Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.
Au cours de l'inflammation, les leucocytes quittent la circulation et traversent l'endothélium pour lutter contre les pathogènes envahisseurs dans les tissus sous-jacents. Ce processus est connu comme la migration des leucocytes transendotheliale. Deux voies de leucocytes à traverser la monocouche endothéliale ont été décrites: la voie paracellulaire, c'est-à travers les jonctions cellule-cellule et la voie transcellulaire, c'est à dire, à travers le corps de la cellule endothéliale. Cependant, il est techniquement difficile de discriminer entre le paragraphe et la voie transcellulaire. Nous avons développé un test in vitro simple pour étudier la distribution de la VE-cadhérine endogène et PECAM-1 au cours de la migration des neutrophiles transendotheliale dans des conditions d'écoulement physiologiques. Avant de neutrophiles perfusion, les cellules endothéliales ont été brièvement traités avec des anticorps marqués par fluorescence contre VE-cadhérine et PECAM-1. Ces anticorps ne gênent pas la fonction des deux protéines, comme cela a été déterminé par la cellule-électrique SUBSTRAte impédance de détection et PAF mesures. L'utilisation de ce test, nous avons pu suivre la répartition des endogène VE-cadhérine et PECAM-1 lors de la migration trans-endothéliale dans des conditions de débit et de discrimination entre les paramètres et de migration transcellulaire routes des leucocytes à travers l'endothélium.
La migration des leucocytes transendothéliale efficace et étroitement contrôlé (TEM) est d'une importance capitale dans les processus physiologiques tels que la surveillance immunitaire et de l'inflammation aiguë. Toutefois, dans certaines conditions physiopathologiques, TEM incontrôlée et excessive est observée traduit dans les maladies inflammatoires chroniques (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde, l'athérosclérose, l'asthme). Egalement au cours de la métastase des cellules tumorales, le processus de migration trans-endothéliale est instrumental pour les cellules tumorales quittent la circulation à métastaser 1-3. Dans le but d'interférer spécifiquement avec leucocytes excessive ou TEM des cellules tumorales, une compréhension détaillée de la régulation de ce processus est nécessaire.
On pense que le processus de TEM se produit à travers différentes étapes. Études séminales, revu il ya deux décennies par Butcher et Springer, ont conduit au modèle en plusieurs étapes décrivant le processus de TEM 4,5. Ce modèle est toujours valable, même si certains annonceétapes conditionnelles ont été inclus 6. Alon et al. Décrit la nécessité de la présence de chimiokines immobilisés sur la surface de l'endothélium 7. Récemment, ils ont montré que l'endothélium génère lui-même chimiokines qui sont présentés à la surface apicale endothéliale 8. En outre, le même groupe a mis en avant l'importance des conditions d'écoulement pendant TEM 7. Récemment, plusieurs publications ont porté sur les deux itinéraires différents leucocytes peuvent prendre à l'étape finale de la diapédèse de TEM. Ils peuvent soit aller à travers les jonctions cellule-cellule, c'est à dire, la voie de migration paracellulaire, ou traverser le corps de la cellule endothéliale, connue sous le nom migration voie transcellulaire 9. Carman et ses collègues ont étudié ces voies dans le détail et a conclu que les leucocytes choisissent préférentiellement la voie de migration paracellulaire (90%) sur la voie transcellulaire (10%) lors de la traversée d'une veine ombilicale endothéliale monocouche 10.Cependant, lorsque les cellules endotheliales provenant d'autres origines ont été utilisés, par exemple, le cerveau ou le système microvasculaire, les plus utilisés leucocytes voie transcellulaire (30%) 11. Le groupe Vestweber récemment montré que, lorsque les jonctions cellule-cellule étaient incapables de dissocier l'une de l'autre à l'aide d'une réaction en chaîne dans un modèle animal, en remplaçant endogène VE-cadhérine de VE-cadhérine, alpha-caténine chimère, leucocytes TEM a été complètement bloqué 12 . De manière surprenante, les auteurs ont remarqué que TEM a été bloqué en plusieurs, mais pas tous, les tissus. Dans l'ensemble, ces expériences élégantes ont indiqué que les leucocytes ont préféré la voie paracellulaire sur la voie transcellulaire, bien que les signaux de régulation qui déclenchent cette décision sont encore inconnues.
Même si la majorité des leucocytes préfèrent la voie de migration paracellulaire, il est encore difficile de distinguer entre les deux voies. En outre, en dépit de nombreuses études portant sur le rôle de la cellule Junct-cellule endothélialeions, la dynamique de ces jonctions, en particulier les protéines de jonction VE-cadhérine et PECAM-1, au cours de leucocytes passage est encore en débat. Nous avons développé un test relativement simple dans lequel les molécules de jonction peuvent être surveillés en temps réel pendant la diapédèse des leucocytes dans des conditions d'écoulement physiologiques en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. Ces anticorps n'ont pas interféré avec ou bloquent l'intégrité de jonction ou de la mobilité des protéines ciblées. Ce test nous permet de suivre la dynamique des protéines de jonction au cours du processus de paracellulaire TEM. En outre, ce test permet aussi la discrimination entre les voies de migration paramètres et transcellulaires.
Pour ce protocole, il est essentiel d'éviter la formation de bulles d'air dans le débit-chambres, car cela se traduira par l'apoptose des cellules et une monocouche perturbé. Pour éviter cela, nous tenons à souligner à payer un intérêt particulier pour les étapes 4.2 et 4.5, où les tubes sont reliés à l'écoulement chambre. Une autre étape importante dans le protocole est le amorçage des PMN qui sont conservés à la température ambiante en les incubant pendant 15 à 30 min à 37 ° C avant de les injecter à l'écoulement de chambre (étape 4.1). Cela se traduit par l'amorçage des intégrines leucocytaires, en leur permettant d'adhérer à des molécules d'adhésion telles que ICAM-1, VCAM-1 ou à l'endothélium.
Ce protocole n'est pas limitée à étudier la transmigration des neutrophiles. Mais aussi d'autres types de leucocytes tels que les monocytes ou les lymphocytes peuvent être utilisés. Notez que l'étape 4.1, c'est à dire, l'amorçage des leucocytes peuvent différer entre les différents types de leucocytes. En outre, d'autres types de cellules endotheliales peuvent être utilisés. Pour cela, il reste critiquepour stimuler les cellules endotheliales à des stimuli inflammatoires appropriés, tels que le TNF-α ou IL-1β. Si les neutrophiles ne répondent pas de transmigration, on peut envisager de traiter les neutrophiles brièvement (5 min) avec de la N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-L-phénylalanine (fMLP) peptide 16. Cela stimulera les neutrophiles, en particulier leurs intégrines, encore plus loin, ce qui les rend plus enclins à adhérer à l'endothélium.
Typiquement / cm 2 vitesses d'écoulement 1 dyn est utilisé. Cette vitesse d'écoulement est mesurée dans les veinules post-capillaires, les sites où la plupart des migrations leucocytes transendotheliale se produit 17. En utilisant les débits-chambres décrites, il est possible d'augmenter la vitesse de circulation de 10 dyn / cm 2. Cependant, il n'est pas recommandé d'augmenter le cisaillement plus loin. Elle peut entraîner une fuite non désirée du tube et le détachement des cellules de la chambre d'écoulement.
Les résultats décrits dans la figure 3 indiquent que ceux-cianticorps peuvent être utilisés pour visualiser et étudier la dynamique des jonctions endothéliales cellule-cellule pendant la diapédèse des leucocytes. En particulier, en plus des dosages de transmigration existants ce protocole permet de discriminer de migration transcellulaire paracellulaire dans des conditions d'écoulement physiologiques en temps réel. Comme les anticorps se colorent les jonctions cellule-cellule, on peut marquer le nombre de leucocytes qui traversent la VE-cadhérine / jonctions PECAM-1-positifs par rapport non positive VE-cadhérine / PECAM-1 sites. De cette façon, la migration transcellulaire peut être discriminé de la migration paracellulaire.
Il est important de souligner que ces anticorps ne gênent pas la fonction des protéines, ils se lient à l'anticorps: PECAM-1 utilisé dans cette étude est dirigé contre le domaine extracellulaire secondes. Les cellules endotheliales qui ont été étalées en présence de l'anticorps n'ont pas montré de défauts dans la diffusion ou la formation d'une monocouche, ce qui suggère que l'anticorps n'a pas au moinsinterférer avec les interactions entre les cellules endothéliales homotypiques. en plus de cela, les deux anticorps ne nuisent pas à la capacité des neutrophiles à migrer à travers la monocouche endothéliale. En outre, le nombre de neutrophiles qui transmigrent à travers la monocouche endothéliale, en l'absence ou en présence de l'anticorps n'est pas modifié (données non présentées). Fait important, la microscopie confocale à balayage laser nous donne la possibilité d'enregistrer différents canaux de fluorescence et DIC simultanément.
Ainsi, ce test permet d'étudier la dynamique de la VE-cadhérine et PECAM-1 en même temps quand un neutrophiles traverse la jonction cellule-cellule endothéliale et aidera à comprendre pourquoi les leucocytes choisissent une voie sur l'autre, c'est-à-paracellulaire contre transcellulaire.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |