Summary
Enstaka fluoroforer kan lokaliseras med nanometerprecision med hjälp FIONA. Här en sammanfattning av den FIONA teknik rapporteras, och hur man utför FIONA experiment beskrivs.
Abstract
Fluorescens avbildning med en nanometer precision (FIONA) är en enkel men användbar teknik för att lokalisera enskilda fluoroforer med nanometerprecision i xy-planet. Här en sammanfattning av den FIONA teknik redovisas och exempel på forskning som har utförts med användning av FIONA beskrivs kortfattat. Först, hur man ställer in den nödvändiga utrustningen för FIONA experiment, det vill säga en total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM), med information om att rikta optiken, beskrivs. Sen hur man genomför ett enkelt FIONA experiment på lokalisera immobiliserade Cy3-DNA enstaka molekyler med hjälp av lämpliga protokoll, följt av användning av FIONA att mäta 36 nm steget storleken på en enda stympad myosin Va motor märkt med en kvantprick, illustreras. Slutligen är senaste försök att utvidga tillämpningen av FIONA till tjocka prover rapporterades. Det visar sig att, med hjälp av en vattenimmersionsobjektiv och kvantprickar indränkt djupt i sol-geler och kaninögonhornhinnor (>200 | im), lokalisering precision 2-3 nm kan uppnås.
Introduction
Omkring 1882, Ernst Abbe fann att utgången av en synlig ljusmikroskop är ~ λ / 2NA, eller ~ 200 nm (där λ är våglängden och NA är den numeriska aperturen) 1,2. Därför något föremål som är mindre än detta mått skulle framstå som ett diffraktionsbegränsad plats i ett optiskt mikroskop. Emellertid är det möjligt att bestämma den centrala platsen, dvs placeringen av objektet, med en mycket högre precision 3. Fluorescens avbildning med en nanometer precision (FIONA) är en enkel men användbar teknik för att lokalisera enskilda fluoroforer med nanometerprecision i xy-planet 4. Precisionen av lokalisering, σ μ (dvs standardavvikelsen för medelvärdet), beror på det totala antalet insamlade fotoner, 
, Där N är fotonräkning, s är standardavvikelsen för den fluorescerande fläck, är enpixelstorleken av avbildningsdetektorn, och b är standardavvikelsen för bakgrunden 3,4. För en fluorofor avger ~ 10000 fotoner, kan FIONA uppnå ~ 1 nm precision 4.
FIONA kan användas för att exakt bestämma läget för en stationär sändare, eller en rörlig en (förutsatt bilder kan tas tillräckligt snabbt). FIONA kan appliceras sekventiellt på ramarna i filmen och på så sätt spåra rörelse enda molekyl 4 8. Foto-skyddande reagenser kan vara nödvändiga för att säkerställa att provet inte photodegrade. Vidare kan det fluorescerande objektet i sig vara av vilken storlek, mindre eller större än den diffraktion begrän- t.ex. kan det bestå av en organell (~ 1 mikrometer) med många fluorescerande proteiner utspridda på dess membran. Använda FIONA kan ändå ge en mycket exakt (nanometer) genomsnittet av dess genomsnittliga center-of-massa. Den stora förbättringen i lokaliseringsprecision från FIONA tillåter lösa nanometer skala rörelser över tid. Detta har drivit mikroskopi i den molekylära längdskala 4 8.
Sedan uppfinning, har varianter av FIONA utvecklats. Exempelvis ljusfält avbildning med en nanometer precision (bFIONA) 9, en liten variant av FIONA, bilder och lokaliserar täta föremål såsom melanosomer vivo (mörka föremål som innehåller pigmentet melanin) i med genomlysning. Dessutom har FIONA använts för att lösa flera färgämnen. Exempelvis enda molekyl högupplösande avbildning med fotoblekning (räka) 10,11 eller enda molekyl högupplösande colocalization (SHREC) 12 har utvecklats för att lösa två färgämnen inom omkring 10 nm. (Observera att detta är upplösningen, det vill säga hur exakt man kan säga samma färger från varandra.) På senare tid har FIONA analysen bidragit till lokaliseringsprocessen av vissa superupplösning mikroskopi såsom stokastisk optisk reconstruction mikroskopi (STORM) 13-15 och fotoaktiverade lokalisering mikroskopi (PALM) 16, där tillfälliga mörka fluoroforer är glada, och sedan fluorescensen är lokaliserad. Genom att upprepade gånger spännande en ganska låg täthet av färgämnen (mindre än en per diffraktionsbegränsad fläck) och därefter uppsamling av fluorescens, analysera var och en av dem genom FIONA kan en bygga upp en högupplöst karta. Upplösningen är sedan bara begränsad av antalet fotoner varje färgämne ger ut, samt saker som att hålla prov stationära (inklusive t.ex. mikroskop scenen) vid förvärvet.
