Summary
פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה מערכת מודל.
Abstract
יכולים להיות בתוספת תאי גזע Lgr5 החיובי עם הצמיחה חיונית גורמי EGF, Noggin, וR-Spondin, אשר מאפשר לנו התרבות המתרחבת מבני אפיתל 3D ראשוניים במבחנה. שני מאפייני הארכיטקטורה ופיזיולוגי של אלה "מיני אומץ", המכונה גם organoids, דומים מאוד למקביליהם בגוף חי. זה גורם להם מערכת מודל אטרקטיבית לאפיתל של המעי הדק. באמצעות התמרה retroviral, יכול כעת להתבצע גנטיקה תפקודית על ידי ביטוי יתר של גן מותנה או מציאה. וידאו זה מדגים את ההליך של תרבות organoid, הדור של רטרווירוסים, ותמרת retroviral של organoids לסייע בתהליכי ניתוח פנוטיפי של אפיתל במעי הקטן במבחנה. מערכת זו רומן מודל organotypic בשילוב עם ביטוי גנים בתיווך retroviral מספקת כלי רב ערך לניתוח מהיר של תפקוד גן במבחנה ללא הצורך של costlדור y ונדרש זמן רב לבעלי חיים מהונדסים.
Introduction
יש צורך בגנטיקה תפקודית תפוקה גבוהה כדי להגדיל את ההבנה הביולוגית שלנו בגוף, כדי לשפר את המדע בסיסי נוכחי ורפואה. גנטיקה עכבר כבר תקן הזהב לחקירת תפקוד גן in vivo, למרות שזה גם זמן רב ויקר. שורות תאים, להיות הבחירה הנפוצה אחרת, יש להם יכולת תפוקה גבוהה יותר בעת היותו פחות יקר. עם זאת, הם הקשו על ידי חוסר היכולת שלהם להתרבות microenvironment הנכון ובכך התגובות הפיזיולוגיות ראה in vivo. לפיכך, יש צורך חד משמעי למערכת מודל קל לידית, המאפשר עלות / תוך ניתוח תפוקה גבוהה בזמן יעיל מחקת את התגובות הפיזיולוגיות שנצפו בin vivo מהונדס ניסויי עכבר (TG).
לאפיתל endodermal מערכת מודל אחד כזה הופיעה ב2009 1. בין הידע שנצבר מהגילוי של תאי גזע במעי Lgr5-חיובימידע על הנישה המתאימה לגורמים הכרחיים לתחזוקת תאי גזע נוסף הסלולר המטריצה וצמיחה. ניצול מידע זה ניתן היה להקים "מיני אומץ" המכונה גם organoids 2. לאחרונה מינוח קונסנסוס למבחנת תרבויות ב, בי organoids מכונות 'enteroids', הוצע 3. כמו שורות תאים, organoids הם המתרחב וקל לטיפול עם הליגנדים ומעכבים. עם זאת, במקום להיות דו ממדים הם מבנים תלת ממדיים ארגון עצמי שישמרו ארגון קריפטה-סיסי, כמו גם תאי גזע ושושלות תאים מובחנים של המעי דק (SI). Organoids מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל המקיפים את אזור luminal. מבני ניצנים בולטים מתאים למאורות מעיים קטנים המכילים את התא בתאי גזע. החל מקצה מבנה הניצנים ותאים להבחין כפי שהם miלגרר לכיוון בטנת אפיתל, שבו תאי סופני הבדיל מופרשים בלומן. בהשוואה לשורות תאים, מערכת זו vivo לשעבר משחזרת באופן הדוק יותר את הפיסיולוגיה הנורמלית ולכן מערכת מודל מבטיחה לאפיתל של המעי הדק.
בסרטון פרוטוקול זה של התמרה retroviral, אנו מציגים שיטה המאפשרת לשעבר מחקרי תפקוד גן vivo במערכת זו תרבות רומן organoid. אנחנו מתחילים בתיאור organoid התרבות באופן צעד אחר צעד, ולהמשיך על ידי הוכחת הדור של רטרווירוסים ואחרי הליך התמרה. לבסוף, יש קטע לקבלת ייעוץ נוסף לפתרון בעיות. יתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להיות בשילוב עם הדמיה חיה או הקרנת סמים ללמוד הומאוסטזיס, החלטות גורל תא ואינטראקציות תאי תאים באפיתל המעי. בשל הארכיטקטורה הפשוטה שלהם ותחלופה מהירה, organoids לייצג של מודל אידיאליystem ללימוד ביולוגיה של תא גזע בוגרים. בנוסף התמרה retroviral יכולה להיות מיושמת על organoids שנלקח מעכברים מהונדסים שנקבע מראש, כמו גם דגימות מטופל אנושיות. לא ניתן להאריך גישות לדפוק ובעקומים החוצה לבני אדם, organoids האנושי SI מהווה חלופה אטרקטיבית.
לסיכום, מניפולציה גנטית דרך התמרה retroviral מאפשרת ניתוח פנוטיפי בorganoids מעיים הקטן שנלקח מעכברים או דגימות רקמה אנושיות, ובכך משלימים את הגנטיקה עכבר ושורות תאים בעת פתיחת אפיקים חדשים ללימודים ברקמות אנושיות נגזר. התמרה retroviral מאפשרת gain- והאובדן של פונקצית מחקרים שיבוצע במערכת תרבות organoid 4. זה עושה את זה משאב יקר ערך לחקירת תפקוד גן, ביולוגיה של תא גזע בוגר ומחלה בעת היותו בהתאם לשלושה Rs (הפחתה, עידון, והחלפה).
Protocol
כל העכברים המשמשים בפרוטוקול הבא הוחזקו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל ההליכים בוצעו על פי תקנות משרד פן בריטניה.
.1 הכנה
- הכן שעה 1 תקשורת מראש של שימוש (ראה טבלה 1 ורשימה של חומרים לפרטים נוספים) וטרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות לפני השימוש.
.2 Culturing מעי דק (SI) Organoids
הערה: אלא אם כן צוין אחרת, כל incubations מבוצע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. ציוד וחומרים כימיים באים במגע עם תאי חיים חייבים להיות סטרילי.
טרום מחמם את צלחת תרבית רקמה חשובה כמו זה מונע מטריצת המרתף (Matrigel או BME) טיפות מלהתפשט החוצה כאשר זריעה. כמו כן, מטריצת המרתף צריך להיות כל הזמן על קרח בכל העת. חנות ב -20 ° C והפשרהעל קרח לפני השימוש.
- בידוד מאורות
- לבידוד של המעי הדק להקריב את העכבר על פי הכללים והתקנות הלאומיים, ואז למקם את החיה על הגב שלה ולשטוף את הבטן עם אתנול 70%. בצע חתך קו האמצע אורך מהמפשעה לעצם החזה. ראשית, לחתוך את העור ולאחר מכן הרקמה התת עורית. הסר את המעי דק מcecum בבטן. מאורות מבודדים מהתריסריון, מעי ריק ומעי עקום יכולים לשמש לתרבות organoid.
- שטוף את המעי דק המבודדים עם פוספט שנאגר מלוח מקורר מראש ללא סידן או מגנזיום (PBS0).
- חותך את הרקמה לחתיכות ארוכות 3-5 סנטימטר ולהשתמש במספריים לחתוך אותו לפתוח אורכים. מורחים את הרקמה באמצעות מלקחיים.
- אל תגרד את villi באמצעות coverslip. זהירות, כוח רב מדי יגרום לרקמה לקרוע ויפחית את התשואה של מאורות בביצוע שלבים.
- העברת הרקמה לצינור 50 מ"ל מכיל usin PBS0 מקורר מראשמלקחיים גרם. שטוף את שברי הרקמה באמצעות טלטול נמרץ ולשנות את PBS0. חזור על 2-3x או עד PBS0 הופך פחות מעונן.
- דגירה הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של PBS0 עם 1 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל30 דקות ב 4 ° C על רולר צינור.
- במרץ לנער הצינור ולהעביר את הרקמה למשנהו צינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של PBS0 עם 5 מ"מ EDTA. פתרון 1 mM EDTA (המכיל בעבר הרקמה) מכיל תערובת של מאורות וvilli. חלק זה אינו מתאים לזריעה של organoids כפי שלעתים קרובות מכיל אחוז גבוה של villi.
- דגירה הרקמות נוספת עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס בהרי צינור.
- במרץ לנער את הצינור ולאסוף את הפתרון בצינור 50 מ"ל נקי. לאשר את קיומו של מאורות ולהעריך את המספר, למשל, על ידי ספירת מאורות ב50 μl על ידי מיקרוסקופ אור. לחשב את הנפח הדרוש כדי להשיג 50-100 מאורות ולהעביר אותו לt 1.5 מ"לUbe.
- ספין XG 300 5 דקות. בטל supernatant, resuspend גלולה ב50 μl של מטריצת מרתף, וזרע בצלחת 24 גם מראש חימם. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ל5-15 דקות כל כך מטריצת מרתף polymerizes.
- שכבה עם 500 בינוני ENR μl (ראה טבלה 1). כ 24 שעות לאחר זריעת organoids יציג צורת פיברוזיס עגולה קטנה ואחרי עוד 2-3 ימים ניצני מבנים להיות גלויות. שינוי לתקשורת ENR הטרי כל 3 ימים.
- מעבר organoid תרבויות כל 7 ימים.
- Passaging וOrganoids שמירה
- לשמור organoids ידי רענון התקשורת בכל 3 ימים והמעבר 1: 3 או 1: 5 כלומן מתמלא בתאים מתים, בערך כל 7 ימים.
- לשבור את כיפת מטריצת המרתף עם מדיום באמצעות 1 מ"ל קצה pipetman ולהעביר אותו מהבאר לצינור 1.5 מ"ל.
- מבחינה מכאנית לנתק את organoids דרך pipettingpproximately 50x באמצעות קנס (למשל, 200 μl) קצה.
- ספין XG 300 5 דקות.
- בטל supernatant וresuspend גלולה ב150-250 μl של מטריצת מרתף. זרע במראש חימם צלחת 24 גם (50 μl של מטריצת מרתף / טוב). לפני זריעת פיפטה מטריצת המרתף למעלה ולמטה פעם אחת למעייל הקיר של הקצה. פיפטה לאט כדי למנוע בועות וזרע באמצע גם כדי למנוע את מטריצת המרתף מלהתפשט החוצה. זה רצוי להגיע כיפה של מטריצת מרתף במרכז הבאר.
- דגירה בתרבית רקמת חממה ל5-15 דקות כל כך מטריצת מרתף polymerizes. שכבה עם תקשורת ENR 500 μl בכל טוב.
.3 טרום זיהום הטיפול בSI Organoids
הערה: איור 1 מדגים את הליך התמרה.
- Exchange ENR לENRWntNic (ראה טבלה 1) בינוני ולגדול organoids בtהמדיום שלו למשך התקופה מינימאלית של 3 ימים או עד שהם אימצו מורפולוגיה פיברוזיס. Wnt3a מגדיל את מספר תאי גזע ופנט בעוד Nicotinamide (NIC) משפר את יעילות התרבות.
הפקת .4 וירוס
- אחת 150 צלחת מ"מ של תאי הפלטינה-E נחוצה לזיהום. זרע כ 5 x 10 6 תאים עם תקשורת 15-18 מ"ל (DMEM + 10% FBS) בנוכחות puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) וblasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל). Transfect תאים אחרי 2-3 ימים, כאשר הם הגיעו ל70-80 confluency%. לשנות את המדיום לDMEM + 10% FBS ללא puromycin וblasticidin לפני transfection.
