Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Canlı Görüntüleme doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Abstract

Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler.

Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında 1, 2 sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre 3'ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan.

Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) 4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin 7 her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini 5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek.

INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC 4 üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar.

NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB'ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var.

Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay 8 bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı 9 beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar 8 veya agaroz pedleri 9 ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için 10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla 11-14 kullanılmaktadır.

Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme 16 fibrinojen ve trombin 15 karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler 17, 18, ​​kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler 18 için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol 19 ayrıntılı olmuştur.

Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin 1 düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın 21 kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir.

Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu 22, 23, belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma 22 kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB'ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD.

Görüntüleme ayrışmış NB'ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva 24 izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik 25 bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme 24, 26-28 için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme 29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.).

Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme 30, 31 canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi 32 ve Drosophila yumurtalık 33 toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Malzemeler Gerekli hazırlanması Üçüncü Instar Larva Brain eksplantasyona

  1. Mikrodiseksiyon için gerekli araçları hazırlamak.
    1. Öncelikle her pim yuvasına bir tek diseksiyon pimi koyarak iki diseksiyon araçları (bir neşter ve bir kanca) kurma. Elle veya pense (Şekil 1C) ile sıkıca işaretçilerine sabitleyin.
    2. Yaklaşık 120 ° açı bir diseksiyon pin bükmek için eski bir çift forseps kullanın. Pim tutucu elinde olduğunda pimin üst yarısı düz yatıyor sağlamak için bir mikroskop altında bunu yapın. Bu araç, basılı veya doku yoluyla dilim bir neşter olarak kullanılacaktır.
    3. Tutun ve doku kazımak için kullanılan bir kanca içine ikinci pimi bükmek için eski bir çift forseps kullanın.
    4. Hasardan araçları korumak için bir pipet ile her kesme aletini örtün. Bakım, iyi-oluşturulmuş araçları süresiz diseksiyon için kullanılabilir. Gerektiğinde hasarlı veya deforme işaretçilerine değiştirin.
    </ Li>
  2. Orta diseksiyon hazırlayın.
    1. Bir doku kültürü kaputu, Schneider'in kültür ortamı içine antibiyotik-antimikotik ek sulandırmak. Ek dahil medyayı girdap.
    2. Takviye edilmiş ortam bir çok 5 ml'lik numuneler hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de tüm medya saklayın.
    3. Oda sıcaklığına kadar takviye edilen ortam içinde, 5 ml'lik bir şişe ısıtın. Steril bir 5 ml şırınganın içine orta çizin ve bir steril 0.2 mikron şırınga filtresi üzerindeki vida.
  3. Diseksiyon için larva seçin. Beyin incelemek için kolay olacak gibi sürünerek üçüncü larva evresindeki seçmek için bir diseksiyon prob kullanın. İsteğe bağlı: Bir üzüm agar plaka üzerinde mevduat larvalar.
    Not: Bu erken dışarı tarama için ikinci veya birinci larva evresindeki zorlamak eğilimi olarak "ıslak gıda," ile aşırı kalabalık şişeleri veya şişeleri kullanmayın.
    Not: Bazı genetik arka genç larvaları kullanılarak gerektirecek. Bu protokol etkilemez, ama d yapmak yokissection daha zor.

Merkezi Sinir Sistemi 2. Diseksiyon

  1. Tek bir cam slayt üzerine, yaklaşık 3 cm ayırarak sıcak diseksiyon medyanın iki 50 ml havuzu oluşturun. Bir havuz ince diseksiyon (Şekil 1C) için kullanılan brüt diseksiyon ve diğer için kullanılacaktır.
  2. Ortam damla birine çeşitli larva aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskop larvaları ile lamel taşıyın. Larvaların ön ve arka uçlarının fark edilebilir olduğu bu tür larvaları ihtiva eden havuza büyüt.
  4. Tek bir larva orta bölgeyi kavramak için forseps bir çift kullanın. Öte yandan forseps ikinci bir çift almak ve aynı bölgeye yakın larva kavramak. Yavaşça yarısında larva gözyaşı ayrı forseps iki çift çekin. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın.
  5. Bir dokuya aktararak larva vücudun posterior yarısı atmayın.
  6. Bir larva yakınlaştırmak inci böyleceE anterior mouthhooks açıkça görülebilir. Üçüncü torasik ve birinci ön denticle bantlar arasındaki larva mouthhooks ters tarafta küçük bir kesik veya çentik oluşturmak için forseps iki çift kullanın.
  7. Baskın olmayan el forseps ile mouthhooks kavrayın. Nazikçe bir ön-to-posterior yönde manikür soyulmaya, diğer yandan forseps kullanın. Merkezi sinir sistemi ortaya çıkıncaya kadar yavaş yavaş manikür soyulmaya devam ediyor.
  8. Dokular forseps ile yırtılarak larva geri kalanından merkezi sinir sistemine izole edin. Merkezi sinir sistemini bozmayacağı dikkatli kullanın.
    Kritik adım: merkezi sinir sistemi üzerinde çekmeyin! Yırtık bir ventral sinir kablosu (Şekil 2A) veya bozuk optik loblar (Şekil 2B ve 2B ') ile hasarlı örnekleri atın.
  9. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Için sağlıklı eksplante doku aktarınince diseksiyon aşaması için lamel orta ikinci (temiz) havuz.
  10. Beyinden periferik dokuyu (örneğin, göz, kanat ve bacak diskler) temizlemek için diseksiyon pin araçlarını kullanın. Coverglass için bağ dokusu çivileme, istediği (beyin) ve istenmeyen doku arasındaki neşter kaydırın. Aynı anda testere gibi hareketlerle lamel neşter basarken hafifçe istenmeyen doku uzak kızdırmak için kanca kullanın.
  11. Kritik adım: Her beyinden gelen tüm diskleri kaldırmak için yavaş yavaş ve bilinçli çalışın. Beyin morfolojisini rahatsız dikkatli kullanın. Sağlıklı bir beyin bozulmamış bir ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu (Şekil 2C) sahip olacaktır.

3.. Canlı Görüntüleme Brain Eksplante Montaj

  1. (Şekil 2B) yukarı bakacak net film ile 50 mm gaz-geçirgen kültür çanak ters çevirin. T ortamı üzerine küçük bir damla (yaklaşık 30 ul) biriktirilmesi için şırıngayı basınızyemeğin o merkezi.
  2. Çanak orta damlasına kadar izole edilmiş beyinleri, bir defada, aktarın. Optik lobu altında bir beyin kaldırsanız kanca aracını kullanın. Alternatif olarak, ventral sinir kablosu uzanan aksonları kavramak için forseps kullanabilir.
  3. Orta damla 5-10 beyinleri toplayın. Birçoğu gibi orta damla dibine tek beyinleri itmek için kesme pim araçlarını kullanarak beyinleri daldırın menisküs (Şekil 2E) tuzak olacaktır.
  4. Yansıması için NB'ler (Şekil 3A) bağlı olarak beyin hizalamak için diseksiyon pin araçlarını kullanarak beyinlerini yönlendirin. Görüntü dorsal Onaylanmış, (membran boyunca) aşağı bakacak ventral sinir kablosu yerleştirin. Görüntü anterio-ventral NBs, (uzakta membran) yukarı bakacak ventral sinir kablosu ile beyinleri yerleştirin. Tüm ventral sinir kordonları xy düzlemi içinde aynı yöne işaret etmektedir, öyle ki beyin hizalayın.
  5. Bir şırınga ya da plastik transferi p kullanipette gaz geçirgen zar üzerine 4 halokarbon (HC) yağ damlaları (yaklaşık 30 ul her) yerleştirmek için. Petrol her damla hacmi birbirine ve orta damla eşdeğer olmalıdır. Uzay yağı damla kültür ortamının damla etrafında bir lamel dört köşesine tekabül edecek şekilde. Tamamlandığında, beş damla (yağ dört damla ve merkezi orta biri damla) Batı-tarzı zar (Şekil 3B) beş yönleriyle benzer olacaktır.
  6. Bu aynı zamanda tüm 5 damla vurur şekilde montajı üzerinde bir # 1.5 22 mm lamel indirin. Örneklerin arasında eşit bir basıncın korunması da bozulacak olasılığını azaltır. Yağ ve orta lamel ağırlığı altında dağıtmak üzere yaklaşık 3 dakika bekleyin. Bir ortam çapraz-benzeri şekil (Şekil 3C ve 3D) oluşturacaktır.
  7. Kritik adım: ince kağıt fitil (Figu kullanarak fazla ortamı kaldırarak beyinlerinin yüzeyi üzerine lamel Alt) 3C yeniden. Diseksiyon kapsamında örnek izlerken bunu. Ortam çıkarılır olarak, lamel daha düşük olacaktır. Lamel beyinleri dokunduğunda durdurun. Aşırı-fitil bu doku bozulması ya da beyin patlamalara neden olacak gibi.
  8. Görüntüleme dorsal Onaylanmış (Şekil 3E), 3.9 adıma taşıyın. Görüntüleme anterio-ventral Onaylanmış ise, lamel biraz ventral sinir kablosu ipuçları yönünde (forseps ile yavaşça onu dürtmek) taşınmalıdır. Bu görüntüleme (Şekil 3F) kolaylaştırmak için lamel ile doğrudan temas halinde beyin lobları getiren döndürmek için beyin neden olur.
  9. Halokarbonlu bir yağ (Şekil 3D), az miktarda lamel çevreleyen ile odası kapatın. Lamel sızma aşırı yağ küçültülmüş ve bir doku ile uzak lekelenen edilmelidir.

Central Brain neuroblasts 4. Canlı Görüntüleme

Not: Bu çalışma için, bir Nikon Eclipse Ti dönen diskkonfokal mikroskop (ters mikroskop) canlı görüntüleme için kullanılan; Bizim kurulum detayları önceden 31 yayınlanmıştır. Alternatif olarak, numune, bir dik sistemi kullanılarak görüntülenebilir.

  1. Sadece monte beyinleri üzerinde lamel daldırma bir damla yağ ekleyin. Bu, numunenin doğrudan üstünde amaç merkezi yardımcı olacaktır.
  2. Kritik adım: bir sahne kuluçka 25 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta beyinleri koruyun. Yavaşça aşama inkübatör içine monte edilmiş örnek pozisyon ve kapak ile odasını kapsamaktadır.
  3. Optik lobların merkez ve medial alanlarda ikamet büyük, yuvarlak hücreler odaklanarak iletilen ışık kullanarak merkezi beyin Onaylanmış bulun; epi-floresan kullanmayın. Bu uygulama ile daha kolay olur. Bu, mümkün olduğu kadar hafif olan en az miktarda için örnek göstermek için çok önemlidir. Zarar zamanlı görüntüleme beyinleri israf etmeyin.
  4. Bir kez yerinde, konfokal kullanarak hızlı çekimlerininUygun yeri ve derinliği belirler. Ilk 10-15 mikron derinlik sınırlayın. Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntü almak.
    1. İsteğe bağlı adım: hayır xy kayma olmadığından emin olmak için ventral sinir kablosu bir test film toplayın. Sürüklenme tespit edilirse, yerleşmek için numune için 15-30 dakika bekleyin. Sürüklenme 30 dakika razı değilse, yeni bir örnek hazırlamak. Binbaşı sürüklenme genellikle aşırı yağ ilave geri takip edilebilir, ya da yağ eşitsiz boyutu montaj sırasında düşer.
  5. Eksenel kayması (z-drift) ortadan kaldırmak için bir kızılötesi LED kullanan bir sürekli otomatik odaklama aygıtı kullanın. Alternatif olarak, elle odak düzlemi düzeltin.
  6. Ilgi konusu bir NB tanımlanır, görüntüleme rejimi ile devam edin. Tüm canlı hücre görüntüleme, lazer ışık miktarı, maruziyet süresi, kamera binning, objektif büyütme, zaman ve / veya z-adım aralığı ile tüm ampirik eldeki soruyu cevaplamak için belirli bir deney için optimize edilmelidir. Amacı ışık baraj en aza indirmek içinyaş iken yine de yararlı veri toplama. Ek rehberlik için açıklamalara bakın.
    1. Resim z-ekseninde 1 mikron aralıklı 12-14 görüntüleri toplayarak NB tüm hacmi. Aynı NB bir veya birden fazla hücre döngüsü yakalamak için zaman çözünürlüğü ayarlayın. Genel bir kural olarak, tek bir hücre döngüsü görüntüleme ve birden fazla hücre döngüsü için 1-3 dakika için 10-30 saniye aralıklarla aralıkları kullanın.
  7. Kritik adım: örnek mitoz süresini izleyerek sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz fazla 15 dakika sürer, başka bir beyin geçmek. Sağlıklı bir beyin mitoz birkaç tur geçiren görüş aynı alanda bulunan birçok Onaylanmış gösterecektir. Her bir hücre döngüsü nedeniyle ışık hasarına biraz daha uzun bir öncekinden daha olduğuna dikkat edin.
  8. Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyon odası sökmeye ve gaz geçirgen kültürleme yemekler ama her atın. % 95 etanol ile kültür çanak yüzeyi durulayın ve bir doku ile de silin. Iki kez daha tekrarlayın.

    Immünofloresans için Brain 5. Hazırlanması

    1. Takviye edilen ortam içinde yaklaşık 0.2 ml ihtiva eden 1.5 ml tüp içine 20 ya da daha fazla eksplante beynini toplayın.
    2. Tüpten Ortamı çıkarın ve (% 0.3 Triton X-100 ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) 0.5 ml PBSTx ile bir kez beyinleri yıkayın. Beyin sıvının tüm değişimleri arasında tüpün dibe olsun. Triton X-100, deterjan doku nüfuz edilebilir kılınması için kullanılmaktadır. Genellikle durulama en az 30 saniye sürer; beyin tüpün dibine yerleşmiş bir kere sadece PBSTx çıkarın.
    3. PBSTx içinde seyreltilmiş% 9 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehidin 0.5 ml çözelti değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın.
    4. Tehlikeli atık yönetmeliklerine göre sabitleştirici bertaraf edin.
    5. 15 dakika boyunca 0.5 ml PBSTx ile örnekleri yıkayın. Taze PBSTx iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.
    6. 0.5 ml PBT (PBS, 1 ile çözüm yerine% Bovine Serum Albumin (BSA) ve% 0.1 Tween-20). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. Bu adım, blok dokuya antikorun spesifik olmayan bağlanma.
    7. % 4 normal keçi serumu (NGS) ile desteklenmiş PBT içinde seyreltilmiş 0.5 ml birincil antikor ile çözüm değiştirin. 4 ° C de bir gece nutation ile inkübe
    8. Seyreltilmiş primer antikor atın veya kaydedin.
    9. 15 dakika boyunca 0.5 ml PBT ile örnekleri yıkayın. Taze PBT iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.
    10. 0.5 modifiye PBT ml (PBS,% 2 BSA,% 0.1 Tween-20 ve% 4 NGS) ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın.
    11. Tadil edilmiş PBT ile seyreltilmiş 0.5 ml ikincil antikor ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca nutation kuluçkalayın.
    12. (% 0.1 Tween-20 ile PBS) 0.5 ml PBST ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. Taze PBST'de iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.

    1. Dikkatlice slayt merkezinin soluna doğru sınırlayan damla bir cam slayt üzerinde bir damla olarak örnekleri aktarın.
    2. Slaydın merkezine monte orta büyük bir düşüş (çapı yaklaşık 2 cm) (örneğin, Aqua-Poly/Mount) ilave edin. Sola doğru olan PBST havuz kaçının.
    3. Montaj orta havuzuna PBST havuzundan beyinleri aktarmak için forseps kullanın. Beyinleri üstüne doğrudan montaj orta ekleyerek kendi yönünü bozabilir ve kaçınılmalıdır.
    4. , Bir ışık mikroskobu altında, yukarı bakacak görüntüsü olacak yüzü montaj ortamı içinde örnekleri düzenlemek.
    5. Işık mikroskobu altında sürgü ile, yavaş yavaş örneklerin üstünde bir # 1,5 daha düşük bir cam lamel. İsteğe bağlı adım: hafifçe lamel iterek küçük hava kabarcıklarını yerinden oynatın.
    6. Montaj orta slaytlar yalan, bir gecede birkaç saat veya polimerize düz, ışık ver, oda sıcaklığında, koruma.
    7. Slaytlar bir sonraki gün görüntü verilen ya da önceden görüntüleme için saklanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Canlı görüntüleme, NB ACD düzenleyen mekanizmalar bir dizi açıklamıştır. Önceki görüntü elde etme için, bu uygun görüntüleme koşulları belirlemek için gereklidir. Bu canlı hücre görüntüleme süresi ile kare yakalama hızını dengelemek için gereklidir. Ince hücre analizi için, örneğin, geçici artış ve optik çözünürlük gerekli olabilir. Tek bir NB hücre döngüsü (Şekil 4A) imgelerken, görüntüler yakalanır hangi hızı fotohasar tanıtan olmadan artabilir. Tipik olarak, tek bir hücre bölünmesi olayları, yaklaşık 10-30 saniye zaman aralıklarında izlenebilir. Dokuya zarar vermeden zamansal çözünürlüğü artırmak için bir yolu görüntü elde etme oranı modüle etmektir. Örneğin, zaman atlamalı görüntüleme ardından ilginç bir özellik ya da bir zaman noktasında (Film 1) gözlem sonucu artan düşük bir kare hızında başlatılabilir.

Hücre bölünmesi Görüntüleme ardışık mermi ( (Şekil 4B) yapılır. Bu, tipik olarak birden fazla görüntü, 2-3 saatlik bir süre boyunca 1-3 dakika zaman aralıklarında tüm NB hücre hacmi ile ACD (iki veya daha fazla) tur. Zamansal çözünürlüğü ve görüntüleme elde etme süresi her iki örnek edecek ışık miktarını sınırlandırılması ile iyileştirilebilir. Sadece tek bir optik düzlem görüntülü, örneğin, birbirini takip eden NB bölünmeler zaman atlamalı görüntüleme 8 saat fazla uzatılabilir. NB ACD çalışma için özellikle yararlı transjenik bir seçim (Tablo 1) 16, 31, 34-38 listelenir.

Numunelerin büyük sayılar analiz için, sabit Onaylanmış analiz etmek için çoğu zaman gereklidir. Bizim tespit protokol Onaylanmış genel morfolojisini koruyan ve imünoflüoresan deneylerinde (Şekil 4C-4E) ile uyumludur. Tüm montaj sabit brains genel beyin boyutunu görselleştirmek ve şekil veya Onaylanmış algılamak için düşük büyütme (Şekil 4C) görüntülü olabilir. Daha ayrıntılı olarak Onaylanmış veya onların soyu GOK değerleri görselleştirmek için, daha yüksek bir büyütme kullanılmalıdır. Orta büyütme (Şekil 4D) de, tüm NB soy kümeleri görülebilir. Ayrıntılı hücre analizi için, daha yüksek bir büyütme (Şekil 4E) kullanılır.

Şekil 1
Şekil 1.. NB KHA canlı hücre görüntüleme için bütün beyinleri eksplantasyonu. A) larva, merkezi sinir sistemi, iki optik lob ve bir ventral sinir kablosu oluşur. Onaylanmış iki alt basmakalıp pozisyonlarda optik lobu doldurmak:. Tip I (koyu mavi) ve Tip II (açık mavi) B) Onaylanmış ACD tabi. Her bir hücre bölünmesi ile,GMC bir yol için NB böler (veya Inp gösterilmemiştir) ile NB kök hücre oluşturur. GOK (gösterilmemiş veya glia) iki nöron yol vermek için böleceğiz. C) İki mikrodisseksiyon araçları pin tutucular içine diseksiyon işaretçilerine sokulmasıyla monte edilmektedir. Işaretçilerine Bükme benzersiz bir araç, bir neşter ve Pierce sever, ve altta yatan beyin zarar vermeden istenmeyen doku değiştirmesi için kullanılan bir kanca oluşturur. D) Brain diseksiyon medya (mavi daireler) iki havuzları birine eksplante edilir. Orta bir havuz larvaları (brüt diseksiyon) için, merkezi sinir sistemi kaldırmak için kullanılan ve diğer havuz eksplante beyinlerinde (iyi diseksiyon) periferal dokuların ince mikro-kesim için kullanılır.

Şekil 2,
Şekil 2. PreservMikrodiseksiyon sırasında beyin morfolojisi tirme. Aceleci beyin diseksiyonu (A) yırtık ventral sinir kablosu ya da (B) optik lobu bozuk içeren ciddi doku hasarına neden olabilir. Daha da ince doku hasarı (B '), canlı hücre görüntüleme için kaçınılmalıdır. (C) canlı görüntüleme. D) optik olarak berrak, gaz geçirgen zar. E) gaz geçirgen bir tabak üzerinde kültür ortamı içinde düzenlenmiş çok sayıda sağlıklı beyinlerin bir koleksiyonu için uygun olan bir sağlıklı doku örneğinin bir örnek. Bu beyinler mikroskopi için monte edilmeye hazırdır. Ölçek çubuğu: (AC), 100 mikron; (D), 25 mm; (E) 1 mm.

Şekil 3,
Şekil 3. Canlı hücre görüntüleme için beyinleri Montaj. A) Brains ortamının düşüş yaklaşık olarak eşit hacimde bir yağ HC damlalar ile çevrilidir çanak. B) merkezinde biriken kültür ortamı bir damla içinde sıralar halinde hizalanır. HC yağı ve orta merkezi damla dört damla zar oynama beş yönleriyle benzer. Bir lamel yağın damla üzerine indirilir, sonra, (C), bir fitil Kimwipe doku dışında moda ve buharlaşma durdurmak için aşırı sıvı. D) lamel dış kenarı ince bir yağ tabakası ile çevrilidir sop için kullanılır kültür ortamının. Bu beyinler). Şimdi E ve F mikroskopi için hazır lamel beyin göreceli oryantasyonu. E) dorsal Nöroblastlar gaz geçirgen zar dokunmadan ventral yüzü ile beyinleri düzenleyerek görüntülü Nöroblastlar canlı hücre görüntüleme için erişilebilir belirler . F) Anterior-ventral Nöroblastlar arr tarafından görüntülü olabilirdorsal yan ventral sinir kablosu uçları yönünde, gaz geçirgen zar dokunarak ve sonra da lamel nudging ve temel doku ile beyin Anging. Bu hareket biraz böyle mükemmel bir uyum (yeşil hat) içine istenen görüntüleme eksenini getiren anterio-dorsal yüzey kontaklar lamel, bu optik lobları yatırır.

Şekil 4,
Şekil 4. Bölünmesi neuroblasts NB. A ve B) Canlı görüntüleme bir 40X, 1.3 NA yağ daldırma objektif kullanarak bütün montaj hazırlıkları hücre bölünmeleri kök canlı görüntüleme Temsilcisi sonuçları. . GFP-moesin ifade eden NB tek bir hücre döngüsü time-lapse görüntüleme gelen time-lapse A) Stills başlamasından sn akrabası: Zaman dk olarak görüntülenir(GFP-Moe). Tek bir hücre döngüsü görüntü elde etme oranı, GFP-Moe ve GFP etiketli centrosome işaretleyici hem de ifade bir NB ardışık hücre bölünmesi çevrimleri time-lapse görüntüleme itibaren). B fotohasar uyaran olmadan zamansal çözünürlüğü geliştirmek için Stills'i artabilir. Birden fazla hücre döngüsü ile ilişkili uzun dönem fotohasar önlemek için düşük zamansal çözünürlük gerektirir. Görüntüleme. CE) sırasında her bir hücre bölünmesi artar arasındaki sürenin uzunluğu hem optik lobu bulunan görüntü tüm NB'ler için bütün montaj hazırlıkları. C)) den sabit kök hücrelerin Konfokal projeksiyonları, 20X büyütme kullanıldığını unutmayın. Bu analiz, tek bir optik lobdan NB'ler (pembe) çoğunluğu 40X büyütme ile görüntülendi olabilir genel beyin morfolojisini incelemek ve NB numaraları (açık mavi), vb. D) ölçmek için özellikle yararlıdır. Mikrotübüller, (yeşil). E)

Film 1. Tek NB hücre döngüsü Canlı görüntüleme. Hücre korteksi etiket GFP-Moe ifade beyni tek bir NB hücre bölünmesi Time-lapse görüntüleri. Görüntüler 40X büyütmede tek bir optik düzlem elde edilmiştir. Bu filmde, çerçeveler her 15 sn ele geçirildi. Edinimi yaklaşık 7 dakika sonra, hızı bir çerçeve her 5 sn çıkarılmıştır. filmi görmek için buraya tıklayın.

Movie 2. Canlı görüntüleme ardışık mermi of NB ACD. GFP-Moe ve GFP etiketli centrosome işaretleyici ifade eden bir beyin hücre bölünmesi üç mermi geçiren bir NB Time-lapse görüntüleri. Görüntüler 60X büyütmede 2 dk zaman aralıklarında elde edildi. filmi görmek için buraya tıklayın.

Hat Etiketli Hücresel Yapısı Fluoroforun Anlatım / Yarışmayı Alıntı
YFP Asterless Sentriyol YFP Ubikitin Rebollo, et al. (2007) Dev. Cell 12:. 467.
SAS6 mCherry Sentriyol MCherry Endojen Rusan ve Peifer (2007) J. Cell Biol. 177
GFP-SAS6 Sentriyol GFP Endojen (BAC) Lerit ve Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-PACT Sentriyol GFP Ubikitin Martinez-Campos, et al. J. Cell Biol 165:. 673.
GFP-SAS4 Sentrozom GFP Ubikitin Dix ve Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
GFP-Polo Sentrozom GFP Endojen . Moutinho-Santos, et al (1999) Cell Biol 91:. 585.
GFP-γ-tubulin 23C Sentrozom GFP Ubikitin Lerit ve Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-Centrosodk Sentrozom GFP UAS Megraw, et al. (2002) J. Sci Hücre 115:. 4707.
GFP-Spd-2 Sentrozom GFP Ubikitin Dix ve Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
MCherry α-tubulin Mikrotübüller MCherry Ubikitin Rusan ve Peifer (2007) J. Cell Biol 177:. 13..
GFP-α-tubulin Mikrotübüller GFP Ubikitin . Rebollo, ve arkadaşları (2004) Biol PLoS 2:. E8.
Jüpiter-GFP ("G147") Mikrotübüller GFP Endojen Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
MCherry Jüpiter Mikrotübüls MCherry UAS Cabernard ve Doe (2009) Dev. Cell 17: 134.
H2AvD-MRFP DNA MRFP Endojen Pandey et al. (2005) J. Sci Hücre 118:. 733.
H2AvD-GFP DNA GFP Endojen Clarkson ve Aziz (1999) DNA Hücre Biol 18:. 457.
Moesin-GFP Kortikal aktin GFP Spagetti squash Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471.

Tablo 1. ACD çalışma için yararlı transjenik bir seçim. Bu füzyon yapılar, hücre bölünmesi çalışmak için özellikle yararlıdır. Bunlar, rutin olarak, canlı NB görüntüleme çalışmalarında kullanılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir.

Görüntüleme Onaylanmış avantajları vardır ayrışmış. İlk olarak, bir kültürleme kabı içinde en büyük (çapı yaklaşık 12 um) hücreler olarak tespit etmek çok kolaydır, çünkü Onaylanmış görüntüye kolaydır ayrışmış. Ayrıca, bir cam yüzey üzerinde kültürlenmiştir neredeyse tüm kök hücreler, görüntü tedarik süreci boyunca mikroskop amaç için aynı derecede yakın olacaktır. Zaman atlamalı görüntülerin optik kalitesi daha da SEM uyarılması için poli-L-lisin ya da fibrinojen kaplı cam ya da kullanımı ile geliştiriliryuvarlak NB'ler 16, 17 i-düzleşme. Kültür içinde yetiştirilen ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için bir diğer avantajı kültür ortamı değiş tokuş edilebilir ile kolaylığıdır. Hücreler vb farmakolojik agonistleri, antagonistleri ya da immunoblocking antikorlar herhangi bir sayıda içeren bir kültür ortamı, kaplanmış cam yüzeyine yapışır bir kez. eklenebilir veya çıkartılabilir. Son olarak, ayrışmış Onaylanmış görselleştirmek için yeni yaklaşımlar, bu teknik, gerçekten, uzun süreli görüntü alımı 18, 19 için uygun olduğunu göstermiştir.

Bununla birlikte, görüntüleme için dezavantajları Onaylanmış protokol kompleksitedir ayrışmış. En yöntemleri, aşağıda ayrıntılarıyla uzun (30-60 dakika), dağılmış hücreleri yerleşmek ve kültür çanağı 17, 19 uymak için izin vermek için, uzun inkübasyon aşama (60 dakika), ardından kimyasal sindirim.

Bunun aksine, sağlam bir beyinden görüntüleme Onaylanmış de korurfizyolojik bağlam ve doku morfolojisi. Bu yaklaşımın avantajları basmakalıp düzenlemeler veya tanımlanan gelişimsel zamanlarda 1 at geliştirmek belirli NB soy tespit yeteneği vardır. Bu nedenle, bizim basitleştirilmiş protokol aynı zamanda farklılaşma ve morfolojilerinden olayların canlı soruşturma için izin verir gibi, ACD çalışmaları ötesine uzanır yarar vardır. Bu yöntemin bir dezavantajı, ancak, orta kültür alışverişi yetersizliğidir. Bu nedenle, başarılı kök hücre bölünmeleri uzun süreli görüntüleme ile ilgilenen araştırmacılar en iyi şekilde uygulamayı uygun yaklaşımı (bütün montaj karşı ayrışmış primer kültür) düşünmek gerekir. Aynı şekilde, insülin ya da serum gibi kültürleme katkı maddeleri, gerekliliği, görüntüleme koşulları (vs görüntüleme süresi, örnek düşen ışık miktarı). Ve deneysel kurulum göre ampirik olarak belirlenmelidir.

Genel olarak, biz ayrıştırmak kullanan öneririzküçük moleküller (örneğin, inhibitörleri, vb.) giriş için Onaylanmış akut yanıtı değerlendirmek için gerekli çalışmalar için d NBs, yüksek hacimli uygulamalar için beyinleri ince mikrodisseksiyon çok hantal olabilir zaman ve gelişmiş görüntüleme çalışmaları için lamel ile fiziksel temas içinde olmak üzere NB gerektirir. Tersine, bu görüntü için yararlı olduğu uygulamalar için olduğu gibi beyin kullanan tavsiye aynı beyin ve özellikle de çalışmaları için birkaç Onaylanmış endişe hücre-hücre etkileşimleri, özerklik, klonal analizi, hücre şekli değişiklikleri ve diğer araştırmalar burada yerel bu hücrelerin ortam önemlidir.

Canlı görüntüleme için sağlam beyinlerin başarılı hazırlanmasını sağlamak, birçok kritik adımlar dikkatle yürütülmelidir. En önemlisi, gereksiz travma doku maruz kalmasını önlemek için zorunludur. Spesifik olarak, beyin eksplantasyonu ve periferal doku çıkarma dikkatle yapılmalıdır. Birdiseksiyon araçları ve beyin arasında doğrudan teması en aza indirmek gerekir. Buna ek olarak, bir asılarak veya beyin dokusu üzerinde bağlanmış çekme kaçınmalıdır. Doku ilgilenmedikleri kolayca yırtık veya bozuk beyinleri neden olabilir. Bizim ellerde, hasarlı beyinlerinden NBs nadiren bölün. Larva beyin diseksiyon için yeni olan kişiler genellikle canlı görüntüleme için örnekleri hazırlamak için denemeden önce diseksiyonu mastering yararlanabilir.

Protokolünde diğer kritik adım hücre görüntüleme yaşamak için önce beyinlerinin montaj olduğunu. Kültür ortamı ve HC yağ hem de doğru miktarlar yararlı bir preparasyonunu tamamlamak için gereklidir. Bu doğru bir pipet ile viskoz HC yağ ölçmek zor olsa da, bir göz tarafından doğru hacmi (yaklaşık 30 ul) yaklaşık olabilir. Çok fazla sıvı yerine yerleşmesini lamel engeller. Çoğu zaman, bu kültürleme kabı yüzeyine hareket beyinlerinde sonuçlanır. Canlı görüntüleme sırasında, bir huzursuz lamel evi olduğunugöçük sırasında doku sürükleniyor ya da optik loblar rulo. Yerine yerleştirilmemiş numuneler kaçınılmalıdır. Aksine, kültür ortamının çok az ya da patlama optik loblar içeren felaket doku hasarı, HC yağ sonuçlar ekleyerek. Lamel kaymasına neden olan çok fazla sıvı kullanarak karşı lamel ağırlığını kaldırabilecek kadar sıvı ortam ve yağ ile arasında dikkatli bir denge vardır. Bu denge iyi uygulama yoluyla öğrenilir. Genel olarak, sadece görüntüde böyle bir sağlam ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu gibi sağlıklı bir morfolojiye sahip olan beyin için en iyisidir.

Numune hiçbir saptanabilir sürüklenme ile monte edildikten sonra, hayatta örnek tutarak bu protokolün sonraki kritik yönü olur. Bu en uygun sıcaklık muhafaza ve en önemlisi, örnek isabet ışık miktarını en aza indirgeyerek elde edilir. Mikroskop kurulum ve örnek l başarısını yönetecek iki değişken vardırhücre görüntüleme ive. Yüksek kalite hedefleri, filtreler (~% 98 iletim), ve kameralar (arka inceltilmiş elektron çarpılması ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken) emisyon tarafında bir uyarım tarafta örnek vurur ışık miktarını azaltmak için izin verir. İyi (görüntü GFP için kullanılır), mavi ışık hücreleri için son derece zehirli olduğu bilinmektedir. Bir toplam ışık (toplam maruz kalma kez) verilen bir örnek tahammül ne kadar belirlemek ve sonra yaymak gerektiğini deney süresi boyunca toplam süresi. Bir örnek, yalnızca belirli bir mikroskop kurulum dayalı 500 lazer ışığı maruz tahammül Örneğin, daha sonra bir 50 x 10 dilim yığınları toplamak olabilir. Bu yığınlar-3 hücre döngüsünden toplamak için tek bir hücre döngüsü NB, veya 2-3 dk toplamak için 1 dakika süre ile aralıklı olabilir. Buna ek olarak, her bir genotip için ayarları en başarılı canlı görüntüleme için çok önemlidir. Optimizasyon döneminde, 488 nm lazer gücü için iyi bir başlangıç ​​noktası 100X, 1.4 NA & kaynaklanan 25-50 μW olduğunu# 160; yağ daldırma objektif. Son olarak, bir her zaman en gelişmiş görüntüleme gerekli durumda değil gibi görüntüleme koşulu düzgün, eldeki soruya cevap ne olacağını belirlemek gerekir.

Canlı ya da sabit ya da doku ile deneyler için, beyin monte edilebilir görüntü özel NB soy şekilde. Şekil 3E'de gösterildiği gibi Örneğin, basmakalıp optik lob 7 arka-orta bölümünde bulunan görüntü Tip II Onaylanmış, amacıyla, bir, beyin monte olacaktır. Merkezi beyin Onaylanmış mekansal ve zamansal desen de 1 dokümante edilmiştir, çünkü ideal, her yerde altında ifade edilir ya da yaygın olarak kullanılan transgenik yapıları, endojen yararlanıcı herhangi bir sayı kullanan ise, tek bir görüntü özgü NB kümelerinin çeşitli bizim protokol kullanabilir (Tablo 1). Bununla birlikte, soy spesifik etiketleme teknolojisi 20 bir dizi uygulamalar için yararlı kalır.Sabit analizi ile, az hasar ile beyinleri genellikle kabul edilebilir. Buna ek olarak, periferik dokularda tam olarak çıkarılması sadece orta montaj beyinleri gömmeden önce kadar ertelenebilir. Sabit doku ile yapılan çalışmalar, Onaylanmış çok sayıda görüntülü olmalıdır olduğunda özellikle yararlıdır.

Sonuç olarak, NB KHA çalışmalar büyük ölçüde canlı hücre görüntüleme ve ayrıntılı analiz sabit hem kullanımı yararlanmıştır. Burada özetlenen protokol canlı ya da sabit uygulamalar için Drosophila larvaları hazırlanmak için bir yaklaşımı göstermektedir. Biz ayrıntılı görüntüleme çalışmaları ile NB KHA sürekli araştırma roman ve geliştirme ve hastalık kök hücrelerin anlayışımızı ilerletmek olacak heyecan verici sonuçlar ortaya çıkaracaktır tahmin. Bozulmamış larva beyinleri uzun vadeli canlı görüntüleme uygulaması farklılaşması ve morfolojilerinden gelişimini yöneten olaylar (ve Degen zamansal dizisi yeni bakış açıları ortaya çıkarmak için potansiyeli vardırmerkezi sinir sistemi eration).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma DAL ödüllendirildi Sağlık / enstitünün (1ZIAHL006126) ve bir Lenfant Biyomedikal Doktora Sonrası Araştırma Bursu National Institutes intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
  2. Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
  3. Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
  4. Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
  5. Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
  6. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
  7. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  8. Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
  9. Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
  10. Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
  11. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  12. Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
  13. Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
  14. Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
  15. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
  16. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
  17. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
  18. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
  19. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
  20. Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  22. Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
  23. Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
  24. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
  25. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  26. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
  27. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
  28. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
  29. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
  30. Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
  31. Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
  32. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  33. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  34. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
  35. Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
  36. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
  37. Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
  38. Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter