Summary
Enkelt fluoroforene kan lokaliseres med nanometerpresisjon ved hjelp FIONA. Her en oppsummering av FIONA teknikken er rapportert, og hvordan å utføre FIONA eksperimenter er beskrevet.
Abstract
Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy-planet. Her en oppsummering av FIONA teknikken er meldt og eksempler på forskning som er utført ved hjelp av FIONA beskrives kort. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan man kan gjennomføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, etterfulgt av bruk av FIONA for å måle den 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk kvante, er illustrert. Endelig er siste forsøk på å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Det er vist at ved hjelp av en vannimmersjonsobjektiv og kvanteprikker dynket dypt i sol-gel og kaninøyne hornhinner (>200 mikrometer), lokaliseringspresisjon på 2-3 nm kan oppnås.
Introduction
Rundt 1882, Ernst Abbe fant at oppløsningen på en synlig lys mikroskop er ~ λ / 2NA, eller ~ 200 nm (der λ er bølgelengden og NA er numerisk apertur) 1,2. Derfor hvilket som helst objekt som er mindre enn denne dimensjonen ville fremstå som en diffraksjon-begrenset plass i en optisk mikroskop. Det er imidlertid mulig å bestemme senteret av stedet, det vil si plasseringen av gjenstanden, med en mye høyere presisjon 3. Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy planet fire. Presisjonen av lokalisering, σ μ (dvs. standardfeilen for gjennomsnittet), avhenger av den totale antall innsamlede fotoner, 
, Der N er fotontelling, er s standardavviket for det fluorescerende flekk, er enpikselstørrelse på bildedetektoren, og b er standardavviket av bakgrunnen 3,4. For en Fluoroforen emitting ~ 10.000 fotoner, kan FIONA oppnå ~ 1 nm presisjons fire.
Fiona kan brukes til å bestemme den nøyaktige posisjonen til en stasjonær emitter, eller et bevegelig en (forutsatt at bilder kan tas raskt nok). Fiona kan påføres sekvensielt til rammene av filmen og således følge bevegelsen av enkelt molekyl 4- 8. Foto-beskyttende reagenser kan være nødvendig for å sikre at prøven ikke photodegrade. Videre kan den fluorescerende gjenstand i seg selv være av en hvilken som helst størrelse, mindre eller større enn den diffraksjon limit- f.eks, kan det bestå av et organeller (~ 1 mm) med mange fluorescerende proteiner dispergert på sin membran. Bruke FIONA kan fortsatt gi en svært nøyaktig (nanometer) gjennomsnittet av gjennomsnittlig sentrum-of-mass. Den store forbedringen i lokalisering presisjon av Fiona kan løse nanometer-skala bevegelser over tid. Dette har presset mikros inn i den molekylære lengdeskala 4- 8.
Siden oppfinnelsen sin, har varianter av FIONA blitt utviklet. For eksempel, lyse-feltet bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (bFIONA) 9, en liten variant av FIONA, bilder og lokaliserer tette objekter som melanosomer in vivo (mørke objekter som inneholder pigmentet melanin) med lyset. I tillegg har Fiona blitt benyttet for å løse flere fargestoffer. For eksempel har 12 blitt utviklet single-molekyl bildebehandling med høy oppløsning med fotobleking (reker) 10,11 eller enkelt-molekyl høy oppløsning colocalization (SHREC) for å løse to fargestoffer innenfor ca 10 nm. (Legg merke til at dette er oppløsning, dvs. hvor nøyaktig man kan si identiske fargestoffer fra hverandre.) Mer nylig har FIONA analyse bidratt til lokaliseringsprosessen av visse super-oppløsning mikroskopi som stokastiske optiske anbefanstruction mikroskopi (STORM) 13- 15 og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) 16, i hvilket midlertidige mørke fluoroforer er spent, og fluorescensen er lokalisert. Ved gjentatte ganger spennende en ganske lav densitet av fargestoffer (mindre enn én pr diffraksjon begrenset sted), og deretter oppsamling av fluorescens, analysere hver av dem av Fiona, kan man bygge opp et kart med høy oppløsning. Oppløsningen er da bare begrenset av antallet av fotoner hver fargestoff legger ut, samt ting som å holde prøven i ro (inkludert, for eksempel, objektbordet) i ervervet.
I denne utredningen, et sammendrag av FIONA teknikk og kort beskrive eksempler på forskning som er utført ved hjelp av Fiona er rapportert. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan duutføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, er illustrert. Etter det, til bruk av FIONA måle 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk quantum er presentert. Myosin Va er en viktig processive motor protein som bærer cellular last mens translocating langs aktin filamenter. Her en myosin Va konstruere avkortede brukes til å fjerne irrelevante domener til trinnstørrelsen, og med en FLAG tag tilsatt til C-terminus for å tillate enkel merking med kvanteprikker funksjon med anti-FLAG-antistoffer. Dette eksperimentet er gjort under lav ATP å forsinke myosin og tillate bruk av lange nok eksponeringstider for å få en god foton teller i hver ramme. Enhver tilstrekkelig sterkt fluorescerende markør kan være substituert i den følgende protokoll. Endelig er siste innsats for å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Som en proof-of-prinsippet, ble kvanteprikker gjennomvåti sol-gel og kaninøyne hornhinner og deretter avbildes og lokalisert ved hjelp FIONA. For bildebehandling, en 60X vannimmersjonsobjektiv med NA = 1.2 ble brukt fordi dette målet har en lengre arbeidsavstand enn tidligere brukte 100X oljeneddyppingsobjektivet. For å kompensere tapet i forstørrelsen i målet, ble en ekstra forstørrelse objektivet (3,3X eller 4,0X) satt i utslippsbanen. I tillegg, epi-fluorescens (ikke TIR) mikroskopi må brukes for å få tilgang dype områder i de tykke prøver. Det er vist at kvanteprikker dynket dypt i sol-gels og i kaninøyne hornhinner (Z> 200 mikrometer) kan lokaliseres med 2-3 nm presisjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Hornhinnen vev fra kaniner ble innhentet i samsvar med University of Illinois Institutional Animal Care og bruk retningslinjer.
1. TIRFM Setup
MERK: Bruk laser-vernebriller hele tiden.
- Kontroller at alle nødvendige optiske komponenter som er oppført i listen over Materialene er tilgjengelige og klare for justering. Du kan eventuelt bruke substitutter med tilsvarende funksjoner fra andre selskaper. Sørg for at speil og linser bør ha anti-reflekterende (AR) belegg som samsvarer med laser i bruk.
- Sett høyder av alle de optiske komponentene til høyden av midten av mikroskop bakre port.
- Monter laser, laser skodde og ND-filter (e). Bruk ND filter for å dempe lasereffekten ned så lavt som mulig samtidig som strålen er synlig. Stram skruene med riktige unbrakonøkler.
- Planlegg en strålebanen og merk den med tape eller markør på den optiske tabellen (dotted blå linjer i figur 1). For enkelhets skyld holde rette baner langs linjene av hull på den optiske bordet.
- Plass speil M1 (figur 1) på det første rett vinkel sving. Plasser de to iriser langs andre rett delen av den planlagte strålebanen. Juster både posisjonen og vinkelen M1 slik at laseren går gjennom iriser.
- Plass speil M2 (figur 1) ved den andre rett vinkel sving. Plasser 10X strålen ekspander (L1 og L2, figur 1) langs den tredje rette delen av banen. Juster sin skråstilling slik at strålen ekspanderen er parallell med både den optiske bordet og den planlagte strålebanen.
- Juster M1 og M2 iterativt slik at laseren går Straightly gjennom sentrene av begge linser av strålen ekspander. Gjenta dette trinnet til bjelkeprofil utvidet strålen er ikke-avkuttet Gaussian.
- Juster M1 å sentrere trålen på L1 (Fifigur 1), og M2 for å sentrere strålen på L2 (figur 1) iterativt. En dårlig bjelkeprofil betyr vanligvis laseren er klippet; bruke et stykke av hvitt papir for å blokkere strålen etter at strålen ekspander for å kontrollere bjelkeprofil med øynene. For høy presisjon analysen bruker en optisk bjelke profiler.
- Justere avstanden mellom L1 og L2 slik at strålen er kollimert. Gjenta trinn 1.8 og 1.9 om nødvendig.
MERK: Når størrelsen strålen ikke endres med avstanden, er kollimert nok for en TIRFM oppsett strålen. For ytterligere å forbedre stråle kollimasjon, kan verktøy som for eksempel en skjær interferometer anvendes. En typisk bjelketykkelse etter ekspansjon er ~ 20 mm. - Shutter laser. Skru av mikroskop objektiv og skru i en fluorescerende innrettingsmål. Plass speil M3 og M4 (figur 1) for å lede den ekspanderte stråle inn i mikroskopet porten og ut mot den dikroiske speilet inne i tårnet. Sørg for at laserstrålen spretter av than dichroic og mot taket.
- Juster M3 for å sentrere den lyseste del av strålen på det fluorescerende mål, og M4 for å justere stråleskråstilling for å være loddrett.
- Shutter laser og skru målet igjen. Hvis justeringen i forrige trinn er gjort godt det bør være en symmetrisk sted avslutter målet. Finjustere vippes av M3 og M4 for å optimalisere laser makt og strålen profil ut av målet.
- Montere en EMCCD kamera til mikroskopet og koble kameraet til en datamaskin. Start programvaren for kameraet.
- Monter en fluorescerende prøve (løsning av fluoroforer) på mikroskopet. Se på den lyse fluorescerende flekk på kameraet. Sjekk at spot ikke skifte ikke på skjermen som fokuset er endret.
- Plasser TIR linsen (L3, figur 1) på XYZ oversettelsestrinn i en avstand fra baksiden fokalplanet for det formål som er lik brennvidden L3 (~ 30 cm). Juster posisjonen L3slik at laseren går gjennom sentrum av linsen.
- Trans L3 langs strålebanen for å justere stråle kollimasjon. Pass på at strålen er fortsatt sentrert på skjermen og symmetrisk i formen.
MERK: belysning område på prøven flyet øker med mink TIR objektivets brennvidde. Generelt bør du bruke den minste brennvidde som kan passe på set-up. - Trans L3 perpendikulært på strålebanen for å skråstille bjelken i målet. Hold sette TIR objektivet slik at TIR er oppnådd. Observere et utvalg av fluoriserende perler gjennom EMCCD kamera, og finjustere L3 for å få god SNR.
Figur 1. Optisk konfigurasjon for total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM).
2. FIONA på Cy3-DNA
- Cmagre objektglass og dekkglass: Skyll objektglass og dekkglass med DDH 2 O og isopropanol og tørk dem med nitrogengass; plassere lysbilder og Dekk i plasma renere for 5 min under argon plasma.
- Konstruere eksempler kamre (som skissert i figur 2).
- Plasser en vev på benken og deretter sette et stykke linsepapir på toppen av vev. Plasser lysbildet på linsepapir. Sørg for at den rene siden av lysbildet er oppover.
- Påfør to strimler av dobbeltsidig teip på lysbildet langs langsidene, og etterlater et gap på 3-5 mm på midten. Plasser renset dekkglass på toppen av lysbildet. Sørg for at den rene siden av dekk vender lysbildet.
- Bruk en pipette til å presse ned over dobbeltsidig tape. Bruk en barberhøvel for å fjerne overflødig tape fra raset slik at båndet er fortsatt bare under dekkglass.
MERK: De åpne endene av kammeret blir stående åpne og tjene som innløp og ututleid. Den kammervolum er flere mikroliter.
Figur 2. Skisse av en typisk prøvekammeret (a) Sett ovenfra.; (B) Sett fra siden fra høyre; (C) Sett fra siden forfra.
- Cy3-immobilisere DNA på indre overflater av prøvekamrene.
- Forbered T-50 buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Forbered BSA-biotin i T-50 til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Forbered T50-BSA-buffer ved å oppløse BSA i T-50 til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml.
- Forbered 0,5 mg / ml neutravidin i T50-BSA buffer. Forbered biotinylert Cy3 merket DNA (Cy3-DNA) i T50-BSA ved en sluttkonsentrasjon på 5-10 pM.
- Pipetter 10 mL BSA-biotin (1 mg / ml) inn i prøvekammeret. Vent i 5 minutter.
- Vask kammeret med 40 pl T50-BSA. Pipetter 20 ul Cy3-DNA inn i prøvekammeret. Inkuber i 5 min, og deretter vaske med kammeret 80 mL T50-BSA.
- Bilde Cy3-DNA enkle molekyler henhold TIRFM.
- Forbered avbildning buffer (100 pl) ved å blande 1 ul Protocatechuate-3,4-dioksygenase (PCD, 5 mM), 4 pl Protocatechuic syre (PCA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroksy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-karboksylsyre (Trolox, 2 mM i T-50), og 45 pl T50-BSA.
- Pipetten 30 pl bildebuffer og vente i 8-10 min.
- Monter prøven for avbildning på en TIRFM som er utstyrt med en grønn laser (532 nm), en 100X oljeneddyppingsobjektivet (1,45 NA), og en EMCCD kamera.
- Sett eksponeringstiden til 100 til 500 msek og EM gevinst til 25 til 100. Skaff en film av prøven for 1,000 rammer.
- Utfør FIONA dataanalyse på de innspilte bilder av Cy3-DNA.
- Bestem effektiv pikselstørrelsen (dvs. omregningsfaktor fra piksler til nanometer) ved å dele den fysiske pikselstørrelse (leses fra spesifikasjonsarket av EMCCD kamera) av den totale forstørrelsen (forstørrelsen av mikroskopet mål multiplisert med noen ekstra forstørrelser).
- Bestem omregningsfaktor fra pixel intensiteter for foton tall ved å dele CCD følsomhet (dvs. elektroner per A / D telle, lese fra spesifikasjonsarket for CCD-kamera) av elektronet multiplikator (EM) gevinst brukt under bildet oppkjøpet.
- Kompilere og kjøre FIONA.pro for FIONA analyse. Bruk dette IDL program for å importere det oppkjøpte bildet, for å legge inn den effektive pikselstørrelse (fra Trinn 2.5.1) og omregningsfaktor fra intensiteten til foton nummer (fra trinn 2.5.2), og til å velge plasser for FIONA analyse.
MERK: På slutten, det program vilje utgang monterings resultater med 2D Gaussisk funksjoner, samt total foton tall og lokalisering presisjon. Et typisk resultat er vist i den delen av representative resultater og figurene 4c-4d. - Kompilere og kjøre phcount.pro å karakter foton teller. Bruk dette IDL programmet for å måle gjennomsnittlig antall fotoner som sendes ut av en fluoroforen før fotobleking, for å importere den oppkjøpte bildet og for å legge inn omregningsfaktor fra intensiteten til foton nummer (fra trinn 2.5.2).
MERK: Programmet vil da oppdage fluorescerende flekker automatisk (manuelt valg er et alternativ), beregne foton teller som en funksjon av ramme nummer, og utgang spor av foton teller.- Kast dårlige spor og angi rammeområder etter fotobleking for baseline korreksjon. På slutten, vil programmet generere en liste over totalt foton tall for alle flekkene ikke kastes. Deretter plotte fordelingen av foton tall og passe fordelingsjon med en eksponensiell desintegrasjon å oppnå den gjennomsnittlige foton nummer. Et typisk resultat er vist i den delen av representative resultater og figurene 4e-4f.
3. FIONA Applied å kvantifisere Motor (f.eks Myosin på Actin) Dynamics på nanometernivå
- Polymer aktin (dvs. forberede F-aktin) en dag før FIONA eksperiment.
- Rekonstituer G-aktin (monomer), og biotin G-aktin (monomer) til 10 mg / ml med generell aktin buffer. Rør for å sørge for begge er helt oppløst, og holde både på is.
- Bland 10 ul G-aktin (monomer) med 1,7 mikroliter biotin G-aktin i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 100 mL iskald aktin polymerisasjon buffer.
- La blandingen over natten ved 4 ° C (F-aktin dannet) og deretter legge DDH 2 O i et totalt volum på 1 ml.
- Oppbevar actinfilamenter (F-aktin) ved 4 ° C for senere anvendelse i eksperimentene.
MERK: Fibre vil gå i oppløsning og forkorte seg over tid, men kan brukes i minst to uker.
- Forbered utvalget for bildebehandling.
- Gjør en prøvekammeret (som beskrevet i protokoll 2.1 og 2.2). Pipette i 20 mL Biotinylated BSA på 1 mg / ml i DDH 2 O. Inkuber i 10 min. Skyll med 30 mL DDH 2 O.
MERK: Dette blokkerer glassflaten og fastsetter biotin for binding av aktin filamenter. Biotinylert poly-L-lysin - polyetylenglykol (PLL-PEG) kan tjene den samme funksjon. - Pipetten 0,5 mg / ml neutravidin. Inkuber i 2 min, og deretter vaskes i kammeret med 30 ul buffer M5.
- Pipette i den klargjorte F-aktin fortynnet 25 ganger i buffer generelt aktin, til endelig konsentrasjon ~ 0,004 mg / ml. Vent 10 min, skyll kammeret med 30 mL buffer.
- Fortynn myosin Va med FLAG-koder 30-fold i M5-buffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) til en sluttkonsentrasjon of 250 nM. Bland 1 pl myosin med 1 pl Anti-Flag-Qdot705 (~ 1 mikrometer, konjugert fra Anti-Flag antistoffer og Qdot705 bruker Qdot705 antistoffkonjugering Kit i henhold til bruksanvisningen fra produsenten). Legg i 8 mL M5 å fylle til 10 mL. Pipette opp og ned for å blande godt. Inkuberes i 10 minutter på isen.
MERK: Dette gir en blanding av en motor til 4 kvanteprikker, på ~ 25 nM myosin konsentrasjon.
- Gjør en prøvekammeret (som beskrevet i protokoll 2.1 og 2.2). Pipette i 20 mL Biotinylated BSA på 1 mg / ml i DDH 2 O. Inkuber i 10 min. Skyll med 30 mL DDH 2 O.
- Avbildning av myosin går på aktin.
- Forbered avbildning buffer (100 pl) ved å blande 84 mL M5-BSA (M5 buffer med 1 mg / ml BSA), 1 pl ATP (50 uM i DDH 2 O), 2 pl DTT (500 mM i DDH 2 O), 1 ul CK (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 mL PCA, 1 ul myosin-qdot etter fortynnet ytterligere 10 ganger til 2,5 nM myosin konsentrasjon, og 1 ul BME.
- Pipetten 20 ul bildebehandling buffer å prøve kammer og inkuberes i 8-10 min.
- Bilde prøven på TIRF mikroskop ved 30 msek eksponering. Tilegne seg minst 1000 rammer. Juster volumet av myosin-qdot i trinn 3.3.1 om nødvendig.
- Utføre dataanalyse og finne trinn størrelsen myosin gang.
- Åpne videofilen i ImageJ 17 og beskjære video rundt et bevegelig spot. Beskjære et stort nok område at spot aldri blir innen 20 piksler i kanten, og pass på at det ikke er noen andre steder i videoen. Sørg for at dette punktet beveger seg i en lineær sti.
- Spor stedet gjennom videoen for å generere x og y-koordinater gjennom tid, i piksler, ved å bruke FIONA analyse (trinn 2.5.3) til hver og rammen i videoen.
- Konvertere piksler til nanometer, som beskrevet i forrige avsnitt.
- Beregn forskyvning fra den første posisjon som en funksjon av tiden.
- Kjør t-test på forskyvningen for å oppnå de trinn myosin vandre.
MERK: Programmet gitt for t-test (step_t_test.zip) er kodet i IDL og conbestår av 14 subrutiner i mappen.- Åpne alle subrutiner i IDL og kompilere alle to ganger. Deretter kjører mtltyanalysis_ttest.pro og velge en tekstfil som inneholder bare avstandsdataene i en enkelt kolonne. En utgang Excel-fil vil bli generert, inneholder rådata, passform, og den trinnstørrelse.
- Slett alle null-verdier fra trinn-størrelse kolonnen. Plotte fordelingen av trinnet størrelser ved hjelp av Origin eller MATLAB. Monter en Gaussian til histogrammet.
MERK: Trinn størrelser av null-verdier trenger å bli slettet fordi et trinn på null betyr at ingen trinn er tatt fra foregående ramme. Beslaget gir en topp rundt 36 nm (som vist i figur 5).
4. Tykk Prøvepreparering for FIONA
- Forbered kvanteprikker innkapslet i sol-gel.
- Bland 4,5 ml TMOS, 1 ml DDH 2 O og 100 mL HCl (120 mm). Sonicate blandingen på is i 30 min i ultralydrenser specified i List of Materials (frekvens = 40 kHz, motorvarmer = av). Bland løsningen hvert 10 min.
- Fortynn 1,5 pl Qdot605 i 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Bland-løsning med 1,5 ml TMOS fra det foregående trinnet.
- Hell røren i en glassbunn parabolen. Forsegle glassbunn parabolen med Parafilm og oppbevar ved 4 º C for 1. 5 hr.
- Tilsett 2 ml 1% BME i PBS til prøven fatet og inkuber ved romtemperatur i 30 min før avbildning.
- Forbered hornhinnen prøven farget med kvanteprikker.
MERK: Rabbit-øyne var gaver fra Dr. Marina Marjanovic.- Separer hornhinnen fra øynene og skjær den i 3 mm x 3 mm stykker.
- Fortynn 1 pl Qdot 605-streptavidin i 1 ml PBS. Inkuber hornhinnen vev med 1 Nm Qdots løsning ved 4 ºC 1 time. Vask vevet med PBS.
- Ta et rent glass lysbilde og en # 1.5 dekkglass. Sett 4 lag dobbeltsidig tape på glasset glir langs den lengste siden, ennd sette ytterligere 4 lag med dobbeltsidig tape parallelt med forrige tape og la en kanal om en cm i mellom. Sett vev fra det foregående trinn i midten av kanalen, og dekke den med et dekkglass.
- Trykk forsiktig på sidene av dekkglass for å gjøre det holde seg til kassetter. Fukt-kanal med 50 ul PBS før avbildning.
- Bilde kvanteprikker i sol-gel og hornhinnen.
- For FIONA bildebehandling i tykke prøver, bruk en 60X vann-immersion objektiv med arbeidsavstand på 0,27 mm, eller en 60X vann-immersion objektiv med arbeidsavstand på 0,28 mm.
- Monter prøven på mikroskopet. Juster TIRF linsen slik at den når den epi-fluorescens modus (dvs. laserstråle som kommer ut av objektivet med en vinkel mot dekkglass). Sett inn en ekstra forstørrelse objektivet (3,3X eller 4,0X).
- Beveg fokalplanet til objektivet til en ønsket posisjon z (f.eks> 200 um). Ta bilder av immobilekvanteprikker i utvalget.
- Utfør FIONA analyse som beskrevet i kapittel 2.5 i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk mål-type TIRFM oppsettet er vist i figur 3.. Først ble overflate-immobilisert Cy3-DNA-prøven avbildes. Et typisk bilde er vist på figur 4a. Bildet ble tatt med eksponeringstid 0,5 sek, med EM gevinst = 50 og CCD følsomhet = 12.13 for kameraet. Den punkt-spredning-funksjon (PSF) av et enkelt Cy3-DNA-molekylet er vist i figur 4b (fra stedet indikert med pilen i figur 4a), hvor farge-bar viser skalaen piksel intensiteter. Den faktiske foton teller kunne beregnes ved å multiplisere piksel intensiteter av en omregningsfaktor, α = CCD følsomhet / EM gevinst. Dette stedet inneholder ca 14.000 fotoner (etter korreksjon for bakgrunnen).
Den PSF er da utstyrt med en to-dimensjonal gaussisk funksjon, f (x, y) = z 0 + A • exp (- (x-μ x) 2 / (2s x 2) - (y - & #181; y) 2 / (2s y 2)), som vist i figur 4c (med sittende rester vist på figur 4d). Presisjonen lokalisering beregner deretter 
, Hvor i = x eller y, s i er standardavviket av armaturen, er N det totale antall fotoner, a er pikselstørrelsen, og b er standardavviket til bakgrunnen. I dette konkrete eksempelet, N = 14 528, a = 106,67 nm, s x = 115,5 nm, s y = 109,4 nm, b = 18.9, noe som resulterer i lokaliserings presiseringer av σ x = 1,3 nm og σ y = 1,2 Nm. Lokalisering presisjon av en fluorofor er omtrent proporsjonal med 1 / √N, dvs. jo flere fotoner er, jo mer presis lokalisering. Men i faktiske anvendelser av FIONA, er varigheten av eksperimentell observasjon en annen vurdering. Derfor enGenerelt bør innse kompromisset mellom lokalisering presisjon og observasjon varighet og planlegge fremover. I slike situasjoner, er det vanligvis nyttig å bestemme hvor mange fotoner totalt en fluorofor er i stand til å slippe ut før fotobleking. Et typisk spor av fotontelling g rammen er vist i figur 4e. En eksponentiell tilpasning gir at det gjennomsnittlige antallet foton ~ 1,4 x 10 6 (figur 4F).
Den dataanalyseprosess av myosin trinnstørrelse måling er vist i figur 5. Først en videofil med godt signal-til-støy av en enkelt myosin som den går langs en aktin filament er fanget. Figur 5a viser tre bilder fra en video tatt på 100 msek eksponering med 100X oljeneddyppingsobjektivet. Den bevegelige PSF deretter spores gjennom det beskårne videofil med en egendefinert kode skrevet i IDL å trekke avstand versus tidsinformasjon, som er satt gjennom en T-testfor trinn. Figur 5b viser med avstanden versus tid (rød) og step-finder-utgang (hvit). Lokaliserings feil i hver ramme tilslører trapp formen på kurven, så det er viktig å oppnå en fotontelling i hver ramme som tilsvarer en lokaliseringsfeil mindre enn halvparten av den teoretiske trinn størrelse man ønsker å se. Figur 5c viser fremgangsmåten fra flere spor kombinert i ett histogram som er Gaussian-distribuert om den sanne myosin trinnstørrelse. En gaussisk skikket til histogram binger gir et siste trinn størrelse måling av 35,8 ± 0,4 nm.
Fordi sol-gel og hornhinne prøvene er gjennomsiktig, kan eksitasjon lasere trenge dypt ned i prøvene uten å bli spredt for mye. I tillegg er den auto-fluorescens fra prøven minimert. Når merket med lav konsentrasjon av kvante prikker, er det mulig å samle fluorescens fra Qdots dyp i prøven med høyt signal til støyforhold. DenBruken av objektiv vann gir oss arbeidsavstand på 270 eller 280 mikrometer, noe som betyr at det er mulig å fokusere så langt som 280 mikrometer bort fra dekkglass. Dette gir oss muligheten til å utføre FIONA analyse på kvanteprikker i tykke prøver. For kvanteprikker i en sol-gel, prøven lokalisering presisjon på 1-2 nm nær dekkglass og 2-3 nm til 280 um dypt inn i prøven (Figur 6a-6b) er oppnådd. For kvanteprikker i en biologisk prøve (del av en hornhinne fra en kaninøyne, Figur 6e), lokalisering nøyaktighet på 1-2 nm nær dekkglass og 2-3 nm på ~ 223 mikrometer dypt inn prøven (Tall 6c-6d) er oppnådd. Det skal bemerkes at lokaliseringspresisjon er forbedret ved hjelp av den ekstra forstørrelseslinse, uten som en lokaliseringspresisjon på 6-7 nm ble oppnådd. Dette er i samsvar med tidligere numeriske studier som viser at lokaliseringen nøyaktighet kan forbedres ved å endre den effektive pikselstørrelse fra ~ 200nm til ~ 50 nm selv om det totale antall innsamlede fotoner kan være lavere grunnet flere refleksjoner / refraksjoner 18.
Figur 3. Optisk konfigurasjon. Optiske konfigurasjon av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikros a.) Er et bilde når laseren er i TIRF tilstand, og b) er stråleform av laseren på taket når laseren er i epi-belysning.
Figur 4. Lokalisering av immobilisert Cy3-DNA. A) CCD bilde (256 x 256 piksler) av Cy3-DNA. B) CCD bilde av en enkelt Cy3-DNA-molekylet, angitt av yellav pilen a). c) Montering av punktspredefunksjon av singel Cy3-DNA-molekyl med en to-dimensjonal gaussisk funksjon. d) Montering av residualene fra c). e) Photon telle g rammenummer. f) Fordeling av antall fotoner som sendes ut av Cy3 molekyl før fotobleking. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Myosin walking observert av Fiona. a) rammer fra eksempel datafilen tilsvarer t = 0 sek, 30 sek, og 60 sek. Myosin-qdot konstruere beveger seg i langs en rett vei og har en god foton count (> 5000) i hver ramme. B) Anvendelse av FIONA til hver ramme yields en avstand versus tid spor som er plottet i rødt. En trinn-for å finne algoritme basert på T-testen brukes til å så trekke ut enkelte trinn, og produksjonen er kledde i hvitt. Trinn størrelser er merket i hvitt i enheter av nanometer. C) steg fra flere spor er kombinert i et histogram. De målte trinn størrelser er Gaussian-distribuert ca 35,8 ± 0,4 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. FIONA analyse på kvanteprikker dypt i tykke prøver. A) fluoriserende bilde av QD 605 i sol-gel ved Z = 280 mikrometer med 90X forstørrelse. B) punktspredefunksjon av QD-merket i a). σ x = 2.6 nm, σ y = 2,3 nm. Hver enhet i X-og Y-aksen representerer 266,7 nm. C) fluoriserende bilde av QD 655 i kanin hornhinne vev ved Z = 223 mikrometer med 360x forstørrelse. D) PSF av QD merket c). σ x = 2,2 nm, σ y = 3,6 nm. Hver enhet i X og Y-aksen representerer 44,4 nm. E) Bilder av hornhinnen vev montert på et dekkglass. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiona er en teknikk for å lokalisere posisjonen til et fluorescerende emitter (organisk fluoroforen eller quantum dot) med nanometer presisjon og tidsmessig oppløsning ned til 1 ms 4- åtte. Når nok fotoner er samlet, gir denne teknikken for å bestemme plasseringen av et fluorescerende emitter mye mer nøyaktig enn diffraksjon grense (~ 200 nm) og dermed denne teknikken åpner en måte å observere hva som ikke har blitt sett med konvensjonell / tradisjonell optisk mikros 4 - 8. Siden oppfinnelsen sin, har FIONA blitt brukt til å observere gang av mange molekylære motorer, som for eksempel myosins og kinesins. Flere nylig, det, sammen med annet arbeid 3,19, bidro til lokaliseringsprosessen av visse nye super-oppløsning teknikker som STORM og PALM 13- 16.
Det kritiske trinnet for å oppnå Fiona ligger i antall innsamlede fotoner, som blir påvirket av en rekke faktører. For eksempel bør den TIRFM oppsettet som brukes for FIONA eksperimenter være godt justert slik at en god PSF (dvs. ikke-strukket, ikke-brennemerket, etc.) er oppnådd, og en rimelig signal-til-støy-forholdet oppnås. I tillegg bør et mål med høy NA verdi benyttes for å samle så mange fotoner som mulig.
Å samle flere fotoner og dermed å øke lokalisering presisjon, har ulike oksygen åtseldyr metoder og reagenser blitt utforsket til å undertrykke fotobleking og blinkende 20- 22. To ulike oksygen-scavenging metoder har blitt brukt i vår lab. Det ene er "gloxy" løsning (glukose oksidase og katalase) 20. Den andre er PCA / PCD beskrevet ovenfor 22. De tidligere verk umiddelbart etter blanding, men pH-verdien av løsningen endrer seg over tid. Sistnevnte holder løsningen kjemisk uforandret, men en inkubasjonstid på 8 til 10 minutter er nødvendig.
As vist her, er det også mulig å utvide FIONA for tykke prøver ved hjelp av en 60X vannimmersjonsobjektiv med NA = 1.2. Dette målet har en lengre arbeidsavstand (0,27 mm) enn tidligere brukte 100X oljeneddyppingsobjektivet (0,17 mm). For å arbeide på tykke prøver, må epi-fluorescens mikroskopi som skal brukes. Selv om fordelen av lav bakgrunn av TIRFM er ofret, er nanometer lokalisering presisjon fortsatt oppnåelig mens du bruker lyse kvanteprikker. Denne utvidelsen vil være nyttig i tykk vev bildebehandling og medisinsk bruk.
Anvendelsen av Fiona er begrenset i noen aspekter. Først av alt, som i lokalisering presisjon avhenger av det totale antall innsamlede fotoner, temporal oppløsning av Fiona er vanligvis svekket. For det andre kan FIONA alene bare brukes på tynt merkede prøver. Med andre ord, vil FIONA mislykkes hvis flere fluorophores er nær nok slik deres PSFs lapper. I tillegg, spredning av utslipps lys begrenser application av FIONA i tykk-vev-imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants 068625, NSF Grants 1.063.188 og Center of the Physics of levende celler 0822613. spesiell takk går til Dr. Marina Marjanovic i Beckman Institute for Advanced Science and Technology for gaven av kaninøyne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
- Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R.
- Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
- Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
- Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R.
- Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
- Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
- Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
- Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J.
- Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