- הוסף 30 מיקרוגרם של מבנה DNA retroviral ו240 μl של polyethylenimine (PEI) כדי להפריד בין צינורות המכילים 1 מ"ל של opti-MEM. לערבב דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- בריכת שני פתרונות ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 20-30 דקות. מוסיף את התערובת המלאה למדיום של תאי הפלטינה-E ולנער את פלאט בזהירותדואר כדי להבטיח חלוקה שווה של מתחמי DNA-PEI.
- דגירה תאי הפלטינה-E עם תערובת transfection הלילה ולרענן את המדיום למחרת. שמור את התאים במדיום החדש עבור 2 ימים.
- לאסוף רק את המדיום בצינור פלקון 50 מ"ל, להעביר אותו דרך מסנן וצנטריפוגות 0.45 מיקרומטר ב8,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעה. בטל supernatant וresuspend גלולה ב250 μl של מדיום התמרה (ראה טבלה 1).
.5 Organoid קטע הכנה
- לזיהום אחד יש צורך גם אחד מצלחת 24 גם. לשבור את כיפת מטריצת המרתף עם מדיום באמצעות 1 מ"ל קצה pipetman ולהעביר אותו לצינור 1.5 מ"ל.
- השתמש בקצה עדין יותר נפח (לדוגמא, 200 טיפים μl) לשבש מכאני organoids באמצעות פיפטה (30-50x). הפתרון יהיה מעונן ולא כל organoids צריך להיות גלוי.
- צנטריפוגה בטמפרטורת חדר, 900 XG למשך 5 דקות .
- בטל supernatant וresuspend גלולה ב500 μl של פרוטאז הכיתה תרבית תאי רקומביננטי (למשל, TrypLE). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר דגירה לבדוק את הגודל של שברי organoid באמצעות מיקרוסקופ אור, סופר את מספר תאים לכל בר. שברים המכילים 5-10 תאים הם אידיאליים. אם רוב הברים מכילים מספר גבוה יותר של תאי זמן הדגירה יכול להיות מוגבר על ידי 2 דקות בכל פעם.
- לסיים את תהליך הניתוק על ידי הוספת 500 μl של מדיום ENR.
- צנטריפוגה בטמפרטורת חדר, 900 XG למשך 5 דקות. הסר את supernatant ולשמור את הכדור על קרח או 4 ° C..
.6 Retroviral התמרה
- לשלב שברי organoid עם 250 μl של פתרון retroviral (מסעיף 4.5) ובאחד מצלחת 48 היטב. מערבבים בעדינות על ידי pipetting האיטי באמצעות 1 מ"ל קצה pipetman.
- חותם את הצלחת עם Parafilm.
- צנטריפוגה את הצלחת ב32 ° C, 600 XG, עבור שעה 1. מוציא בזהירות את Parafilm ודגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה במשך 6 שעות.
.8 זריעה של שברי Organoid מאשרום
- העבר את שברי organoid הנגועים ותקשורת התמרה מהבאר לצינור 1.5 מ"ל, וספין ב900 XG למשך 5 דקות.
- בטל supernatant ולשים את הצינור המכיל גלולה על קרח למשך 5 דקות למגניבות. הוספה של מטריצת מרתף 100 μl וresuspend גלולה ידי pipetting לאט למעלה ולמטה.
- טיפות זרע 'מטריצת מרתף -cell לערבב' 50 μl בצלחת 24 גם חדשה. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-15 דקות עד שמתמצק מטריצת מרתף.
- הוסף מדיה התמרה ללא polybrene לבארות ודגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה. שינוי בתקשורת בכל 2-3 ימים.
.9 בחירה
- התחל selection אחרי 2-3 ימים על ידי הוספת puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) לתקשורת.
- כאשר שברים מתחילים להיווצר organoids להחליף את תקשורת התמרה עם תקשורת ENR בתוספת puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל).
10. הודעה זיהום הטיפול בOrganoids SI
- תרבות transduced organoids פי "Passaging ושמירת organoids" פרוטוקול (סעיף 2.2.1). לאחר 1-2 שבועות organoids SI יהיה להחזיר את מבני הניצנים שלהם.
- בעקבות ההופעה של מבני ניצנים לגרום הביטוי של מירנה או cDNA על ידי הוספת 4 hydroxytamoxifen-(4-OHT) בריכוז עבודה של 1 מיקרומטר. שים לב שצעד זה תקף רק אם נעשה שימוש בוקטורי retroviral מAddgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-eGFP-Puro-wpre (32,702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-wpre (32703), וpMSCV -FLIP-Puro-dsRed-GFP-מירנה (32,704)) וorganoids להביע Cre-ERT2.
11. אישור הזיהום וExpression / דיכוי של הגן של עניין
- אם אתם משתמשים בוקטורי retroviral מAddgene (32,702, 32703 ו32,704) יעילות התמרה יכולה להיות מאושרת על ידי תצפית של ביטוי dsRed. יתר על כן, הביטוי או הדיכוי של הגן של עניין יכול להיות מאושר על ידי מערב כתם, באמצעות GFP או epitope 3xHA (לביטוי יתר של גן) וqPCR (למציאת גן), כפי שהודגם באל Koo et 4.
Representative Results
Organoids מוכן להיות מפוצלים כאשר לומן המרכזי הוא חשוך בשל נוכחותם של תאים מתים (איור 2). אחרי 2-3 ימים של organoids טיפול מראש צריך לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס עגולה (איור 3). זה מגדיל את מספר תאי גזע, שיפור סיכויי קבלת אינטגרציה יציבה. הגודל של גלולה הנגיפית עשוי להשתנות בעקבות צנטריפוגה של supernatant ויראלי, ככל הנראה בשל תרומה שונה של פסולת תא לגודל גלולה. לא נמצא קשר ברור ליעילות התמרה נצפה. במהלך הליך בחירת organoids-transduced לא ימותו, ואילו אלה שיש אינטגרציה יציבה תישאר. חלבון פלואורסצנטי מרטרווירוס MSCV-eGFP ניתן להבחין בתאים שמקורם בorganoids ששרד, שיש להם מורפולוגיה פיברוזיס, בתוך 2-3 ימים הבאים התמרה (איור 4).
= "איור 1" FO: = src תוכן רוחב "6in" = "/ קבצים / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" />
איור 1 ציור סכמטי של הליך התמרה retroviral. לפני organoids זיהום הוא באמצעות ENRWntNic עד שהם לאמץ מבנה פיברוזיס (שלב 1) שטופל מראש. תאי הפלטינה-E משמשים כקו תא האריזה, ותרבית עד שהם מגיעים 70-80 confluency%. לאחר מכן הם transfected עם מבנה retroviral באמצעות PEI. וירוסים נקצרים 2 ימים לאחר מכן (שלב 2). Organoids הם trypsinized להשיג שברים המכילים 1-10 תאים (שלב 3), ולאחר מכן נגוע (שלב 4). בעקבות spinoculation כדי להגביר את יעילות הזיהום (שלב 5), שברי organoid הנגועים הם זורעים (שלב 6) ו2-3 ימים לאחר מכן בחירה לשיבוטים חיוביים עם שילוב יציב ניתן לבצע (שלב 7).
"Width =" 1765fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2 תמונת נציג organoids אחרי 4-6 ימים של התרבות. לומן מלא בתאים מתים, מה שהופך אותו להופיע כהה. Organoids בשלב זה הוא מוכן להיות passaged.
איור 3 תמונת נציג organoids המעי הדק בתרבית תקשורת ENRWntNic ל3-4 ימים. Organoids לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס.
איור 4 תמונת נציג organoids מעיים הקטן (א) להראות ביטוי נגיפי transgene (ב, eGFP).
| אדוהnced DMEM / F12 +++ | |
| חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות | |
| מתקדם DMEM / F12 | 500 מ"ל |
| 100x Glutamax | 5 מ"ל |
| Hepes 1 M | 5 מ"ל |
| 100x אנטיביוטיקה | 5 מ"ל |
| בינוני ENRWntNic (ל20 מ"ל) | |
| חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות | |
| מתקדם DMEM / F12 +++ | 7.2 מ"ל |
| תוסף B27 (50x) | 400 μl |
| תוספת N2 (100x) | 200 μl |
| N-acetylcysteine (500 מ"מ) | 50 μl |
| העכבר EGF (500 מיקרוגרם / מ"ל) | 2 μl |
| Noggin העכבר (100 מיקרוגרם / מ"ל) | 20 μl |
| קונדיט R-Spondinבינוני ioned | 2 מ"ל |
| מדיום מותנה Wnt3a | 10 מ"ל |
| Nicotinamide (M 1) | 200 μl |
| בינוני התמרה (ל20 מ"ל) | |
| הכן טרי | |
| בינוני ENRWntNic | 20 מ"ל |
| Y-27632 (10 מיקרומטר) | 20 μl |
| Polybrene (8 מיקרוגרם / מ"ל) | 20 μl |
| בינוני ENR (ל20 מ"ל) | |
| חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות | |
| מתקדם DMEM / F12 +++ | 17.4 מ"ל |
| תוסף B27 (50x) | 400 μl |
| תוספת N2 (100x) | 200 μl |
| N-acetylcysteine (500 מ"מ) | 50 μl |
| העכבר EGF (500 מיקרוגרם / מ"ל) | 2 μl |
| Noggin העכבר (100 מיקרוגרם / מ"ל) | 20 μl |
| מדיום מותנה R-Spondin | 2 מ"ל |
| מדיה לתאי הפלטינה-E (ל500 מ"ל) | |
| חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שבועות | |
| DMEM | 449.45 מ"ל |
| בסרום שור עוברי (FBS) | 50 מ"ל |
| Puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) | 50 μl |
| Blasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל) | 500 μl |
שולחן הרכב .1 מדיה המתקדם DMEM / F12 +++, בינוני ENRWntNic, בינוני התמרה, בינוני ENR, ובינוני לתאי הפלטינה-E.
Discussion
כדי להשיג היבטים מסוימים יעילות התמרה גבוהה הם קריטיים. אחת מהן הוא הטיפול המקדים של organoids עם תקשורת ENRWntNic עד שהם לאמץ צורת פיברוזיס עגולה. זה מגדיל את מספר תאי גזע ובכך את הסיכוי להשגת אינטגרציה יציבה של transgene, כמו גם להגדיל את שיעור ההישרדות של organoids SI לאורך כל הליך התמרה. פרמטר נוסף הוא זמן הדגירה הבא spinoculation. תוצאות דגירה קצרות מדי או ארוכות מדי ביעילות ירודה התמרה והישרדות נמוכה של organoids, בהתאמה. צעד spinoculation הוא לא חיוני למרות שזה מגדיל את אחוז organoids transduced באופן משמעותי. לבסוף, וירוס גבוה כייל הוא מפתח לתמרה מוצלחת. זה תלוי בסוג של שורת תאי אריזה ווירוס. השילוב של שורת תאי הפלטינה-E ווירוס בתאי גזע עכברי (MSCV), נמצא לייצר כייל גבוה מספיק עבור התמרה של organoids.
ve_content "> להלן טיפים לפתרון בעיות אשר עשוי לסייע להשגת התמרה מוצלחת. ראשית, אם transfection של שורת תאי אריזה הוא עני, לוודא כי confluency של התאים הוא בין 70-80% וכי זמן הדגירה של התערובת נקווה PEI-DNA היא בין 20-30 דקות. ההישרדות של organoids במהלך התמרה מאוד תלויה בגודל שבר. trypsinization הארוך מדי גורם לרוב שברים מורכב מפחות מ -3 תאים, ובכך מקטין את שרידות organoid. גורם נוסף הוא הפעילות של המדיום המותנה Wnt, אם הפעילות היא נמוכה מדי לחיזוקו באמצעות תוספת של CHIR99021 בריכוז עבודה של 5 מיקרומטר יכול להגדיל את ההישרדות. CHIR99021 מעכבת GSK3, וכתוצאה מכך גם סיגנלים של Wnt מוגברים. יתר על כן, Y-27362, המונע anoikis מתווסף לתקשורת התמרה כדי לשפר את שרידות organoid, מאז organoids הם שיבשו לברים (המכיל 1-10 תאים) לפני התמרה. כ60; שהוזכרו לעיל, זמן הדגירה לאחר spinoculation לא יעלה על 6 שעות. לבסוף, אם התמרה עניה הוא ציין הגורמים האמורים להשפיע על כייל הנגיף ואת מגבלת הגודל של להכניס לוקטור retroviral צריכים להיחשב. היעילות של מציאה תלויה מאוד במירנה. מאז היעילות משתנה עם השילוב של גן המטרה ומירנה זה שווה ביצוע מסך יעילות לזהות את אלה שעובדים הכי טובים.הטכניקה מוגבלת לתופעות האפיתל של מערכת organoid. בעתיד אפשר יהיה ללמוד במחלות זיהומיות או בתיווך חיסוני באמצעות שיתוף התרבות של מחוללי מחלה או הכינון מחדש עם רכיבים שמקורם במערכת החיסון, בהתאמה. יתר על כן, רטרווירוסים יכולים לשאת רק מוסיף של גודל קטן יחסית. כתוצאה מכך, אזורי רגולציה מתרחשים באופן טבעי יש לי כדי להיות שליליים ולכן הביטוי של transgene לא יכול לחקות את זה שלגן אנדוגני. כפי שצוין לעיל, את יעילות מציאה תלויה בגן המטרה ומירנה. אם לא ניתן למצוא מירנה עם יעילות מציאה מתאימה, הוא יכול להגביל את השימוש בטכניקה לגן מטרה מסוים.
באופן תיאורטי, organoids תואם את כל הטכניקות מניפולטיביות הסטנדרטיות המשמשות לשורות תאים. התמרה retroviral הייתה השיטה הראשונה שדיווחה על 4, ולאחרונה BAC -transgenesis (כרומוזום בקטריאלי המלאכותי) הפך זמין 5. עם זמן דור כולל של 2-3 שבועות, לאחר transfection של פלסמיד הנגיפי אל תוך תא קו אריזה, הוא מהיר יותר באופן משמעותי מהדור של מהונדס עכבר (TG). על ידי שמירה על ארכיטקטורת קריפטה-סיסי in vivo בעוד המכיל תאי גזע, כמו גם את כל שושלות התאים מובחנות של האפיתל במעיים, מערכת תרבות organoid מגשרת על הפער בין בעלי החיים TG ותרבית תאים ששימשו בעבר.
לאחר הקמת organoids המעי הדק, עיבוד של פרוטוקול התרבות המקורי אפשר culturing האפיתלים לבלב, כבד, מעי גס והקיבה 9-11. יתר על כן, organoids מעיים האנושי וorganoids גידול כבר נגזרו מביופסיות אנושיות נורמליות, עדן הראשוניסבתא וסרטן מעי גס ביופסיות 10. פרוטוקול זיהום ויראלי ניתן להרחיב בקלות לסוגים אלה של organoids ומספק דרך חסרת תקדים של ביצוע מחקרים תפקודיים ברקמות אנושיות נגזר.
יחדיו, התמרה retroviral של organoids המעי הדק היא משאב יקר ערך לחקירת תחזוקת תאי גזע, בידול, והחלטת גורל תא, כמו גם יחסי גומלין איתות תא ותא תאי ד'.
Acknowledgments
Koo BK וMustata RC נתמך על ידי סר הנרי דייל המלגה מקרן Wellcome ואנדרסון-רולף נתמך על ידי המועצה למחקר הרפואי (MRC). פינק J נתמך על ידי הדוקטור-התכנית של 4 שנות Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene (8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24-well Plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum-E cells | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