I detta papper, en sammanfattning av den FIONA Teknik och kortfattat beskriva exempel på forskning som har utförts med hjälp av FIONA rapporteras. Först, hur man ställer in den nödvändiga utrustningen för FIONA experiment, det vill säga en total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM), med information om att rikta optiken, beskrivs. Sen hur mangenomföra en enkel FIONA experiment på lokalisera immobiliserade Cy3-DNA enstaka molekyler med hjälp av lämpliga protokoll, som är avbildad. Efter det, för att användningen av FIONA mäter 36 nm steget storleken på en enda stympad myosin Va motor märkt med en kvantprick presenteras. Myosin Va är en viktig processiv motorprotein som bär cellulära last samtidigt translokera längs aktinfilament. Här en myosin Va konstruera stympad används för att avlägsna domäner irrelevanta steget storlek och med en FLAG tagg läggs till i C-terminalen för att möjliggöra enkel märkning med kvantprickar funktion med Anti-FLAG-antikroppar. Detta experiment sker under lågt ATP att bromsa myosin och tillåta användandet av långa tillräckligt exponeringstider för att få en bra fotonräkning i varje ram. Alla tillräckligt ljusa fluorescerande märkning kan vara substituerade i följande protokoll. Slutligen är senaste insats för att utvidga tillämpningen av FIONA till tjocka prover rapporterades. Som ett proof-of-principle, var kvantprickar blöti sol-geler och kaninögonhornhinnor och sedan avbildas och lokaliseras med hjälp av FIONA. För avbildning, en 60X nedsänkning i vatten mål med NA = 1,2 användes eftersom detta mål har en längre arbetsavstånd än tidigare använda 100X oljeimmersionsobjektiv. För att kompensera förlusten i förstoring i målet, var en extra förstoringslins (3,3X eller 4,0X) insatt i vägen utsläpp. Dessutom epi-fluorescens (ej TIR) mikroskopi behöver användas för att få tillgång djupa regioner i de tjocka prover. Det visas att kvantprickar indränkt djupt i sol-geler och kaninögonhornhinnor (Z> 200 nm) kan lokaliseras med 2-3 nm precision.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: Hornhinnan vävnad från kaniner samlades i enlighet med University of Illinois Institutional Animal Care och användning riktlinjer.
1. TIRFM Setup
OBS: Använd laserskyddsglasögon hela tiden.
- Se till att alla nödvändiga optiska komponenter som anges i den förteckning över material finns tillgängliga och redo för anpassning. Vid behov använder substitut med likvärdiga funktioner från andra företag. Se till att speglar och linser ska ha antireflekterande (AR) beläggningar matchar lasern används.
- Ställ höjderna av alla optiska delar till höjden av mitten av mikroskop tillbaka porten.
- Montera laser, laser slutare och ND-filter (s). Använd ND-filter för att dämpa lasereffekten ned så lågt som möjligt och samtidigt hålla strålen synlig. Dra åt skruvarna med lämpliga insexnycklar.
- Planera en strålgång och märk den med tejp eller markör på den optiska bordet (dotted blå linjer i fig 1). För enkelhetens skull, håll räta stigar längs rader av hål på den optiska bordet.
- Placera spegeln M1 (figur 1) vid den första rätvinkliga sväng. Placera de två iris längs den andra raka delen av den planerade strålgången. Justera både positionen och lutningen på M1 så att lasern går genom iris.
- Placera spegeln M2 (figur 1) på den andra rätt vinkel tur. Placera 10X beam expander (L1 & L2, figur 1) längs den tredje raka delen av banan. Justera sin lutning så att strålen expandern är parallellt med både den optiska bordet och den planerade strålbanan.
- Justera M1 och M2 iterativt så att laser går straightly genom centrumen för båda linserna i strålexpanderaren. Upprepa detta tills strålen profilen för expanderade strålen är inte klipps Gaussisk.
- Justera M1 att centrera strålen på L1 (Figur 1) och M2 för att centrera strålen på L2 (figur 1) iterativt. En dålig strålprofil betyder oftast lasern klippt; Använd en bit vitt papper för att blockera strålen efter strålexpanderaren att kontrollera strålprofilen med ögonen. För hög precision analys, använd en optisk stråle profiler.
- Justera avståndet mellan L1 och L2 så att strålen kollimeras. Upprepa steg 1,8 och 1,9 vid behov.
OBS: När strålen storleken inte ändras med avståndet, är balken parallellt nog för en TIRFM setup. För att ytterligare förbättra balk kollimering kunde verktyg såsom en skär interferometer användas. En typisk strålstorlek efter expansion är ~ 20 mm. - Shutter lasern. Skruva mikroskopobjektivet och skruva i en fluorescerande inriktningsmålet. Placera speglar M3 och M4 (fig 1) för att rikta den expanderade strålen i mikroskop hamnen och på den dikroiska spegeln inuti torn. Se till att laserstrålen studsar than dikroisk och mot taket.
- Justera M3 att centrera den ljusaste delen av strålen på fluorescerande målet, och M4 att justera strålen lutning som vertikalt.
- Shutter lasern och skruva målet igen. Om inriktningen i föregående steg är gjort bra bör det finnas en symmetrisk plats lämnar målet. Finjustera de lutningar i M3 och M4 att optimera lasereffekten och balkprofilen ut ur målet.
- Montera en EMCCD kameran till mikroskop och ansluta kameran till en dator. Starta programvaran för kameran.
- Montera en fluorescerande prov (lösning av fluoroforer) på mikroskopet. Titta på den ljusa fluorescerande fläck på kameran. Kontrollera att platsen inte flyttas på skärmen som fokus ändras.
- Placera TIR-lins (L3, figur 1) på XYZ översättningsstadiet på ett avstånd från det bakre fokalplanet av det mål som är lika med brännvidd på L3 (~ 30 cm). Justera placeringen av L3så att laser går genom centrum av linsen.
- Översätt L3 längs strålens väg för att justera strålen kollimering. Kontrollera att strålen fortfarande är centrerad på skärmen och symmetriska i form.
OBS: belysningsområdet vid provplanet ökar med minskande TIR objektivets brännvidd. I allmänhet använder den minsta brännvidd som skulle kunna passa på set-up. - Översätt L3 vinkelrät mot strålgången att luta strålen ur målet. Håll översätta TIR linsen så att TIR uppnås. Observera ett urval av fluorescerande kulor genom EMCCD kameran och finjustera L3 att få bra SNR.
Figur 1 Optisk konfiguration för total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM).
2. FIONA på Cy3-DNA
- Clean objektglas och täckglas: Skölj objektglas och täckglas med DDH 2 O och isopropanol och torka dem med kvävgas; placera glasen och täckglas i plasma renare i 5 min under argon plasma.
- Konstruera provkammare (som skiss i figur 2).
- Placera en vävnad på bänken och sedan lägga en bit linspapper ovanpå vävnaden. Placera bilden på linspapper. Se till att den rena sidan av bilden är uppåt.
- Applicera två remsor av dubbelhäftande tejp på bilden längs långsidorna, lämna ett utrymme på 3-5 mm i centrum. Placera den rengjorda täckglas ovanpå diabilden. Se till att den rena sidan av täckglas är vänd mot objektglaset.
- Använd en pipett för att trycka ner över den dubbelsidiga tejpen. Använd en rakkniv för att avlägsna överskott av tejpen från sliden så att bandet förblir endast under täckglaset.
OBS: De öppna ändarna på kammaren lämnas öppen och tjänar som inlopp och utlåt. Den kammarvolymen är flera mikroliter.
Figur 2 Skiss av en typisk provkammare (a) Ovanifrån.; (B) från sidan från höger; (C) från sidan framifrån.
- Immobilisera Cy3-DNA på innerytor provkammare.
- Förbered T-50-buffert (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Förbered BSA-biotin i T-50 vid en slutkoncentration av 1 mg / ml. Förbered T50-BSA-buffert genom upplösning av BSA i T-50 vid en slutkoncentration av 10 mg / ml.
- Bered 0,5 mg / ml neutravidin i T50-BSA-buffert. Förbered biotinylerad Cy3 märkt DNA (Cy3-DNA) i T50-BSA vid en slutlig koncentration av 5-10 PM.
- Pipettera 10 pl BSA-biotin (1 mg / ml) i provkammaren. Vänta 5 minuter.
- Tvätta kammaren med 40 pl T50-BSA. Pipettera 20 | il Cy3-DNA in i provkammaren. Inkubera under 5 min och sedan tvätta kammaren med 80 | il T50-BSA.
- Bild Cy3-DNA enstaka molekyler under TIRFM.
- Förbered avbildning buffert (100 | il) genom blandning av en il Protocatechuate-3,4-dioxygenas (PCD, 5 ^ M), 4 | il Protocatechuic syra (PCA, 62,5 mM), 50 | j, l 6-hydroxi-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-karboxylsyra (Trolox, 2 mM i T-50), och 45 | il T50-BSA.
- Pipett i 30 pl bildbuffert och vänta 8-10 min.
- Montera provet för avbildning på en TIRFM som är utrustad med en grön laser (532 nm), en 100X oljeimmersionsobjektiv (1,45 NA), och en EMCCD kamera.
- Ställ in exponeringstiden till 100 till 500 msek och EM förstärkning till 25 till 100 Skaffa en film av provet för 1,000 frames.
- Utför FIONA dataanalys på de inspelade bilderna av Cy3-DNA.
- Bestäm den effektiva pixelstorleken (dvs omräkningsfaktor från pixlar till nanometer) genom att dividera den fysiska pixelstorleken (läsa från specifikationsblad för EMCCD kamera) med den totala förstoringen (förstoringen av mikroskopobjektivet multiplicerat med några extra förstoringar).
- Bestäm omräkningsfaktorn från pixelintensiteter foton nummer genom att dela CCD känslighet (dvs elektroner per A / D-räkna, läsa från specifikationsblad för CCD-kamera) från elektronmultiplikator (EM) vinst som används under bildtagning.
- Kompilera och köra FIONA.pro för FIONA analys. Använd detta IDL program för att importera den förvärvade bilden, att mata den effektiva pixelstorleken (från steg 2.5.1) och omräkningsfaktor från intensitet till fotonnummer (från steg 2.5.2), och att välja platser för FIONA analys.
OBS: I slutet, de program, skickas monterings resultat med 2D Gaussfunktioner samt total foton nummer och lokaliseringsprecision. Ett typiskt resultat visas i sektion av representativa resultat och figurerna 4c-4d. - Kompilera och köra phcount.pro att karakterisera fotonräkning. Använd detta IDL-program för att mäta det genomsnittliga antalet fotoner som sänds ut av en fluorofor innan fotoblekning, importera den förvärvade bilden och att mata omräkningsfaktorn från intensitet till fotonnummer (från steg 2.5.2).
OBS: Programmet kommer då att upptäcka fluorescerande fläckar automatiskt (manuellt val är ett alternativ), beräkna foton räknas som en funktion av ramnummer, och utgång spår av foton räknas.- Kasta dåliga spår och ange bildintervall efter fotoblekning för baslinje korrigering. I slutet, kommer programmet att mata ut en lista med de totala fotonnummer för alla fläckar som inte kasseras. Rita i fördelningen av fotonnumren och montera distributiontion med en exponentiellt avtagande för att få den genomsnittliga fotonnummer. Ett typiskt resultat visas i den del av representativa resultat och figurerna 4e-4F.
3 FIONA Tillämpad att kvantifiera Motor (t.ex. Myosin på aktin) Dynamik på nanometerskala
- Polymerisera aktin (dvs. förbereda F-aktin) en dag före FIONA experiment.
- Rekonstituera G-aktin (monomer) och biotin G-aktin (monomer) till 10 mg / ml med allmän aktin buffert. Rör om för att se till att båda är helt upplöst, och hålla både på is.
- Blanda 10 l G-aktin (monomer) med 1,7 l biotin G-aktin i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 pl iskall aktin polymerisation buffert.
- Låt blandningen över natten vid 4 ° C (F-aktin bildas) och sedan lägga DDH 2 O till en total volym på 1 ml.
