Leukocytter krysse endothelial monolayer bruker paracellular eller transcellular rute. Vi har utviklet en enkel analyse for å følge den fordeling av endogent junctional VE-cadherin og PECAM-1 under leukocytt transendothelial migrasjon under fysiologiske strømmen til å diskriminere mellom de to Sjele ruter.
Under betennelse, leukocytter forlate sirkulasjonen og krysse endotelet å bekjempe invaderende patogener i underliggende vev. Denne prosessen er kjent som leukocytter transendothelial migrasjon. To ruter for leukocytter til endotelial krysser monolaget er blitt beskrevet: i paracellular rute, dvs. gjennom celle-celle kryss og transcellular rute, dvs. gjennom den endoteliske cellelegemet. Imidlertid har det vært teknisk vanskelig å skjelne mellom det para og transcellular rute. Vi har utviklet en enkel in vitro-analyse for å undersøke fordelingen av endogent VE-cadherin og PECAM-1 i løpet av nøytrofil migrering transendothelial under fysiologiske strømningsforhold. Før nøytrofile perfusjon ble endotelceller kort behandlet med fluorescently merkede antistoffer mot VE-cadherin og PECAM-1. Disse antistoffene ikke forstyrre funksjonen av både proteiner, som ble bestemt av elektrisk celle-substraTe impedans sensing og FRAP målinger. Ved hjelp av denne analysen, var vi i stand til å følge fordelingen av endogent VE-cadherin og PECAM-en under transendothelial migrasjon under strømningsforhold og diskriminere mellom para og transcellular trekkveier av leukocytter over endotelet.
Effektiv og kontrollert leukocytter transendothelial migrasjon (TEM) er av sentral betydning i fysiologiske prosesser som immun overvåking og akutt betennelse. Men under visse patofysiologiske forhold, ukontrollert og overdreven TEM er observert noe som resulterer i kroniske inflammatoriske sykdommer (f.eks revmatoid artritt, åreforkalkning, astma). Også i løpet av tumorcellemetastase, er prosessen transendothelial migrering instrumental for tumorceller til å forlate blodsirkulasjonen til metastasere 1-3. For å spesifikt forstyrrer dreven leukocytt eller tumorcelle TEM, er en detaljert forståelse av reguleringen av denne prosess nødvendig.
Det antas at den TEM prosessen skjer gjennom forskjellige trinn. Seminal studier, anmeldt to tiår siden av Butcher og Springer, førte til flertrinns modell som beskriver prosessen med TEM 4,5. Denne modellen fortsatt gjelder, selv om noen annonsesjonelle skritt er tatt med seks. Alon et al. Beskrevet behovet for tilstedeværelse av kjemokiner immobilisert på overflaten av endotelet 7. Nylig, viste de at endotelet i seg selv genererer kjemokiner som er presentert på endotelial apikale overflate 8.. Videre har den samme gruppen fremmet betydningen av strømningsforholdene i TEM 7. Nylig, kan flere publikasjoner fokuserte på de to forskjellige ruter leukocytter ta på den endelige diapedesis stadium av TEM. De kan enten gå gjennom celle-celle veikryss, dvs. paracellular trekkrute, eller krysse gjennom endotelceller kroppen, kjent som transcellular trekkrute ni. Carman og kolleger studerte disse banene i detalj og konkluderte med at leukocytter fortrinnsvis velge paracellular trekkrute (90%) over den transcellular rute (10%) når du krysser en umbilical vein endotelceller monolayer 10.Imidlertid, når endoteliale celler fra andre opprinnelse ble anvendt, for eksempel i hjernen eller microvasculature, flere leukocytter benyttet transcellular rute (30%) 11. Den Vestweber gruppe nylig viste at når celle-celle kryss ikke var i stand til å dissosiere fra hverandre ved hjelp av et banke-i dyremodell, og erstatte endogen VE-VE cadherin for en-cadherin-alfa-catenin chimera ble leukocytt TEM fullt blokkert 12 . Overraskende, forfatterne merke til at TEM ble blokkert i flere, men ikke alle vev. Samlet er disse elegante eksperimenter indikerte at leukocytter foretrakk paracellular rute over transcellular rute, selv om de regulatoriske signaler som utløser denne beslutningen er fortsatt ukjent.
Selv om majoriteten av leukocytter foretrekker paracellular trekkrute, er det fremdeles vanskelig å diskriminere mellom begge veier. I tillegg til det, til tross for flere studier som fokuserer på rollen til endotelceller-celle junctioner, dynamikken i disse knutepunkter, i særdeleshet de junctional proteiner VE-cadherin og PECAM-1, under leukocytt overgangen er fremdeles under debatt. Vi har utviklet en forholdsvis enkel analyse hvor disse koblingsmolekyler kan overvåkes i sanntid under leukocytt diapedesis under fysiologiske strømningsforhold ved hjelp av fluorescensmerket-merkede antistoffer. Disse antistoffene ikke forstyrre eller blokkere relasjonen eller mobilitet av de målrettede proteiner. Denne analysen gir oss mulighet til å følge dynamikken i junctional proteiner under prosessen av paracellular TEM. I tillegg gir denne analysen også å diskriminere mellom de para og transcellular vandringsruter.
For denne protokollen, er det viktig å unngå at det dannes luftbobler i strømningskamrene, siden dette vil resultere i celle apoptose og en avbrutt monolag. For å unngå dette, ønsker vi å understreke å være spesielt interessant for trinn 4.2 og 4.5, hvor rørene er koplet til strømningskammeret. Et annet kritisk punkt i protokollen er priming av PMNs som er holdt ved romtemperatur ved å inkubere dem i 15 til 30 min ved 37 ° C før injeksjon av dem til strømningskammeret (trinn 4.1). Dette resulterer i priming av leukocytt-integriner, som tillater dem å følge adhesjonsmolekyler slik som ICAM-1, eller VCAM-1 på endotelet.
Denne protokollen er ikke begrenset til å studere sjele av nøytrofile granulocytter. Også andre typer leukocytter slik som monocytter eller lymfocytter kan anvendes. Merk at trinn 4.1, dvs. grunning leukocytter kan variere mellom leukocytter typer. Dessuten kan andre typer av endotelceller benyttes. For dette er det fortsatt kritiskfor å stimulere endotelceller med passende inflammatoriske stimuli slik som TNF-eller IL-α 1β. Hvis neutrofiler ikke reagerer i transmigrating, kan man vurdere å behandle den nøytrofile kort (5 min) med N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (fMLP) peptid 16. Dette vil stimulere nøytrofiler, særlig deres integriner, enda mer, noe som gjør dem mer utsatt for å overholde den endotel.
Vanligvis 1 dyn / cm 2 strømningshastighet benyttes. Denne flyten hastighet måles i post-kapillære venules, steder hvor de fleste leukocytter transendothelial migrasjon oppstår 17. Ved hjelp av de beskrevne strømnings-kamre, er det mulig å øke strømningshastigheten opp til 10 dyn / cm 2. Imidlertid er det ikke anbefalt å øke skjær ytterligere. Det kan resultere i uønsket lekkasje av produksjonsrøret, og løsgjøring av celler fra strømningskammeret.
Resultatene er beskrevet i figur 3 indikerer at disseAntistoffene kan anvendes til å visualisere og studere dynamikken i endotel-celle-celle kryss under leukocytt diapedesis. Spesielt, i tillegg til de eksisterende Sjele assays denne protokollen tillater å diskriminere paracellular fra transcellular migrasjon under fysiologiske strømningsforholdene i sanntid. Siden antistoffene flekken celle-celle veikryss, kan man score mange leukocytter som krysser VE-cadherin / PECAM-1-positive veikryss versus nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 steder. På denne måten transcellular migrasjon kan bli diskriminert fra paracellular migrasjon.
Det er viktig å understreke at disse antistoffene ikke forstyrre funksjonen av de proteinene binder til: den PECAM-1 antistoff som brukes i denne undersøkelsen er rettet mot den andre ekstracellulære domene. Endoteliale celler som ble platet i nærvær av antistoffet viste ingen defekter i spredning eller å danne et monosjikt, og antyder at antistoffet i det minste ikke gjordeforstyrre homotypic interaksjoner mellom endotelceller. i tillegg til at do begge antistoffer ikke svekke evnen av neutrofiler til å migrere gjennom den endoteliske monolag. I tillegg er antallet nøytrofiler som transmigrere tvers av endotelial monolag i fravær eller nærvær av antistoffene ikke endret (data ikke vist). Viktigere, konfokal laser scanning mikroskopi gir oss muligheten til å ta opp ulike fluorescerende kanaler og DIC samtidig.
Dermed kan denne analysen studere dynamikken i VE-cadherin og PECAM-en på samme tid når en nøytrofile krysser endotelceller-celle krysset og vil bidra til å forstå hvorfor leukocytter velge en rute over den andre, dvs. paracellular versus transcellular.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |