Summary
هذا البروتوكول يفسر-Lgr5 POSITVE الثقافة عضي الأولية والأداء اللاحق للتنبيغ فيروسات. وهذا يتيح overexpression جنة المساواة العرقية، أو محرض ضربة قاضية من التحوير تسليمها ويسمح الدراسات الوظيفية التي يتعين الاضطلاع بها في الرواية في المختبر عضوي النمط نظام نموذجي.
Abstract
الخلايا الجذعية Lgr5 إيجابية يمكن أن تستكمل مع نمو أساسي العوامل صندوق تعديل العولمة الأوروبي، كوز صغير، وR-Spondin، والذي يسمح لنا أن ثقافة أي وقت مضى توسيع هياكل الظهارية 3D الأولية في المختبر. كل من الهندسة المعمارية والفسيولوجية خصائص هذه "الشجاعة-مصغرة"، كما دعا organoids، تشبه نظرائهم في الجسم الحي. وهذا يجعلها نظام نموذجا جذابا للظهارة الأمعاء الصغيرة. باستخدام تنبيغ فيروسات، وعلم الوراثة وظيفية ويمكن الآن أن يقوم بها overexpression الجين المشروط ضربة قاضية. يوضح هذا الفيديو الإجراء الثقافة عضي، وتوليد الفيروسات القهقرية، وتنبيغ فيروسات من organoids لمساعدة تحليل المظهري للظهارة المعوية صغيرة في المختبر. هذا النظام نموذج عضوي النمط رواية بالاشتراك مع فيروسات التعبير الجيني بوساطة يوفر أداة قيمة للتحليل السريع للوظيفة الجينات في المختبر دون الحاجة إلى costlجيل نعم وتستغرق وقتا طويلا للحيوانات المعدلة وراثيا.
Introduction
وهناك حاجة الإنتاجية العالية الوراثة وظيفية لزيادة التفاهم البيولوجي لدينا من الجسم، لتحسين العلوم الأساسية والطب الحالي. وكانت الوراثة الماوس معيار الذهب للتحقيق وظيفة الجينات في الجسم الحي، على الرغم من أنه يتطلب وقتا طويلا ومكلفا. خطوط الخلايا، ويجري اختيار المشتركة الأخرى، لديها قدرة إنتاجية أعلى بينما تكون أقل تكلفة. ومع ذلك، يتم عرقلة من قبل عدم قدرتهم على إنتاج المكروية المناسبة وبالتالي الاستجابات الفسيولوجية ينظر في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة لا لبس فيها لنظام نموذج سهل التعامل، والذي يسمح التكلفة / الوقت كفاءة إنتاجية عالية التحليل حين محاكاة الاستجابات الفسيولوجية في الجسم الحي لوحظ في التجارب المعدلة وراثيا (TG) الماوس.
لظهارة الأديم الباطن نظام واحد نموذج من هذا القبيل ظهر في عام 2009 1. بين المعرفة المكتسبة من اكتشاف الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 إيجابية ومعلومات حول مكانة المقابلة لمصفوفة العوامل والنمو خارج الخلوية اللازمة لصيانة الخلايا الجذعية. استخدام هذه المعلومات أصبح من الممكن إنشاء "-الشجاعة الصغيرة" المعروف أيضا باسم organoids 2. مؤخرا تم اقتراح تسمية الإجماع عليها في المختبر الثقافات، حيث يشار إلى organoids باسم 'enteroids'، 3. مثل خطوط الخلايا، وorganoids تتوسع من نوعها وسهلة لعلاج بروابط مع ومثبطات. ومع ذلك، بدلا من أن تكون ثنائية الأبعاد هم هياكل ثلاثية الأبعاد التنظيم الذاتي التي تحتفظ المنظمة سرداب-زغابة وكذلك الخلايا الجذعية والأنساب خلية متمايزة من الأمعاء الدقيقة (SI). Organoids تتكون من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تحيط منطقة اللمعية. جاحظ الهياكل مهدها تتوافق مع الخبايا المعوية صغيرة تحتوي على مقصورة الخلايا الجذعية. بدءا من غيض من هيكل الناشئين الخلايا الاصلية تفرق لأنها ميلصر نحو بطانة الظهارية، حيث يتم تسليط خلايا متباينة عضال في التجويف. بالمقارنة مع خطوط الخلايا، وهذا النظام خارج الحي يلخص بشكل وثيق فسيولوجيا العادي وبالتالي فهو نظام نموذجي واعد للظهارة الأمعاء الصغيرة.
في هذا الفيديو من بروتوكول تنبيغ فيروسات، فإننا نقدم وسيلة تمكن فيفو السابقين دراسات وظائف الجينات في هذا النظام مشابه للعضو ثقافة الرواية. نبدأ بوصف عضي الثقافة بطريقة خطوة بخطوة، والاستمرار من خلال إظهار جيل من الفيروسات القهقرية تليها الإجراء ترنسدوكأيشن. وأخيرا، هناك قسم للمشورة إضافية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ميزة هذا الأسلوب هو أنه يمكن الجمع بين التصوير الحي أو فحص المخدرات لدراسة التوازن والقرارات مصير الخلية والتفاعلات خلية خلية في الظهارة المعوية. بسبب عمارتها البسيطة ومعدل دوران سريع، organoids تمثل نموذجا مثاليا قystem لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية البالغة. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تطبيق تنبيغ فيروسات لorganoids المستمدة من الفئران المعدلة وراثيا مقررة سلفا وكذلك عينات من المرضى الإنسان. مع اقتراب الضربة القاضية في واضعا التدريجي لا يمكن أن يمتد إلى البشر، وorganoids الإنسان SI يشكل بديلا جذابا.
وباختصار، من خلال التلاعب الجيني تنبيغ فيروسات يسمح تحليل المظهري في organoids الأمعاء الصغيرة المستمدة من الفئران أو عينات الأنسجة البشرية، وبالتالي استكمال الوراثة الماوس وخطوط الخلايا أثناء فتح آفاقا جديدة للدراسات في الأنسجة البشرية المستمدة. تنبيغ فيروسات يمكن gain- والدراسات الخسارة من وظيفة التي يتعين القيام بها في نظام الثقافة عضوي الشكل 4. هذا يجعله مصدرا قيما للتحقيق وظيفة الجين، الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية والمرض في حين يجري وفقا لثلاثة روبية (تخفيض، والصقل، واستبدال).
Protocol
وظلت كل الفئران المستخدمة في بروتوكول التالي في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وأجريت كافة الإجراءات وفقا للوائح المملكة المتحدة زارة الداخلية.
1. إعداد
- إعداد وسائل الاعلام 1 ساعة قبل الاستخدام (انظر الجدول رقم 1 وقائمة المواد لمزيد من التفاصيل) وقبل دافئة في 37 ° C حمام الماء لا يقل عن 10 دقيقة قبل الاستخدام.
2. زراعة الأمعاء الصغيرة (SI) Organoids
ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم تنفيذ جميع حضانات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. المعدات والكواشف ملامسة الخلايا الحية يجب أن تكون معقمة.
ما قبل ارتفاع درجات الحرارة لوحة زراعة الأنسجة أمر مهم لأنه يمنع مصفوفة الطابق السفلي (Matrigel أو BME) قطرات من الانتشار خارج عند البذر. أيضا، يجب أن تبقى المصفوفة الطابق السفلي على الجليد في جميع الأوقات. تخزينها في -20 درجة مئوية، وذوبان الجليدعلى الجليد قبل الاستخدام.
- عزل الأقبية
- لعزل الأمعاء الدقيقة تضحية الماوس وفقا للقواعد واللوائح الوطنية، ثم وضع الحيوان على ظهرها، ويغسل البطن مع الايثانول 70٪. إجراء شق طولي خط الوسط من الفخذ إلى عظمة القص. أولا، وقطع الجلد والنسيج تحت الجلد ثم. إزالة الأمعاء الدقيقة من الأعور إلى المعدة. أقبية معزولة عن الاثني عشر، الصائم واللفائفي يمكن استخدامها لثقافة عضي.
- غسل الأمعاء الدقيقة المعزولة مع تبريد قبل الفوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم أو المغنيسيوم (PBS0).
- قطع الأنسجة في قطع 3-5 سم طويلة واستخدام مقص لقطع عليه فتح طوليا. نشر الأنسجة باستخدام ملقط.
- كشط الزوائد باستخدام ساترة. سوف الحذر، الكثير من القوة تتسبب في الأنسجة المسيل للدموع، وسوف تقلل من العائد من الخبايا في الخطوات التالية.
- نقل الأنسجة لأنبوب 50 مل تحتوي على تبريده قبل PBS0 النقيبز ملقط. غسل شظايا الأنسجة من خلال اهتزاز قوي وتغيير PBS0. كرر 2-3x أو حتى يحول PBS0 أقل غائم.
- احتضان الأنسجة في أنبوب 50 مل تحتوي على 30 مل من PBS0 مع 1 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على الأسطوانة أنبوب.
- هزة بقوة الأنبوب ونقل الأنسجة لأنبوب 50 مل أخرى تحتوي على 30 مل من PBS0 مع 5 ملي EDTA. سوف 1 ملم EDTA الحل (سابقا تحتوي على الأنسجة) تحتوي على خليط من الخبايا والزغب. هذا جزء غير مناسب لزرع البذور من organoids لأنها غالبا ما تحتوي على نسبة عالية من الزغب.
- احتضان الأنسجة مزيد مدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على الأسطوانة أنبوب.
- هزة بقوة الأنبوب وجمع الحل في نظيفة أنبوب 50 مل. تأكيد وجود أقبية وتقدير عدد، على سبيل المثال، عن طريق عد الخبايا في 50 ميكرولتر بواسطة المجهر الضوئي. حساب حجم اللازمة للحصول 50-100 الخبايا ونقلها إلى 1.5 مل رالتعليم الأساسي للجميع.
- تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف، resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من الطابق السفلي المصفوفة، والبذور في 24 لوحة جيدا قبل تحسنت. احتضان لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة ل5-15 دقيقة حتى تتصلب مصفوفة الطابق السفلي.
- تراكب مع 500 ميكرولتر المتوسطة ENR (انظر الجدول 1). ما يقرب من 24 ساعة بعد بذر organoids سوف تظهر الكيسي شكل جولة صغيرة وبعد 2-3 أيام أخرى في مهدها الهياكل تصبح مرئية. تغيير إلى وسائل الإعلام ENR جديدة كل 3 أيام.
- مرور عضي ثقافات كل 7 أيام.
- الركض والحفاظ Organoids
- الحفاظ على organoids عن طريق تحديث وسائل الاعلام كل 3 أيام والمرور 1: 3 أو 1: 5 والتجويف يصبح مليئة الخلايا الميتة، تقريبا كل 7 أيام.
- كسر الطابق السفلي مع مصفوفة قبة المتوسطة باستخدام 1 مل pipetman طرف وتحويلها من البئر إلى أنبوب 1.5 مل.
- ميكانيكيا فصل في organoids من خلال pipetting للpproximately 50X باستخدام غرامة (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) تقلب.
- تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في الطابق السفلي 150-250 ميكرولتر من المصفوفة. البذور في مرحلة ما قبل درجة حرارة 24 لوحة جيدا (50 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة / جيد). قبل البذر ماصة مصفوفة الطابق السفلي إلى أعلى وأسفل مرة واحدة لمعطف جدار الحافة. ماصة ببطء لتجنب فقاعات والبذور في منتصف البئر لمنع مصفوفة الطابق السفلي من الانتشار خارج. هو المطلوب للحصول على قبة سرداب مصفوفة في وسط البئر.
- احتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة ل5-15 دقيقة حتى تتصلب مصفوفة الطابق السفلي. تراكب مع 500 ميكرولتر سائل الإعلام ENR لكل بئر.
3. ما قبل الإصابة علاج SI Organoids
ويوضح الشكل 1 الإجراء التنبيغ: ملاحظة.
- الصرف ENR إلى ENRWntNic (انظر الجدول 1) المتوسط وتنمو في organoids رالمتوسطة له مدة لا تقل عن 3 أيام أو حتى أنها تبنت التشكل الكيسي. Wnt3a يزيد من عدد الخلايا الجذعية وبانيت بينما نيكوتيناميد (NIC) يحسن كفاءة الثقافة.
الإنتاج 4. الفيروسات
- وهناك حاجة واحدة 150 مم طبق من خلايا البلاتين-E في العدوى. البذور حوالي 5 × 10 6 خلايا مع وسائل الإعلام 15-18 مل (DMEM + 10٪ FBS) في حضور بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) وblasticidin (10 ميكروغرام / مل). بالنقل الخلايا بعد 2-3 أيام، وعندما وصلت إلى 70-80٪ confluency. تغيير متوسطة إلى DMEM + 10٪ FBS دون بوروميسين وblasticidin قبل ترنسفكأيشن.
- إضافة 30 ميكروغرام من الحمض النووي للفيروسات، وبناء 240 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI) لفصل أنابيب تحتوي على 1 مل من غروب-MEM. خلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تجميع الحلين ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. يضاف خليط الكامل إلى المتوسط الخلايا البلاتين-E ويهز بعناية بلاتالبريد لضمان التوزيع العادل للالمجمعات الحمض النووي PEI.
- احتضان الخلايا البلاتين-E مع خليط ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها وتحديث المتوسطة في اليوم التالي. إبقاء الخلايا في الوسيلة الجديدة لمدة 2 أيام.
- جمع سوى المتوسطة في أنبوب فالكون 50 مل، وتمريرها من خلال 0.45 ميكرون تصفية وأجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 250 ميكرولتر من تنبيغ المتوسطة (انظر الجدول 1).
5. عضي جزء التحضير
- للإصابة واحد وهناك حاجة أيضا واحدة من 24 لوحة جيدا. كسر الطابق السفلي مع مصفوفة قبة المتوسطة باستخدام 1 مل pipetman طرف وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل.
- استخدام غيض حجم الدقيقة (على سبيل المثال، 200 نصائح ميكرولتر) لتعطيل ميكانيكيا organoids من خلال pipetting ل(30-50x). فإن الحل يصبح غائما ويجب أن يكون هناك organoids كله مرئية.
- الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 900 x ج لمدة 5 دقائق .
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من ثقافة الخلية الصف البروتيني المؤتلف (على سبيل المثال، TrypLE). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. التالية الحضانة التحقق من حجم شظايا عضي باستخدام المجهر الضوئي، عد عدد الخلايا في جزء. شظايا تحتوي على 5-10 خلايا مثالية. إذا كانت الغالبية العظمى من شظايا تحتوي على عدد أكبر من الخلايا ويمكن زيادة فترة حضانة من 2 دقيقة في المرة الواحدة.
- إنهاء عملية التفكك من خلال إضافة 500 ميكرولتر من ENR المتوسطة.
- الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 900 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف بيليه والحفاظ على الجليد أو 4 درجات مئوية.
6. فيروسات الرجعية تنبيغ
- الجمع بين شظايا عضي مع 250 ميكرولتر من الحل فيروسات (من القسم 4.5) في بئر واحدة من 48 لوحة جيدا. المزيج بلطف pipetting البطيء باستخدام 1 مل طرف pipetman.
- ختم لوحة مع parafilm.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 32 درجة مئوية، 600 x ج، لمدة 1 ساعة. إزالة بعناية Parafilm واحتضان لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 6 ساعة.
8. البذر من شظايا المصابة عضي
- نقل شظايا عضي المصابين وسائل الإعلام التنبيغ من البئر إلى أنبوب 1.5 مل، وتدور في 900 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف ووضع الأنبوب الذي يحتوي على بيليه على الجليد لمدة 5 دقائق لتبرد. إضافة 100 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة و resuspend بيليه بواسطة pipetting ببطء صعودا وهبوطا.
- قطرات بذرة "الطابق السفلي مصفوفة -cell مزيج '50 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا الجديدة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقائق حتى يتصلب الطابق السفلي المصفوفة.
- إضافة وسائط التنبيغ دون polybrene إلى الآبار واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.
9. اختيار
- بدء حد ذاتهفصل من الكتاب المقدس بعد 2-3 أيام من خلال إضافة بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام.
- عندما بدأت شظايا لتشكيل organoids استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام تنبيغ ENR تستكمل مع بوروميسين (1 ميكروغرام / مل).
10. بعد الإصابة علاج SI Organoids
- ثقافة transduced organoids وفقا ل"الركض والحفاظ organoids" بروتوكول (القسم 2.2.1). بعد 1-2 أسابيع من organoids SI سيستعيد هياكلها الناشئة.
- بعد ظهور الهياكل الناشئة لحث على التعبير عن ميرنا أو [كدنا] بإضافة 4 hydroxytamoxifen (4 OHT) في تركيز العمل من 1 ميكرومتر. لاحظ أن هذه الخطوة هي صالحة فقط في حالة استخدام ناقلات فيروسات من Addgene (pMSCV-loxp-dsRed-loxp-EGFP-بورو-WPRE (32702)، pMSCV-loxp-dsRed-loxp-3xHA-بورو-WPRE (32703)، وpMSCV -FLIP-بورو-dsRed-GFP-ميرنا (32704)) وorganoids التعبير عن لجنة المساواة العرقية-ERT2.
11. تأكيد العدوى وEXPRession / قمع الجينات في المصالح
- إذا باستخدام ناقلات فيروسات من Addgene (32702، 32703 و 32704) ويمكن التأكد من كفاءة ترنسدوكأيشن من خلال رصد dsRed التعبير. وعلاوة على ذلك، فإن التعبير أو قمع الجينات في المصالح يمكن التأكد من البقعة الغربية، وذلك باستخدام GFP أو حاتمة 3xHA (لoverexpression الجينات) وQPCR (لضربة قاضية الجينات)، كما يتمثل في كو وآخرون 4.
Representative Results
Organoids جاهزة للتقسيم عند مظلمة التجويف المركزي بسبب وجود الخلايا الميتة (الشكل 2). بعد 2-3 أيام من organoids قبل المعالجة ينبغي أن تعتمد التشكل الكيسي جولة (الشكل 3). وهذا يزيد من عدد الخلايا الجذعية، وتعزيز فرص الحصول على التكامل مستقر. حجم بيليه الفيروسي قد تختلف التالية الطرد المركزي من طاف الفيروسي، وعلى الأرجح بسبب مساهمة متفاوتة من الحطام الخلية إلى حجم بيليه. وقد لوحظ عدم وجود ارتباط واضح على كفاءة ترنسدوكأيشن. خلال إجراءات الاختيار organoids غير transduced سيموتون، في حين أن تلك التي لديها سيبقى التكامل مستقر. بروتين فلوري من الارتجاعي MSCV-EGFP يمكن ملاحظتها في الخلايا الناشئة من الباقين على قيد الحياة organoids، والتي لها التشكل الكيسي، ضمن 2-3 أيام بعد التنبيغ (الشكل 4).
= "الشكل 1" FO: محتوى العرض = "6in" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" العرض = "600" />
الشكل 1. الرسم التخطيطي الإجراء تنبيغ فيروسات. قبل organoids العدوى تستخدم ENRWntNic إلى أن اعتماد بنية الكيسي (الخطوة 1) ما قبل المعالجة. وتستخدم خلايا البلاتين-E كخط خلية التعبئة والتغليف، ويتم تربيتها حتى تصل إلى 70-80٪ confluency. بعد ذلك و transfected أنهم مع بناء فيروسات باستخدام PEI. ويتم حصاد الفيروسات في وقت لاحق 2 أيام (الخطوة 2). وtrypsinized Organoids للحصول على شظايا تحتوي على 1-10 الخلايا (الخطوة 3)، ثم يصاب (الخطوة 4). spinoculation التالية لزيادة كفاءة العدوى (الخطوة 5)، والمصنف شظايا عضي المصابة (الخطوة 6) و 2-3 أيام في وقت لاحق اختيار الحيوانات المستنسخة إيجابية مع التكامل مستقر يمكن أن يؤديها (الخطوة 7).
1765fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2. الصورة التمثيلية للorganoids بعد 4-6 أيام من الثقافة. يتم تعبئة التجويف مع الخلايا الميتة، مما يجعلها تبدو مظلمة. Organoids في هذه المرحلة هم على استعداد لتكون passaged.
الرقم 3. الصورة التمثيلية للorganoids الأمعاء صغير مثقف في ENRWntNic سائل الإعلام لمدة 3-4 أيام، وorganoids اعتماد التشكل الكيسي.
الرقم 4. الصورة التمثيلية للorganoids الأمعاء الصغيرة (أ) أن تظهر الفيروسي التعبير التحوير (ب، EGFP).
| أدفاnced DMEM / F12 + + + | |
| تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع | |
| متقدم DMEM / F12 | 500 مل |
| Glutamax 100X | 5 مل |
| HEPES 1 M | 5 مل |
| المضادات الحيوية 100X | 5 مل |
| ENRWntNic المتوسطة (20 مل) | |
| تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع | |
| DMEM متقدم / F12 + + + | 7.2 مل |
| ملحق B27 (50X) | 400 ميكرولتر |
| N2 ملحق (100X) | 200 ميكرولتر |
| ن أسيتيل (500 ملم) | 50 ميكرولتر |
| الماوس EGF (500 ميكروغرام / مل) | 2 ميكرولتر |
| الماوس كوز صغير (100 ميكروغرام / مل) | 20 ميكرولتر |
| R-Spondin كونديتioned المتوسطة | 2 مل |
| Wnt3a المتوسطة مكيفة | 10 مل |
| نيكوتيناميد (1 M) | 200 ميكرولتر |
| التنبيغ المتوسطة (20 مل) | |
| إعداد جديدة | |
| ENRWntNic المتوسطة | 20 مل |
| Y-27632 (10 ميكرومتر) | 20 ميكرولتر |
| Polybrene (8 ميكروغرام / مل) | 20 ميكرولتر |
| ENR المتوسطة (20 مل) | |
| تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع | |
| DMEM متقدم / F12 + + + | 17.4 مل |
| ملحق B27 (50X) | 400 ميكرولتر |
| N2 ملحق (100X) | 200 ميكرولتر |
| ن أسيتيل (500 ملم) | 50 ميكرولتر |
| الماوس EGF (500 ميكروغرام / مل) | 2 ميكرولتر |
| الماوس كوز صغير (100 ميكروغرام / مل) | 20 ميكرولتر |
| R-Spondin المتوسطة مكيفة | 2 مل |
| وسائل الاعلام لخلايا البلاتين-E (500 مل) | |
| تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 12 أسبوعا | |
| DMEM | 449.45 مل |
| الجنين مصل بقري (FBS) | 50 مل |
| بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) | 50 ميكرولتر |
| Blasticidin (10 ميكروغرام / مل) | 500 ميكرولتر |
الجدول تكوين 1. الاعلامي للمتقدم DMEM / F12 + + + المتوسطة ENRWntNic، تنبيغ المتوسطة، ENR المتوسطة والمتوسطة للخلايا البلاتين-E.
Discussion
لتحقيق كفاءة عالية التنبيغ جوانب معينة حاسمة. واحد هو المعالجة المسبقة لorganoids ENRWntNic مع وسائل الإعلام إلى أن اعتماد شكل جولة الكيسي. وهذا يزيد من عدد الخلايا الجذعية، وبالتالي فرصة الحصول على التكامل مستقر من التحوير، وكذلك زيادة معدل بقاء organoids SI في جميع أنحاء الداخلي ترنسدوكأيشن. معلمة أخرى هي فترة حضانة التالية spinoculation. النتائج حضانة قصيرة جدا أو طويلة جدا في ضعف كفاءة ترنسدوكأيشن وبقاء الفقراء من organoids، على التوالي. الخطوة spinoculation ليست ضرورية على الرغم من أنها زيادة كبيرة في نسبة organoids transduced. أخيرا، فيروس عالية عيار هو المفتاح لالتنبيغ ناجحة. هذا يعتمد على نوع من التعبئة والتغليف خط الخلية والفيروسات. مزيج من البلاتين-E خط الخلية والفئران الفيروس الخلايا الجذعية (MSCV)، وجد لإنتاج عيار مرتفع بما يكفي لتنبيغ organoids.
ve_content "> وفيما يلي نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي قد تساعد على تحقيق التنبيغ ناجحة. أولا، إذا كان ترنسفكأيشن خط خلية التعبئة والتغليف والفقراء، تأكد من أن confluency من الخلايا ما بين 70-80٪ وأن فترة حضانة لل خليط مجمع PEI الحمض النووي بين 20-30 دقيقة. إن بقاء organoids خلال التنبيغ يعتمد إلى حد كبير على حجم قطعة. يسبب trypsinization طويل جدا معظم أجزاء تتألف من أقل من 3 خلايا وبالتالي يقلل البقاء مشابه للعضو. عامل آخر هو نشاط WNT المتوسطة مكيفة، إذا كان النشاط منخفضة جدا يعزز ذلك من خلال إضافة CHIR99021 في تركيز العمل من 5 ميكرومتر يمكن أن تزيد من البقاء على قيد الحياة. يمنع CHIR99021 GSK3، مما أدى إلى زيادة الإشارات WNT. وعلاوة على ذلك، Y-27362، والذي يمنع يضاف anoikis إلى وسائل الإعلام التنبيغ لتحسين البقاء على قيد الحياة عضوي الشكل، منذ تتعطل وorganoids إلى شظايا (1-10 تحتوي على خلايا) قبل ترنسدوكأيشن. و60، المذكورة أعلاه، ينبغي أن فترة حضانة بعد spinoculation لا تتجاوز 6 ساعة. وأخيرا، إذا لوحظ ضعف التنبيغ ينبغي النظر في العوامل المذكورة أعلاه التأثير على عيار الفيروسي والحد من حجم إدراج لناقلات فيروسات. كفاءة ضربة قاضية تعتمد بشكل كبير على ميرنا. منذ كفاءة يختلف مع مزيج من الجينات المستهدفة وميرنا يجدر أداء شاشة الكفاءة لتحديد تلك التي تعمل على أفضل وجه.وتقتصر هذه التقنية على الظواهر الظهارية للنظام مشابه للعضو. في المستقبل قد يكون من الممكن لدراسة الأمراض المعدية أو بوساطة جهاز المناعة من خلال ثقافة مشتركة من مسببات الأمراض أو إعادة مع مكونات مشتقة من الجهاز المناعي، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تحمل الفيروسات القهقرية فقط إدراج من حجم صغير نسبيا. بالتالي، لا بد من استبعاد المناطق التنظيمية التي تحدث بشكل طبيعي، وبالتالي التعبير عن التحوير لا يمكن أن تحاكي منالجين الذاتية. كما ذكر أعلاه، وكفاءة ضربة قاضية تعتمد على الجينات المستهدفة وميرنا. إذا لم يكن هناك ميرنا بكفاءة ضربة قاضية مناسبة يمكن العثور عليه قد تحد من استخدام هذه التقنية لهذا الجين المستهدف معين.
نظريا، organoids متوافقة مع جميع تقنيات التلاعب موحدة تستخدم في خطوط الخلايا. كان تنبيغ فيروسات الأسلوب الأول ورود أنباء عن 4، ومؤخرا أصبح BAC (كروموسوم اصطناعي البكتيرية) -transgenesis المتاحة 5. يبلغ مجموع الوقت جيل من 2-3 أسابيع، وبعد ترنسفكأيشن من البلازميد الفيروسي في خط خلية التعبئة والتغليف، وهو أسرع بكثير من جيل لالمعدلة وراثيا (TG) الماوس. من خلال الحفاظ على الجسم الحي في سرداب-زغابة العمارة في حين تحتوي الخلايا الجذعية وكذلك جميع الأنساب الخلايا المتمايزة للظهارة المعوية، ونظام الثقافة عضوي الشكل يسد الفجوة بين الحيوان TG وزراعة الخلايا المستخدمة سابقا.
بعد إنشاء organoids الأمعاء الصغيرة، والتكيف البروتوكول الثقافة الأصلي سمح لزراعة البنكرياس والكبد والقولون والمعدة ظهائر 9-11. وعلاوة على ذلك، تم اشتقاق organoids الأمعاء البشرية وorganoids الورم الخزعات الإنسان العادي، عدن الأساسيOMA وسرطان القولون والمستقيم الخزعات 10. يمكن تمديدها بسهولة بالغة بروتوكول عدوى فيروسية لهذه الأنواع من organoids ويوفر وسيلة غير مسبوقة من إجراء دراسات وظيفية في الأنسجة البشرية المستمدة.
أخذت معا، تنبيغ فيروسات من organoids الأمعاء الصغيرة مصدرا قيما للتحقيق في صيانة الخلايا الجذعية، والتمايز، وقرار مصير الخلية، وكذلك إشارات الخلية والخلية الخلوي التفاعلات.
Acknowledgments
معتمدة كو BK وموستاتا RC من قبل هنري ديل زمالة السير من ويلكوم ترست وأندرسون، رولف ويدعمه مجلس البحوث الطبية (MRC). ويدعم فينك J من قبل ويلكوم ترست برنامج الدكتوراه لمدة 4 سنوات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene (8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24-well Plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum-E cells | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