- Lagra de aktinfilament (F-aktin) vid 4 ° C för senare användning i experimenten.
NOT: Filament kommer att upplösas och förkorta tiden, men kan användas i minst två veckor.
- Förbered provet för avbildning.
- Gör en provkammare (såsom beskrivs i protokoll 2,1 och 2,2). Pipettera i 20 | il biotinylerad BSA vid 1 mg / ml i DDH 2 O. Inkubera under 10 min. Skölj med 30 l DDH 2 O.
OBS: Detta blockerar glasytan och innehåller biotin för bindning av aktinfilament. Biotinylated poly-L-lysin - polyetylenglykol (PLL-PEG) kan fungera på samma sätt. - Pipett i 0,5 mg / ml neutravidin. Inkubera i 2 minuter och sedan tvätta kammaren med 30 pl M5 buffert.
- Pipettera i den förberedda F-aktin späds 25 gånger i allmänhet aktin buffert, till slutlig koncentration ~ 0,004 mg / ml. Vänta 10 minuter, skölj kammaren med 30 pl buffert.
- Späd myosin Va med FLAG tags 30-faldigt i M5-buffert (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) till en slutlig koncentration of 250 nM. Blanda 1 l myosin med 1 pl Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 ^ M, konjugerad från Anti-FLAG antikroppar och Qdot705 använder Qdot705 antikroppskonjugering Kit enligt bruksanvisningen från tillverkaren). Lägg i 8 l M5 att fylla till 10 pl. Pipettera upp och ned för att blanda väl. Inkubera under 10 min på is.
OBS: Detta ger en blandning av 1 motor till 4 kvantprickar, på ~ 25 nM myosin koncentration.
- Gör en provkammare (såsom beskrivs i protokoll 2,1 och 2,2). Pipettera i 20 | il biotinylerad BSA vid 1 mg / ml i DDH 2 O. Inkubera under 10 min. Skölj med 30 l DDH 2 O.
- Imaging av myosin går på aktin.
- Förbered bildbuffert (100 l) genom att blanda 84 l M5-BSA (M5 buffert med 1 mg / ml BSA), 1 pl ATP (50 ^ M i DDH 2 O), 2 pl DTT (500 mM i DDH 2 O), 1 il CK (500 U / ml), 5 pl CP (200 mM), 1 | il PCD, 4 pl PCA, en pl myosin-Qdot efter utspäddes en annan 10-faldigt till 2,5 nM myosin koncentration, och en pl BME.
- Pipett i 20 ^ bildbuffert till provet kammaren och inkubera i 8-10 min.
- Bild provet på TIRF mikroskop vid 30 ms exponering. Förvärva minst 1.000 ramar. Justera volymen för myosin-Qdot i steg 3.3.1 om nödvändigt.
- Utför dataanalys och hitta steg-storlek myosin promenader.
- Öppna videofilen i ImageJ 17 och beskära video runt en rörlig plats. Beskära ett tillräckligt stort område att platsen blir aldrig inom 20 pixlar i kanten, och se till att det inte finns några andra ställen i videon. Se till att den här platsen rör sig i en linjär bana.
- Spåra platsen i videon för att generera x och y-koordinater genom tiden, i pixlar, genom att tillämpa FIONA-analys (steg 2.5.3) till varje bildruta i videon.
- Konvertera bildpunkter till nanometer, som beskrivs i föregående avsnitt.
- Beräkna förskjutning från initialposition som en funktion av tiden.
- Kör t-test på förskjutningen för att få stegen myosin promenader.
OBS: Programmet avses t-test (step_t_test.zip) kodas i IDL och konbestår av 14 subrutiner i mappen.- Öppna alla subrutiner i IDL och sammanställa alla två gånger. Kör sedan mtltyanalysis_ttest.pro och välj en textfil som innehåller enbart avståndsdata i en enda kolumn. En utgång Excel-filen kommer att genereras, som innehåller rådata, passform och stegstorleken.
- Radera alla nollvärden från steg-size kolumnen. Rita fördelningen av steg storlekar med Origin eller MATLAB. Montera en Gauss till histogrammet.
OBS: Steg storlekar av nollvärden måste utgå eftersom ett steg på noll betyder att inget steg tas från den föregående ramen. Beslaget ger en topp runt 36 nm (som visas i Figur 5).
4. Tjock Provberedning för FIONA
- Förbered kvantprickar inkapslade i sol-gel.
- Blanda 4,5 ml TMOS, 1 ml DDH 2 O och 100 ^ HCI (120 mM). Sonikera blandningen på is under 30 min i ultraljudstvätten specified i List of Materials (frekvens = 40 kHz, = värmaren). Blanda lösningen var 10 min.
- Späd 1,5 pl Qdot605 i 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Blanda lösning med 1,5 ml TMOS från föregående steg.
- Häll blandningen i ett glas nedre skålen. Täta glas botten skålen med Parafilm och förvara vid 4 ° C i 1, 5 timmar.
- Lägg 2 ml 1% BME i PBS till provskål och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter innan avbildning.
- Förbered hornhinnan prov färgas med kvantprickar.
OBS: Kanin-ögon var gåvor från Dr Marina Marjanovic.- Separera hornhinnan från ögonen och skär den i 3 mm x 3 mm bitar.
- Späd 1 pl Qdot 605-streptavidin i 1 ml PBS. Inkubera hornhinnans vävnad med ett nM Qdots lösning vid 4 ° C under 1 tim. Tvätta vävnaden med PBS.
- Ta en ren glasskiva och en # 1,5 täckglas. Sätt 4 lager av dubbelhäftande tejp på glasskiva längs långsidan, ennd sätta ytterligare fyra lager av dubbelhäftande tejp parallellt med tidigare band och lämna en kanal om 1 cm mellan. Sätt vävnaden från föregående steg i mitten av kanalen, och täcka den med ett täckglas.
- Tryck försiktigt på sidorna av täckglaset för att få det att fästa på banden. Blöt kanal med 50 | il PBS innan avbildning.
- Bildkvantprickar i sol-gel och hornhinna.
- För FIONA avbildning i tjocka prover, använd en 60X vattenimmersionsobjektiv med arbetsavstånd på 0,27 mm, eller en 60X vattenimmersionsobjektiv med arbetsavstånd på 0,28 mm.
- Montera provet på mikroskopet. Justera TIRF linsen så att den når epi-fluorescensläge (dvs laserstrålen kommer ut ur målet med en vinkel mot täckglas). Sätt i en extra förstoringslins (3,3X eller 4,0X).
- Flytta fokalplan målet till en önskad z ställe (t.ex.> 200 nm). Rekord bilder av orörligakvantprickar i provet.
- Utför FIONA analysen som beskrivs i avsnitt 2.5 i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt mål-typ TIRFM inställning visas i fig 3. Först yta-immobiliserad Cy3-DNA-provet avbildas. En typisk bild visas i figur 4a. Bilden togs med exponeringstid 0,5 sek, med EM vinst = 50 och CCD känslighet = 12.13 för kameran. Poängen-spread-funktion (PSF) av ett enda Cy3-DNA-molekyl visas i figur 4b (från platsen som anges av pilen i figur 4a), där färgen baren visar omfattningen av pixelintensiteter. Den faktiska fotonräkningar kunde beräknas genom att multiplicera intensitetpixel med en omräkningsfaktor, α = CCD känslighet / EM förstärkning. Den här platsen innehåller cirka 14.000 fotoner (efter korrigering för bakgrunden).
PSF är sedan försedd med en två-dimensionell Gaussfunktion, f (x, y) = z 0 + A • exp (- (x-μ x) 2 / (2s x 2) - (y - & #181; y) 2 / (2s y 2)), såsom visas i figur 4c (med monterings residualer som visas i fig 4d). Precisionen i lokaliseringen beräknas sedan genom att 
, Där i = x eller y, s jag är standardavvikelsen för montering, N är totala antalet fotonen, en är pixelstorleken, och b är standardavvikelsen för bakgrunden. I detta specifika exempel, N = 14.528, a = 106,67 nm, s x = 115,5 nm, s = y 109,4 nm, b = 18,9, vilket resulterar i lokalisering precisioner av σ x = 1,3 nm och σ y = 1,2 nm. Lokaliseringen precisionen hos en fluorofor är approximativt proportionell mot 1 / √n, dvs ju fler fotoner är, är att mer exakt lokalisera. Men i verkliga tillämpningar av FIONA är varaktigheten av experimentell observation en annan fråga. Därför enbör i allmänhet inser avvägning mellan lokaliseringsprecision och observationstiden och planera framåt. I sådana situationer är det oftast bra att avgöra hur många fotoner totalt en fluorofor kan släppa ut innan fotoblekning. En typisk kurva av fotonräkning vs ram visas i figur 4e. En exponentiell montering ger att den genomsnittliga fotonnummer ~ 1,4 x 10 6 (Figur 4f).
Dataanalys process myosin stegstorleksmätning visas i figur 5. Först en videofil med bra signal-brus av ett enda myosin som det promenader längs en aktin filament fångas. Figur 5a visar tre ramar från en video tas på 100 ms exponering med 100X oljeimmersionsobjektiv. Den rörliga PSF sedan spåras via den beskurna videofilen med en anpassad kod skriven i IDL att extrahera avstånd kontra tidsinformation, som läggs genom en T-testför steg. Figur 5b visar med avståndet mot tiden (röd) och steg-finder-utgång (vit). Lokaliserings fel i varje ram skymmer trappan formen på spåret, så det är viktigt att uppnå en foton räkna i varje ram som motsvarar en lokalisering fel mindre än hälften av den teoretiska steglängd man vill se. Figur 5c visar steg från flera spår kombineras till en histogram som är Gauss-fördelad om den sanna myosin stegstorleken. En Gaussisk passform till histogram facken ger en steglängd mått på 35,8 ± 0,4 nm final.
Eftersom sol-gel och hornhinna prover är transparent, kan excitation lasrar tränger djupt in proverna utan att spridas alltför mycket. Dessutom är den automatiska fluorescens från provet minimeras. När märkt med låg koncentration av kvantprickar, är det möjligt att samla fluorescens från Qdots djup i provet med högt signal-brusförhållande. Denvattenanvändning mål ger oss arbetsavståndet på 270 eller 280 nm, vilket innebär att det är möjligt att fokusera så långt som 280 nm bort från täckglas. Detta gör att vi kan utföra FIONA analys på kvantprickar i tjocka prover. För kvantprickar i en prov sol-gel, lokalisering precision på 1-2 nm nära täckglas och 2-3 nm vid 280 nm djupt in i provet (figur 6a-6b) uppnås. För kvantprickar i ett biologiskt prov (del av en hornhinna från en kanin öga, figur 6e), lokalisering noggrannhet på 1-2 nm nära täckglas och 2-3 nm vid ~ 223 nm djupt in i provet (figur 6c-6d) uppnås. Det noteras att den lokaliseringsprecisionen förbättras genom användning av den extra förstoringen lins, utan vilken en lokaliseringsprecision av 6-7 nm erhölls. Detta överensstämmer med tidigare numeriska studier som visar att lokaliseringsprecision kan förbättras genom att ändra den effektiva pixelstorlek från ~ 200nm till ~ 50 nm, även om det totala antalet insamlade fotoner kan vara lägre på grund av ytterligare reflektioner / refraktioner 18.
Figur 3 Optisk konfiguration. Den optiska konfigurationen av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi a.) Är en bild när lasern är i TIRF skick och b) är strålen formen laser i taket när lasern är i epi-belysning.
Figur 4 Lokalisering av immobiliserad Cy3-DNA. A) CCD-bild (256 x 256 pixlar) av Cy3-DNA. B) CCD bild av en enda Cy3-DNA-molekyl, som anges av FöPLlåg pilen i en). c) Montering av punktspridningsfunktion enda Cy3-DNA-molekyl med en tvådimensionell Gaussfunktion. d) Monterings rester från c). e) Photon räknas vs ramnummer. f) Fördelning av antalet fotoner som sänds ut av Cy3-molekylen innan fotoblekning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Myosin walking observeras av FIONA. a) ramar från exempel datafil som motsvarar t = 0 sek, 30 sek, och 60 sek. Den myosin-Qdot konstruktionen rör sig längs en rak bana och har en bra fotonräkning (> 5000) i varje bildruta. B) Tillämpning av FIONA till varje ram Yields distans mot tiden spår som ritas i rött. Ett steg undersöknings algoritm baserad på T-test används för att sedan extrahera enskilda steg, och utgången överlagras i vitt. Steg storlekar är märkta i vitt i enheter om nanometer. C) Åtgärder från flera spår kombineras i ett histogram. De uppmätta stegstorlekar är Gauss-fördelat ca 35,8 ± 0,4 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 FIONA analys på kvantprickar djupt i tjocka prover. A) Fluorescerande bild av QD 605 i sol-gel vid Z = 280 nm med 90X förstoring. B) punktspridningsfunktion QD märkt på ett). σ x = 2.6 nm = σ y 2,3 nm. Varje enhet i X-och Y-axeln representerar 266,7 nm. C) Fluorescerande bild av QD 655 i kaninhornhinna vävnad vid Z = 223 nm med 360X förstoring. D) PSF för QD markerade i c). σ x = 2,2 nm, = σ y 3,6 nm. Varje enhet i X och Y-axeln representerar 44,4 nm. E) Bilder på hornhinnan vävnad monterad på ett täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIONA är en teknik för att lokalisera positionen för en fluorescerande sändare (organisk fluorofor eller kvant prick) med nanometerprecision och tidsmässig upplösning ner till 1 ms 4 8. När tillräckligt många fotoner samlas, gör denna teknik för att bestämma positionen för en fluorescerande emitter mycket mer exakt än diffraktionsgränsen (~ 200 nm) och därmed denna teknik öppnar ett sätt att observera vad som inte setts med konventionell / traditionell optisk mikroskopi 4 - 8. Sedan uppfinning, har FIONA framgångsrikt tillämpats på observation promenader i många molekylära motorer, såsom myosiner och kinesiner. På senare tid, det tillsammans med annat arbete 3,19, bidrog till lokaliseringsprocessen av vissa framväxande superupplösningstekniker såsom STORM och PALM 13- 16.
Det kritiska steget för att uppnå FIONA ligger i antalet insamlade fotoner, som påverkas av olika faktörer. Till exempel bör det TIRFM inställning används för FIONA experiment väl placeras så att en god PSF (dvs inte sträckt, icke-stigmatiserade, etc.) uppnås och en rimlig signal-brus-förhållandet erhålles. Dessutom bör ett mål med ett högt NA värde användas för att samla så många fotoner som möjligt.
För att samla fler fotoner och därmed öka lokaliseringsprecision, har olika syreeliminerare metoder och reagens undersökts för att undertrycka fotoblekning och blinkande 20-22. Två olika syrgasrenande metoder har använts i vårt labb. En är "gloxy" lösning (glukosoxidas och katalas) 20. Den andra är PCA / PCD beskrivs ovan 22. De tidigare arbetena omedelbart efter blandning, men pH-värdet hos lösningen förändras över tiden. Den senare håller lösningen kemiskt oförändrad men en inkubationstid av 8-10 min krävs.
Etts som visas här, är det också möjligt att förlänga FIONA för tjocka prover med användning av ett 60X nedsänkning i vatten mål med NA = 1.2. Detta mål har en längre arbetsavstånd (0,27 mm) än tidigare använda 100X oljeimmersionsobjektiv (0,17 mm). För att arbeta på tjocka prover, behöver epi-fluorescensmikroskopi som skall användas. Trots fördelen av låg bakgrund av TIRFM offras är nanometer lokalisering precision fortfarande uppnås när du använder ljusa kvantprickar. Denna utvidgning kommer att vara användbart i tjock vävnad bildbehandling och medicinska tillämpningar.
Tillämpningen av FIONA är begränsad i några aspekter. Först av allt, såsom lokaliseringen precision beror på det totala antalet insamlade fotoner, den temporala upplösningen av FIONA brukar äventyras. För det andra kan FIONA ensam endast appliceras på glest märkta prover. Med andra ord kommer FIONA misslyckas om flera fluoroforer är tillräckligt nära för sådana sina vävda lappar. Dessutom spridningen av emissionsljus begränsar aplämpning av FIONA i tjock-vävnads avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grants 068.625, NSF Grants 1.063.188 och Center i fysik levande celler 0822613. särskilt tack går till Dr Marina Marjanovic i Beckman Institute for Advanced vetenskap och teknik för gåvan av kaninögon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
- Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. Kinesin Walks Hand-Over-Hand. Science. 303 (5658), 676-678 (2004).
- Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
- Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
- Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. Why kinesin is so processive. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).
- Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
- Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
- Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
- Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).
- Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
