白细胞交叉使用旁或跨细胞途径的单层内皮细胞。我们开发了一个简单的试验,以遵循内源交界的分布VE-cadherin和PECAM-1白细胞跨内皮迁移过程中的生理流动下两路轮回区分。
在炎症过程中,白细胞离开流通和跨内皮打在下面的组织入侵的病原体。这个过程被称为白细胞跨内皮迁移。两条路线的白细胞穿过内皮细胞单层进行了说明:在旁路线, 即通过细胞-细胞连接和跨细胞途径, 即,通过内皮细胞体。然而,它在技术上难以对位和跨细胞途径区分。我们开发了一个简单的体外实验,研究内源性的分布VE-cadherin和PECAM-1的生理流动条件下,中性粒细胞跨内皮迁移过程中。在此之前灌注中性粒细胞,内皮细胞,短暂治疗对VE-cadherin和PECAM-1荧光标记的抗体。这些抗体不与这两个蛋白质的功能干扰,如由电小区substra确定TE阻抗传感和FRAP测量。使用这种测定法,我们能够遵循内源的分布VE-钙粘蛋白和PECAM-1跨内皮迁移中的流动条件下和在整个血管内皮细胞的白细胞的对位和跨细胞迁移路线之间进行区分。
效率和严格控制的白细胞跨内皮迁移(TEM)是在生理过程,如免疫监视和急性炎症的关键重要性。然而,在某些病理生理条件下,不受控制的和过度的TEM观察所得的慢性炎性疾病( 如类风湿关节炎,动脉粥样硬化,哮喘)。另外,在肿瘤细胞的转移,跨内皮迁移的过程是有助于对肿瘤细胞离开循环转移1-3。为了专门与过度白细胞或肿瘤细胞的TEM干扰,这个过程的调节有详细的了解是必要的。
据认为,在TEM过程是通过不同的步骤。开创性研究,回顾在二十年前由屠夫和施普林格,导致了多级模型描述TEM 4,5的过程。这种模式仍然适用,虽然有些广告ditional措施已列入6。阿龙等人描述的需要固定的趋化因子的内皮7的表面上的存在。最近,他们发现,血管内皮细胞本身产生这在内皮顶面8呈现的趋化因子。此外,同组提出的流动条件的重要性TEM 7时。近日,专注于两个不同的路线白细胞一些出版物可以在透射电子显微镜的最后血细胞渗出阶段。他们可以通过细胞间连接处, 即旁迁徙路线,或穿越内皮细胞体,被称为跨细胞迁徙路线9。卡曼和他的同事研究了这些途径中的细节和结论是白细胞穿越的脐静脉内皮细胞单层10时优先选择旁迁徙路线(90%),在跨细胞途径(10%)。然而,当被用来从其他来源的内皮细胞, 例如,脑或微脉管系统,更白细胞用的跨细胞途径(30%)11。该Vestweber组最近发现,当细胞-细胞连接处无法彼此通过使用敲除动物模型,替换内源的离解VE-钙粘蛋白的VE-钙粘蛋白-α-连环蛋白嵌合体,白细胞TEM被完全阻断12 。令人惊奇的是,作者发现,TEM被挡在数个,但不是所有的组织。总体来看,这些典雅的实验表明,白细胞优于跨细胞途径的路线旁,虽然触发此决定的调控信号还是一个未知数。
尽管大多数白细胞喜欢旁迁移路线,但仍难以既通路之间进行区分。除此之外,尽管许多研究集中在内皮细胞 – 细胞junct的作用离子,这些路口的动态,特别是连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1,在此期间白细胞道口仍在争论。我们开发了一种相对简单的测定,其中这些结分子可在实时过程中使用荧光标记的抗体的生理流动条件下,白细胞血细胞渗出来监测。这些抗体不干扰或阻止目标蛋白质的交界完整或移动性。此测定法使得我们旁TEM的过程中跟随连接蛋白的动力学。此外,该法还允许歧视性的对位和跨细胞迁徙路线之间。
对于此协议,它是重要的,以防止气泡在流动室的形成,因为这会导致细胞凋亡和破坏的单层。为了避免这种情况,我们想强调,要特别关注的步骤4.2和4.5,其中所述管被连接到流动室。在该协议的另一个重要步骤是,保持在室温下通过它们注入到流动室(步骤4.1)之前培养他们15-30分钟,在37℃的中性粒细胞的灌注。这导致白细胞整合素涂刷,允许他们坚持粘附分子如ICAM-1或VCAM-1的内皮细胞。
这个协议并不限于研究嗜中性粒细胞的轮回。还其他白细胞的类型,如单核细胞或淋巴细胞可被使用。注意,步骤4.1,也就是说 ,吸白细胞的白细胞类型之间可能有所不同。也可以使用其它类型的内皮细胞。对于这一点,仍然是关键刺激内皮细胞与适当的炎症刺激,如TNF-α或IL-1β。若嗜中性粒细胞中transmigrating不响应,可以考虑处理的嗜中性粒细胞短时间(5分钟),用N-甲酰基-L-蛋氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(fMLP的)肽16。这会刺激嗜中性粒细胞,特别是它们整合,甚至进一步,使它们更容易粘附到内皮。
通常为1达因/厘米2流速使用。这种流动的速度是衡量后毛细血管小静脉,大多数白细胞跨内皮迁移发生17个 。使用所描述的流动室中,所以能够提高流速高达10达因/厘米2。然而,不推荐使用,以增加抗剪进一步。它可能会导致不希望的泄漏从流动室的细胞的管道和脱离。
在图3中所描述的结果表明,这些抗体可用于可视化和中白细胞血细胞渗出研究内皮细胞 – 细胞连接的动态。特别是,除了现有的轮回测定此协议允许的生理流动条件下在实时下以鉴别从跨细胞迁移的细胞旁。由于抗体染色的细胞 – 细胞连接,可以比分白细胞跨越VE-钙粘着蛋白/ PECAM-1-阳性结与非正VE-钙粘着蛋白/ PECAM-1位点的数目。通过这种方式,跨细胞的迁移可以从细胞旁迁移来区别。
的PECAM-1抗体用于本研究是针对第二胞外域:它要强调,这些抗体不与它们结合到蛋白质的功能干扰是很重要的。铺板在该抗体的存在下在没有显示在扩频或形成一单分子层的任何缺陷内皮细胞,这表明该抗体至少没干扰内皮细胞之间的同型相互作用。在除此之外,两种抗体不损害中性粒细胞的迁移穿过内皮细胞单层的能力。此外,嗜中性粒细胞的跨内皮单层轮回在不存在或该抗体的存在的数量不改变(数据未显示)。重要的是,激光扫描共聚焦显微镜让我们能够同时录制不同的荧光通道和DIC的可能性。
因此,该测定法允许学习VE-钙粘蛋白和PECAM-1的动力学同时当嗜中性粒细胞穿过内皮细胞-细胞连接,并将有助于理解为什么白细胞选择一个路线上的其他, 即旁与跨细胞。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |