el protocolo es el montaje de los cerebros antes que vivir de imágenes de células. Los volúmenes correctos tanto de medio de cultivo y el aceite de HC son esenciales para completar una preparación útil. Aunque es difícil de medir con precisión el aceite HC viscoso con una pipeta, se puede aproximar el volumen correcto (aproximadamente 30 l) por ojo. El exceso de líquido impide que el cubreobjetos se asiente en su lugar. A menudo, esto resulta en los cerebros en movimiento en la superficie de la placa de cultivo. Durante una imagen en vivo, un cubreobjetos sin resolver es evimella cuando las derivas de tejido o el rollo de los lóbulos ópticos. Las muestras que no se colocan en su lugar deben ser evitados. Por el contrario, la adición de demasiado poco medio de cultivo o el empleo de aceite de HC en el daño tisular catastrófico, incluyendo los lóbulos ráfaga óptica. Hay un cuidadoso equilibrio entre el uso de suficiente medio líquido y aceite para soportar el peso del cubreobjetos contra el uso de demasiado líquido, que hace que el cubreobjetos se deslice. Este equilibrio se aprende mejor a través de la práctica. En general, lo mejor es sólo la imagen esos cerebros que tienen una morfología saludable, como un cordón nervioso ventral intacto y, lóbulos ópticos redondos simétricos.

Una vez que la muestra se monta sin deriva detectable, manteniendo viva la muestra se convierte en el siguiente aspecto crítico de este protocolo. Esto se logra mejor mediante el mantenimiento de la temperatura adecuada y, lo más importante, lo que minimiza la cantidad de luz que incide en la muestra. La configuración del microscopio y la muestra son las dos variables que regirán el éxito de live imágenes de células. Los objetivos de alta calidad, los filtros de transmisión (~ 98%), y las cámaras (electrones back-adelgazado multiplicar y semiconductor de óxido metálico complementario) en el lado de emisión permitirán a uno para reducir la cantidad de luz que incide en la muestra en el lado de excitación. Es bien sabido que la luz azul (utilizado para la imagen GFP) es altamente tóxico para las células. Hay que determinar la cantidad de luz total (tiempo de exposición total) de una muestra dada puede tolerar y que luego se extendió a lo largo del tiempo total de duración del experimento. Por ejemplo, si una muestra sólo puede tolerar 500 exposiciones a la luz láser sobre la base de una configuración de microscopio en particular, entonces se podría recoger pilas de 50 x 10-rebanada. Estas pilas pueden estar espaciados por 1 min para recoger un solo ciclo celular NB, o 2-3 minutos para recoger ~ 3 ciclos celulares. Además, la optimización de la configuración para cada genotipo es fundamental para imágenes en vivo éxito. Durante el período de optimización, un buen punto de partida para la potencia del láser 488 nm es de 25-50 mW que emana de un 100X, 1,4 NA y# 160; objetivo de inmersión en aceite. Por último, hay que determinar qué condición imagen responderá correctamente a la pregunta que nos ocupa, ya que no siempre es el caso de que se necesite la imagen más sofisticada.

Para los experimentos con tejido vivo o fijo, se pueden montar cerebro con el fin de imagen linajes NB específicos. Por ejemplo, con el fin de Tipo II imagen NBS, que residen en Típico de la región-posterior medial del lóbulo 7 óptica, uno podría montar los cerebros, como se ilustra en la Figura 3E. Debido a que el patrón espacial y temporal de NBS centrales del cerebro han sido bien documentados 1, se puede usar el protocolo de imagen de una variedad de grupos específicos NB, mientras que la utilización de cualquier número de las construcciones transgénicas ampliamente disponibles que se expresan bajo ubicua o, idealmente, promotores endógenos (Tabla 1). No obstante, las tecnologías de etiquetado linaje específico de 20 siguen siendo útiles para un número de aplicaciones.Con el análisis fija, cerebros con daños menores son generalmente aceptables. Además, la eliminación completa del tejido periférico puede posponerse hasta justo antes de la incrustación de los cerebros en medio de montaje. Los estudios realizados con tejido fijado son particularmente útiles cuando un gran número de RN deben ser reflejados.

En conclusión, los estudios de NB ACD se han beneficiado enormemente de la utilización tanto de imágenes de células vivas y el análisis detallado fijo. El protocolo descrito aquí Detalle un método para preparar las larvas de Drosophila para aplicaciones, ya sea en vivo o fijos. Anticipamos la investigación continuada de NB ACD a través de estudios detallados de imagen revelará nuevos y excitantes resultados que hagan avanzar nuestra comprensión de las células madre en el desarrollo y la enfermedad. La aplicación de imágenes en vivo a largo plazo del cerebro de larvas intactas tiene el potencial para descubrir nuevos conocimientos sobre la secuencia temporal de los acontecimientos de diferenciación y morfogénesis que rigen el desarrollo (y degeneraciónración) del sistema nervioso central.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la división de investigación intramural en los Institutos Nacionales de la Salud / NHLBI (1ZIAHL006126) y un Lenfant Biomédica beca posdoctoral adjudicados a DAL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

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References

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Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos
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Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

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