Summary
Fluorofori singoli possono essere localizzati con precisione nanometrica utilizzando FIONA. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato, e come condurre esperimenti Fiona è descritto.
Abstract
Fluorescenza per immagini con una precisione di un nanometro (FIONA) è una tecnica semplice ma utile per la localizzazione di singoli fluorofori con precisione nanometrica nel piano xy. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato ed esempi di ricerche che sono state eseguite utilizzando FIONA vengono brevemente descritti. In primo luogo, come impostare le attrezzature necessarie per gli esperimenti FIONA, vale a dire, per un totale interno microscopia a fluorescenza di riflessione (TIRFM), con dettagli sulle allineare le ottiche, è descritto. Poi come realizzare un esperimento semplice FIONA sulla localizzazione immobilizzato Cy3-DNA singole molecole utilizzando protocolli appropriati, seguita dall'uso di FIONA per misurare la dimensione del passo 36 nm di un singolo miosina troncato motore Va marcato con un punto quantico, è illustrato. Infine, è segnalato recente sforzo di estendere l'applicazione di FIONA a campioni di spessore. Si dimostra che, utilizzando un obiettivo immersione in acqua e punti quantici imbevuto nel profondo sol-gel e cornee degli occhi di coniglio (>200 micron), la localizzazione di precisione di 2-3 nm può essere raggiunto.
Introduction
Intorno al 1882, Ernst Abbe rilevato che la risoluzione di un microscopio a luce visibile è ~ λ / 2NA, o ~ 200 nm (dove λ è la lunghezza d'onda e NA è l'apertura numerica) 1,2. Pertanto, qualsiasi oggetto più piccolo di questa dimensione potrebbe apparire come una macchia di diffrazione limitata in un microscopio ottico. Tuttavia, è possibile determinare il centro della macchia, che è, la posizione dell'oggetto, con una precisione molto maggiore 3. Fluorescenza per immagini con una precisione di un nanometro (FIONA) è una tecnica semplice ma utile per la localizzazione di singoli fluorofori con precisione nanometrica nel piano xy 4. La precisione di localizzazione, σ μ (cioè, l'errore standard della media), dipende dal numero totale di fotoni raccolti, 
, Dove N è il conteggio di fotoni, s è la deviazione standard della macchia fluorescente, una èla dimensione in pixel del rivelatore di immagine, e b è la deviazione standard del fondo 3,4. Per un fluoroforo che emette ~ 10.000 fotoni, FIONA può raggiungere ~ 1 nm precisione 4.
FIONA può essere utilizzato per determinare con precisione la posizione di un emettitore stazionaria, o uno spostamento (supponendo immagini possono essere adottate abbastanza veloce). FIONA può essere applicato in modo sequenziale ai fotogrammi del film e quindi tiene il moto della singola molecola 4-8. Reagenti foto-protezione possono essere necessarie per garantire che il campione non fotodegradare. Inoltre, l'oggetto fluorescente stesso può essere di qualsiasi dimensione, più piccola o più grande della diffrazione LIMIT- ad esempio, essa può consistere di un organello (~ 1 micron), con molte proteine fluorescenti dispersi sulla sua membrana. Utilizzando FIONA può ancora produrre un molto accurata (nanometri) media del centro-di-massa media. Il grande miglioramento nella precisione della localizzazione di Fiona permette risolvendo nanomemovimenti di ter-scala nel corso del tempo. Questo ha spinto la microscopia in scala di lunghezza molecolare 4-8.
Fin dalla sua invenzione, sono state sviluppate varianti di FIONA. Ad esempio, l'imaging in campo chiaro con una precisione di un nanometro (bFIONA) 9, una leggera variante di FIONA, immagini e localizza gli oggetti densi come melanosomi vivo (oggetti scuri che contengono il pigmento melanina) con luce trasmessa. Inoltre, FIONA è stato impiegato per risolvere diversi coloranti. Ad esempio, singola molecola imaging ad alta risoluzione con photobleaching (gamberetti) 10,11 o ad alta risoluzione di una singola molecola co-localizzazione (SHREC) 12 sono stati sviluppati per risolvere due coloranti all'interno di circa 10 nm. (Si noti che questa è la risoluzione, vale a dire con precisione come si può dire coloranti identici a parte.) Più recentemente, l'analisi FIONA ha contribuito al processo di localizzazione di alcuni microscopia a super-risoluzione, come reco ottica stocasticamicroscopia nstruction (STORM) 13- 15 e la foto-attivato localizzazione microscopio (PALM) 16, in cui fluorofori scure temporanee sono entusiasti, e poi la fluorescenza è localizzata. Con ripetutamente eccitante piuttosto bassa densità di coloranti (meno di uno per diffrazione macchia limitata), e poi raccogliendo la fluorescenza, analizzando ciascuno di loro dalla FIONA, si può costruire una mappa ad alta risoluzione. La risoluzione è quindi solo limitata dal numero di fotoni ciascun colorante mette fuori, così come le cose come tenere fermo il campione (compresi, per esempio, la fase di microscopio) durante l'acquisizione.
In questo lavoro, una sintesi della tecnica FIONA e brevemente descrivono esempi di ricerche che sono state eseguite utilizzando FIONA viene segnalato. In primo luogo, come impostare le attrezzature necessarie per gli esperimenti FIONA, vale a dire, per un totale interno microscopia a fluorescenza di riflessione (TIRFM), con dettagli sulle allineare le ottiche, è descritto. Poi comeeffettuare un esperimento semplice FIONA sulla localizzazione immobilizzato Cy3-DNA singole molecole utilizzando opportuni protocolli, è illustrato. Dopo di che, l'uso di FIONA per misurare la dimensione del passo 36 nm di un singolo miosina troncato motore Va marcato con un punto quantico è presentato. Miosina Va è una proteina motore processivo essenziale che trasporta merci cellulare mentre translocating lungo i filamenti di actina. Ecco un miosina Va costruire troncato viene utilizzato per rimuovere i domini irrilevanti per la dimensione del passo, e con un tag FLAG aggiunto al C-terminale per consentire facilità di etichettatura con punti quantici funzionalizzati con anticorpi anti-FLAG. Questo esperimento viene fatto in condizioni di scarsa ATP per rallentare la miosina e consentire l'uso di tempi di esposizione abbastanza a lungo per ottenere un buon numero di fotoni in ogni fotogramma. Qualsiasi etichetta fluorescente sufficientemente luminosa potrebbe essere sostituito nel seguente protocollo. Infine, viene riportato recente sforzo di estendere l'applicazione di FIONA a campioni di spessore. Come principio proof-of-, punti quantici sono stati inzuppatiin sol-gel e cornee degli occhi coniglio e poi ripreso e localizzata utilizzando FIONA. Per l'imaging, un obiettivo ad immersione 60X acqua con NA = 1.2 è stato utilizzato perché questo obiettivo ha una distanza di lavoro più lungo utilizzato in precedenza 100X obiettivo immersione in olio. Per compensare la perdita di ingrandimento dell'obiettivo, una lente extra-ingrandimento (3.3X o 4.0X) è stato inserito nel percorso di emissione. Inoltre, epi-fluorescenza (non TIR) microscopia deve essere utilizzato per accedere regioni profonde nei campioni spessi. E 'dimostrato che i punti quantici imbevuti nel profondo sol-gel e in cornee degli occhi di coniglio (Z> 200 micron) possono essere localizzati con precisione di 2-3 nm.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Il tessuto corneale da conigli sono stati raccolti in conformità con la University of Illinois Istituzionale Animal Care e utilizzo linee guida.
Setup 1 TIRFM
NOTA: Indossare occhiali laser di sicurezza per tutto il tempo.
- Assicurarsi che tutti i componenti ottici necessari elencati nella lista dei materiali sono disponibili e pronti per l'allineamento. Se necessario, utilizzare sostituti con funzioni equivalenti di altre società. Assicurarsi che specchi e le lenti dovrebbero avere anti-riflettente (AR) rivestimenti corrispondenti al laser in uso.
- Impostare le altezze di tutti i componenti ottici per l'altezza del centro del microscopio posteriore porta.
- Montare il laser, laser otturatore e filtro ND (s). Utilizza i filtri ND per attenuare la potenza del laser verso il basso il più basso possibile, mantenendo il fascio visibile. Serrare le viti con appositi codici esadecimali.
- Pianificare un percorso ottico e segnare con del nastro o un pennarello sul tavolo ottico (dotted linee blu in figura 1). Per semplicità, mantenere percorsi rettilinei lungo linee di fori sulla tavola ottico.
- Luogo specchio M1 (figura 1) al primo angolo a destra. Posizionare i due iridi lungo il secondo tratto rettilineo del percorso del raggio programmato. Regolare la posizione e l'inclinazione di M1 tale che il laser passa attraverso le iridi.
- Luogo specchio M2 (figura 1) al secondo angolo a destra. Inserire l'espansore 10X fascio (L1 e L2, figura 1) lungo il terzo tratto rettilineo del percorso. Regolare la sua inclinazione tale che l'espansore del fascio è parallelo sia la tabella ottica e il percorso del raggio programmato.
- Regolare M1 e M2 iterativamente tale che il laser passa rettamente attraverso i centri delle due lenti dell'espansore fascio. Ripetere questa operazione fino a quando il profilo del fascio del fascio espanso è non-Clipped gaussiana.
- Regolare M1 per centrare il fascio su L1 (Figura 1) e M2 per centrare il fascio su L2 (Figura 1) iterativamente. Un profilo del fascio male di solito significa che il laser è ritagliato; utilizzare un foglio di carta bianca per bloccare il fascio dopo l'espansore del fascio per controllare il profilo del fascio con gli occhi. Per l'analisi di alta precisione, utilizzare un profiler fascio ottico.
- Regolare la distanza fra L1 e L2 tale che il fascio viene collimato. Ripetere il punto 1.8 e 1.9, se necessario.
NOTA: Quando la dimensione del fascio non cambia con la distanza, il fascio è abbastanza collimato per un setup TIRFM. Per migliorare ulteriormente la collimazione del fascio, potrebbero essere utilizzati strumenti come un interferometro di taglio. Una dimensione baglio tipico dopo l'espansione è ~ 20 mm. - Otturatore il laser. Svitare l'obiettivo microscopio e avvitare un obiettivo allineamento fluorescente. Luogo specchi M3 e M4 (Figura 1) per dirigere il fascio espanso nella porta microscopio e sullo specchio dicroico all'interno della torretta. Assicurarsi che il raggio laser rimbalza tegli dicroici e verso il soffitto.
- Regolare M3 per centrare la parte più luminosa del fascio sul bersaglio fluorescente, e M4 per regolare l'inclinazione del fascio deve essere verticale.
- Shutter il laser e avvitare l'obiettivo posteriore. Se l'allineamento nel passaggio precedente è fatto bene ci dovrebbe essere un punto simmetrico uscire l'obiettivo. Ottimizzare le inclinazioni di M3 e M4 per ottimizzare la potenza del laser e il profilo del fascio fuori dell'obiettivo.
- Montare una telecamera EMCCD al microscopio e collegare la fotocamera a un computer. Avviare il software per la fotocamera.
- Montare un campione fluorescente (soluzione di fluorofori) sul microscopio. Guarda il punto luminoso fluorescente sulla fotocamera. Verificare che il punto non si sposta sullo schermo, come la messa a fuoco viene modificato.
- Posizionare la lente TIR (L3, figura 1) sulla fase di traduzione XYZ ad una distanza dal piano focale posteriore dell'obiettivo che è uguale alla lunghezza focale di L3 (circa 30 cm). Regolare la posizione di L3tale che il laser passa attraverso il centro della lente.
- Tradurre L3 lungo il percorso del fascio per regolare la collimazione del fascio. Assicurarsi che il fascio è ancora incentrato sul monitor e simmetrica in forma.
NOTA: L'area di illuminazione in corrispondenza del piano di campionamento aumenta al diminuire della lente TIR lunghezza focale. In generale, utilizzare la lunghezza focale più piccolo che potrebbe andare bene sul set-up. - Traduci L3 perpendicolare al percorso del fascio per inclinare la trave dell'obiettivo. Mantenere traducendo la lente TIR TIR in modo che si ottiene. Osservare un campione di perline fluorescenti attraverso la macchina fotografica EMCCD, e perfezionare L3 per ottenere un buon SNR.
Figura 1 Configurazione ottica per la totale microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRFM).
2. FIONA on Cy3-DNA
- Cvetrini da microscopio magre e coprioggetti: Sciacquare i vetrini da microscopio e coprioggetto con DDH 2 O e isopropanolo e asciugare con azoto; Porre i vetrini e coprioggetti del pulitore plasma per 5 minuti sotto argon plasma.
- Costruire camere di campione (come rappresentato nella figura 2).
- Collocare un tessuto in panchina e poi mettere un pezzo di carta lente sulla parte superiore del tessuto. Porre il vetrino su carta lente. Assicurarsi che il lato pulito della diapositiva è verso l'alto.
- Applicare due strisce di nastro biadesivo sul vetrino lungo i bordi lunghi, lasciando uno spazio di 3-5 mm al centro. Posizionare il coprioggetto pulito sulla parte superiore della diapositiva. Assicurarsi che il lato pulito del vetrino si trova ad affrontare la diapositiva.
- Utilizzare un puntale per premere giù sopra il nastro biadesivo. Utilizzare un rasoio per rimuovere il nastro in eccesso dalla diapositiva in modo che il nastro rimanga solo sotto il coprioggetto.
NOTA: Le estremità aperta della camera sono lasciati aperti e servono come ingresso e in uscitalasciare. Il volume della camera è di diversi microlitri.
Figura 2 Schizzo di una tipica camera del campione (a) Vista superiore.; (B) Vista laterale da destra; (C) Vista laterale dalla parte anteriore.
- Immobilizzare Cy3-DNA sulle superfici interne delle camere di campione.
- Preparare T-50 tampone (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl). Preparare BSA-biotina in T-50 ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Preparare tampone T50-BSA sciogliendo BSA in T-50 ad una concentrazione finale di 10 mg / ml.
- Preparare 0,5 mg / ml in tampone neutravidina T50-BSA. Preparare biotinilato Cy3 marcato DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA ad una concentrazione finale di 5-10 pm.
- Pipettare 10 ml BSA-biotina (1 mg / ml) nel pozzetto di misurazione. Attendere 5 min.
- Lavare la camera con 40 microlitri T50-BSA. Pipettare 20 ml Cy3-DNA nella camera del campione. Incubare per 5 minuti e poi lavare la camera con 80 microlitri T50-BSA.
- Immagine Cy3-DNA molecole singole sotto TIRFM.
- Preparare il tampone di immagini (100 ml) mescolando 1 ml Protocatechuate-3,4-diossigenasi (PCD, 5 mM), 4 ml di acido protocatechuic (PCA, 62,5 mM), 50 microlitri 6-idrossi-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbossilico (Trolox, 2 mM in T-50), e 45 microlitri T50-BSA.
- Pipettare in un tampone di imaging 30 microlitri e attendere 8-10 min.
- Montare il campione per l'imaging su una TIRFM che è dotato di un laser verde (532 nm), un obiettivo 100X immersione in olio (1,45 NA), e una fotocamera EMCCD.
- Impostare il tempo di esposizione di 100 a 500 msec e EM guadagno da 25 a 100 Acquisire un filmato del campione di 1,000 fotogrammi.
- Eseguire l'analisi dei dati FIONA sulle immagini registrate di Cy3-DNA.
- Determinare la dimensione effettiva del pixel (cioè, fattore di conversione da pixel a nanometri) dividendo la dimensione in pixel fisica (letto dalla scheda tecnica della fotocamera EMCCD) per l'ingrandimento totale (l'ingrandimento dell'obiettivo microscopio moltiplicato per eventuali ingrandimenti supplementari).
- Determinare il fattore di conversione da intensità dei pixel a fotone numeri dividendo sensibilità del CCD (cioè elettroni per conteggio A / D, leggere il foglio delle specifiche della fotocamera CCD) per il moltiplicatore di elettroni (EM) guadagno utilizzato durante l'acquisizione dell'immagine.
- Compilare ed eseguire FIONA.pro per l'analisi FIONA. Utilizzare questo programma IDL per importare l'immagine acquisita, per inserire la dimensione in pixel effettivi (da punto 2.5.1) e il fattore di conversione da intensità al numero di fotoni (dal punto 2.5.2), e di scegliere i punti per l'analisi FIONA.
NOTA: Alla fine, il program volontà uscita i risultati raccordo con funzioni 2D gaussiana, così come il numero totale di fotoni e la precisione della localizzazione. Un risultato tipico è mostrato nella sezione dei risultati e cifre rappresentative 4c-4d. - Compilare ed eseguire phcount.pro per caratterizzare il conteggio di fotoni. Utilizzare questo programma IDL per misurare il numero medio di fotoni emessi da un fluoroforo prima photobleaching, per importare l'immagine acquisita e per immettere il fattore di conversione da intensità al numero di fotoni (dal punto 2.5.2).
NOTA: Il programma rileverà automaticamente macchie fluorescenti (selezione manuale è un'opzione), calcolare i conteggi di fotoni in funzione del numero di telaio, e l'uscita delle tracce di conteggi di fotoni.- Eliminare cattivi tracce e specificare un range di frame dopo photobleaching per la correzione della linea di base. Al termine, il programma sarà in uscita un elenco di numeri totali di fotoni per tutti i punti non scartato. Poi tracciare la distribuzione dei numeri di fotoni e montare la distribuzione con un decadimento esponenziale per ottenere il numero medio di fotoni. Un risultato tipico è mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi e figure 4e-4f.
3 FIONA applicata per quantificare Motor (ad esempio, miosina sulla actina) Dinamica presso nanometri Scala
- Polimerizzare actina (cioè preparare F-actina) un giorno prima dell'esperimento FIONA.
- Ricostituire G-actina (monomero) e biotina G-actina (monomero) a 10 mg / ml con tampone generale actina. Mescolare per assicurarsi che entrambi sono completamente sciolti, e tenere entrambi in ghiaccio.
- Mescolare 10 ml G-actina (monomero) con 1,7 ml biotina G-actina in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 100 ml di ghiaccio freddo buffer di polimerizzazione di actina.
- Lasciare riposare il composto per una notte a 4 ° C (F-actina formato) e poi aggiungere DDH 2 O per un volume totale di 1 ml.
- Memorizzare i filamenti di actina (F-actina) a 4 ° C per un uso successivo negli esperimenti.
NOTA: Filamenti si disintegrerà e ridurre nel tempo, ma può essere utilizzato per almeno due settimane.
- Preparazione del campione per l'imaging.
- Effettuare una camera del campione (come descritto nel protocollo 2.1 e 2.2). Pipettare in 20 microlitri biotinilati BSA a 1 mg / ml di DDH 2 O. Incubare per 10 min. Sciacquare con 30 ml DDH 2 O.
NOTA: Questo blocca la superficie di vetro e stabilisce biotina per il legame dei filamenti di actina. Biotinilato poli-L-lisina - polietilenglicole (PEG-PLL) potrebbe servire la stessa funzione. - Pipettare in 0,5 mg / ml neutravidina. Incubare per 2 minuti e poi lavare la camera con 30 microlitri di buffer M5.
- Pipettare nel preparato F-actina diluito 25 volte in tampone generale actina, a concentrazione finale ~ 0,004 mg / ml. Attendere 10 minuti, sciacquare la camera con 30 microlitri di buffer.
- Diluire miosina Va con tag FLAG 30 volte in tampone M5 (20 HEPES mM (pH 7,6), 2 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) ad una concentrazione finale of 250 nM. Mescolare 1 ml miosina con 1 ml anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 micron, coniugata da anticorpi anti-FLAG e Qdot705 utilizzando il Qdot705 anticorpo Coniugazione Kit secondo il manuale di istruzioni del produttore). Aggiungi a 8 microlitri M5 per riempire a 10 microlitri. Pipettare su e giù per mescolare bene. Incubare per 10 min in ghiaccio.
NOTA: Questo produce una miscela di 1 motore a 4 punti quantici, a ~ 25 nM concentrazione di miosina.
- Effettuare una camera del campione (come descritto nel protocollo 2.1 e 2.2). Pipettare in 20 microlitri biotinilati BSA a 1 mg / ml di DDH 2 O. Incubare per 10 min. Sciacquare con 30 ml DDH 2 O.
- Imaging della miosina camminare su actina.
- Preparare il tampone di immagini (100 ml) mescolando 84 ml M5-BSA (buffer M5 con 1 mg / ml BSA), 1 ml ATP (50 micron di DDH 2 O), 2 microlitri DTT (500 mm in DDH 2 O), 1 ml CK (500 U / ml), 5 microlitri CP (200 mm), 1 ml PCD, 4 microlitri PCA, 1 ml miosina-Qdot dopo l'altro diluito di 10 volte la concentrazione di 2,5 nM miosina, e 1 ml BME.
- Pipettare in un tampone di imaging 20 microlitri di campione da camera e incubare per 8-10 min.
- Immagine del campione su TMicroscopio IRF al 30 esposizione msec. Acquisire almeno 1.000 fotogrammi. Regolare il volume della miosina-Qdot al Punto 3.3.1, se necessario.
- Eseguire l'analisi dei dati e trovare il passo di integrazione della miosina camminare.
- Aprire il file video in ImageJ 17 e ritagliare il video intorno ad un punto in movimento. Ritagliare una superficie sufficiente che il punto non viene mai meno di 20 pixel dal bordo, e assicurarsi che non vi siano altri punti in video. Assicurarsi che questo luogo si sta muovendo in un percorso lineare.
- Traccia il punto attraverso il video per generare x e y coordinate nel tempo, in pixel, applicando FIONA analisi (punto 2.5.3) per ogni fotogramma del video.
- Convertire pixel di nanometri, come descritto nella sezione precedente.
- Calcolare spostamento dalla posizione iniziale in funzione del tempo.
- Eseguire t-test sullo spostamento per ottenere i passi di miosina piedi.
NOTA: Il programma di cui t-test (step_t_test.zip) è codificato in IDL e consiste di 14 subroutine nella cartella.- Aprire tutti i sottoprogrammi in IDL e compila tutto due volte. Quindi eseguire mtltyanalysis_ttest.pro e scegliere un file di testo contenente solo i dati a distanza in una singola colonna. Un file di Excel di output verrà generato, contenente i dati grezzi, la forma, e la dimensione del passo.
- Eliminare tutti zero i valori dalla colonna step-size. Tracciare la distribuzione delle dimensioni passo con origine o MATLAB. Montare una gaussiana per l'istogramma.
NOTA: incrementi dei valori zero devono essere cancellati a causa di un passo di zero significa che nessun passo è tratto dal fotogramma precedente. Il raccordo dà un picco di circa 36 nm (come mostrato in Figura 5).
4 Preparazione del campione spessa per FIONA
- Preparare punti quantici incapsulati in sol-gel.
- Mescolare 4,5 ml TMOS, 1 ml di DDH 2 O e 100 ml HCl (120 mm). Sonicare la miscela in ghiaccio per 30 minuti nel pulitore ad ultrasuoni specified nel l'elenco dei materiali (frequenza = 40 kHz, riscaldamento = off). Mescolare la soluzione ogni 10 min.
- Diluire 1,5 ml a 1,5 ml Qdot605 HEPES (pH 50 mm 7.2). Mescolare la soluzione con 1,5 ml TMOS dal passaggio precedente.
- Versare il composto in un piatto fondo di vetro. Sigillare il piatto fondo di vetro con Parafilm e conservare a 4 ° C per 1 5 ore.
- Aggiungere 2 ml di 1% in PBS BME al piatto campione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di imaging.
- Preparare campione cornea macchiato di punti quantici.
NOTA: Coniglio-occhi erano doni da Dr. Marina Marjanovic.- Separare la cornea dagli occhi e tagliarlo in 3 mm x 3 pezzi mm.
- Diluire 1 ml Qdot 605-streptavidina in 1 ml di PBS. Incubare il tessuto corneale con soluzione 1 nM Qdots a 4 ° C per 1 ora. Lavare il tessuto con PBS.
- Prendete un vetrino pulito e un # 1.5 coprioggetto. Mettere 4 strati di nastro biadesivo sul vetrino lungo il lato più lungo, unnd mettere altri 4 strati di nastro biadesivo parallelo al nastro precedente e lasciare un canale di circa 1 cm in mezzo. Mettere il tessuto dal passaggio precedente nel mezzo del canale, e coprire con un vetrino coprioggetto.
- Premere delicatamente sui lati del coprioggetto per farla aderire ai nastri. Bagnare il canale con 50 microlitri di PBS prima di imaging.
- Punti quantici Immagine in sol-gel e cornea.
- Per FIONA l'imaging in campioni spessi, utilizzare un obiettivo 60X acqua-immersion con distanza di lavoro di 0,27 mm o un obiettivo 60X acqua-immersion con distanza di lavoro di 0,28 mm.
- Montare il campione sul microscopio. Regolare la lente TIRF tale che esso raggiunga la modalità epi-fluorescenza (cioè il raggio laser esce l'obiettivo con un angolo contro il coprioggetto). Inserire una lente di ingrandimento in più (3.3X o 4.0X).
- Spostare il piano focale dell'obiettivo in una posizione z desiderata (ad esempio,> 200 micron). Registrare le immagini di immobilepunti quantici nel campione.
- Eseguire l'analisi FIONA come descritto nella sezione 2.5 del presente protocollo.
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Representative Results
Una tipica configurazione TIRFM obiettivo-tipo è mostrato in Figura 3. Prima, campione di Cy3-DNA-superficie immobilizzato è stato ripreso. Una immagine tipica è mostrato in Figura 4a. L'immagine è stata scattata con il tempo di esposizione 0,5 secondi, con EM guadagno = 50 e la sensibilità del CCD = 12.13 per la fotocamera. Il-spread-funzione del punto (PSF) di una singola molecola Cy3-DNA è mostrata nella Figura 4b (dal punto indicato dalla freccia nella figura 4a), in cui la barra di colore mostra la scala di intensità dei pixel. I conteggi dei fotoni reali potrebbero essere calcolate moltiplicando le intensità dei pixel per un fattore di conversione, la sensibilità α = CCD / guadagno EM. Questo luogo contiene circa 14.000 fotoni (dopo la correzione per lo sfondo).
La PSF è poi dotato di una funzione bidimensionale gaussiano, f (x, y) = z 0 + A · exp (- (x-μ x) 2 / (2s x 2) - (y - & #181; y) 2 / (2s y 2)), come mostrato nella Figura 4c (con residui di montaggio mostrate nella Figura 4d). La precisione di localizzazione viene poi calcolato 
, Dove i = x o y, s i è la deviazione standard del raccordo, N è il numero totale di fotoni, a è la dimensione dei pixel, e b è la deviazione standard del fondo. In questo esempio specifico, N = 14.528, a = 106.67 nm, s x = 115.5 nm, s y = 109,4 nm, b = 18,9, con conseguente precisioni di localizzazione di σ x = 1.3 nm e σ y = 1.2 nm. La precisione di localizzazione di un fluoroforo è approssimativamente proporzionale a 1 / √ N, cioè, più fotoni, la localizzazione più precisa. Tuttavia, nelle applicazioni reali di FIONA, durata dell'osservazione sperimentale è un'altra considerazione. Perciò sidovrebbe, in generale, realizzare il compromesso tra precisione di localizzazione e la durata di osservazione e pianificare in anticipo. In tali situazioni, di solito è utile per determinare il numero di fotoni in totale un fluoroforo è in grado di emettere prima photobleaching. Una traccia tipica di conteggio di fotoni vs telaio è mostrato in Figura 4e. Un raccordo esponenziale dà che il numero medio di fotoni ~ 1,4 x 10 6 (figura 4f).
Il processo di analisi dei dati di misurazione miosina step-size è mostrato in Figura 5. Innanzitutto, un file video con buon segnale-rumore di un singolo miosina quando cammina lungo un filamento di actina viene catturato. Figura 5a mostra tre fotogrammi da un video prese a 100 msec esposizione con obiettivo 100X ad immersione in olio. Il PSF movimento viene poi monitorato attraverso il file video ritagliata utilizzando un codice personalizzato scritto in IDL per estrarre informazioni sulla distanza in funzione del tempo, che viene sottoposto a un T-testper passi. Figura 5b spettacoli con la distanza rispetto al tempo (rosso) e step-finder uscita (bianco). Errori di localizzazione di ciascun frame oscura la forma scala della traccia, quindi è fondamentale per ottenere un conteggio di fotoni in ogni fotogramma corrispondente ad un errore di localizzazione meno della metà della dimensione teorica passo si vuole vedere. Figura 5c mostra passi da vari tracce combinati in un unico istogramma che è Gaussiana-distribuito circa la vera dimensione del passo miosina. Una misura gaussiana per i bidoni istogramma produce una misurazione finale passo di 35,8 ± 0,4 nm.
Poiché i campioni sol-gel e cornea sono trasparenti, i laser di eccitazione possono penetrare in profondità nei campioni senza essere dispersa troppo. Inoltre, l'auto-fluorescenza dal campione viene ridotta al minimo. Se etichettato con bassa concentrazione di punti quantici, è possibile raccogliere la fluorescenza da Qdots profondo nel campione con elevato rapporto segnale-rumore. Iluso di obiettiva acqua ci dà la distanza di lavoro di 270 o 280 micron, il che significa che è possibile focalizzare quanto 280 micron dalla coprioggetto. Questo ci permette di effettuare analisi FIONA su punti quantici in campioni di spessore. Per i punti quantici in un campione sol-gel, la localizzazione di precisione di 1-2 nm, vicino al coprioggetto e 2-3 nm a 280 micron in profondità nel campione (Figure 6a-6b) è raggiunto. Per i punti quantici in un campione biologico (parte di una cornea di un occhio di coniglio, Figura 6e), precisione nella localizzazione di 1-2 nm, vicino al coprioggetto e 2-3 nm a ~ 223 micron in profondità nel campione (Figure 6c-6d) è raggiunto. Si osserva che la precisione di localizzazione è migliorata utilizzando la lente di ingrandimento supplementare, senza la quale è stata ottenuta una precisione di localizzazione di 6-7 nm. Ciò è coerente con precedenti studi numerici mostrano che la precisione di localizzazione può essere migliorata modificando la dimensione effettiva del pixel da ~ 200nm a ~ 50 nm, anche se il numero totale di fotoni raccolti potrebbe essere inferiore a causa di riflessioni / rifrazioni 18 supplementari.
Figura 3 Configurazione ottica. La configurazione ottica di fluorescenza di riflessione interna (TIRF) microscopia totale a.) È una foto quando il laser è in condizioni TIRF e b) è la forma del fascio laser sul soffitto quando il laser è in epi-illuminazione.
Figura 4 Localizzazione di immobilizzato Cy3-DNA. Immagine CCD a) (256 x 256 pixel) di Cy3-DNA. B) immagine CCD di una singola molecola Cy3-DNA, indicati dal yelbasso freccia in a). c) Montaggio della funzione di punto di diffusione della singola molecola Cy3-DNA con una funzione gaussiana bidimensionale. d) Montaggio residui da c). e) Photon contare vs numero di telaio. f) Distribuzione del numero di fotoni emessi da Cy3 molecola prima photobleaching. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 miosina camminare osservato da FIONA. a) frame da file di esempio di dati corrispondente at = 0 sec, 30 sec, e 60 sec. Il costrutto miosina-Qdot si sta muovendo in lungo un percorso rettilineo e ha un buon numero di fotoni (> 5.000) in ogni fotogramma. B) Applicazione di FIONA ad ogni fotogramma YieLDS una traccia distanza rispetto al tempo che viene tracciata in rosso. Un algoritmo passo-ricerca basato sul T-test è utilizzato per estrarre singole fasi, e l'uscita è sovrapposto in bianco. Passo dimensioni sono etichettati in bianco in unità di nanometri. C) Passi da più tracce vengono combinati in un istogramma. Le dimensioni della fase misurati sono gaussiana distribuiti circa 35,8 ± 0,4 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6 Analisi FIONA su punti quantici profonde in campioni di spessore. A) immagine fluorescente di QD 605 in sol-gel a Z = 280 micron con 90X di ingrandimento. B) La funzione di punto di diffusione della QD marcato in a). σ x = 2.6 nm, σ y = 2.3 nm. Ogni unità in assi X e Y rappresenta 266,7 nm. C) immagine fluorescente di QD 655 in tessuto corneale di coniglio a Z = 223 micron con ingrandimento 360X. D) La PSF del QD marcato in c). σ x = 2.2 nm, σ y = 3.6 nm. Ogni unità nell'asse X e Y rappresenta il 44,4 nm. E) Immagini del tessuto corneale montato su un vetrino coprioggetto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fiona è una tecnica per localizzare la posizione di un emettitore fluorescente (fluoroforo organico o quantum dot) con una precisione nanometrica e risoluzione temporale fino a 1 msec a 4 8. Quando abbastanza fotoni vengono raccolti, questa tecnica consente di determinare la posizione di un emettitore fluorescente molto più preciso rispetto al limite di diffrazione (~ 200 nm) e quindi questa tecnica apre un modo per osservare ciò non è stato visto con microscopia ottica convenzionale / tradizionale 4 - 8. Fin dalla sua invenzione, FIONA è stato applicato con successo ad osservare a piedi da molti motori molecolari, come le miosine e kinesins. Più di recente, è, insieme ad altri lavori 3,19, ha contribuito al processo di localizzazione di alcune tecniche emergenti super-risoluzione, come STORM e PALM 13- 16.
La fase critica per ottenere FIONA risiede nel numero di fotoni raccolti, che è influenzata da vari fattori. Ad esempio, la configurazione TIRFM utilizzato per esperimenti FIONA deve essere ben allineato in modo tale che una buona PSF (cioè non-allungato, non-stigmatizzati, ecc) è raggiunto e un ragionevole segnale-rumore rapporto si ottiene. Inoltre, un obiettivo con un alto valore NA dovrebbe essere utilizzato per raccogliere il maggior numero possibile di fotoni.
Per raccogliere più fotoni e quindi di aumentare la precisione di localizzazione, diversi metodi di scavenger di ossigeno e reagenti sono stati esplorati per sopprimere photobleaching e lampeggiante 20- 22. Due diversi metodi di ossigeno scavenging sono stati utilizzati nel nostro laboratorio. Uno è "gloxy" soluzione (glucosio ossidasi e catalasi) 20. L'altro è PCA / PCD sopra descritta 22. I precedenti lavori immediatamente dopo la miscelazione, ma il pH della soluzione cambia nel tempo. Quest'ultimo mantiene la soluzione chimicamente invariati, ma è richiesto un tempo di incubazione di 8 a 10 min.
Las qui illustrato, è anche possibile estendere FIONA per i campioni spessi utilizzando un obiettivo ad immersione acqua 60X con NA = 1.2. Questo obiettivo ha una distanza di lavoro più lunga (0,27 millimetri) di quanto precedentemente utilizzato 100X obiettivo immersione in olio (0,17 mm). Per lavorare su campioni di spessore, microscopia a fluorescenza deve essere utilizzato. Anche se il vantaggio del basso fondo di TIRFM è sacrificato, precisione di localizzazione nanometro è ancora raggiungibile durante l'utilizzo di punti quantici luminosi. Questa estensione sarà utile nell'imaging tessuto spesso e applicazioni mediche.
L'applicazione di FIONA è limitato in alcuni aspetti. Prima di tutto, come la localizzazione precisione dipende dal numero totale di fotoni raccolti, la risoluzione temporale di FIONA è solitamente compromessa. In secondo luogo, solo FIONA può essere applicato solo a campioni scarsamente etichettati. In altre parole, FIONA fallirà se più fluorofori sono abbastanza vicini come loro PSF si sovrappongono. Inoltre, la dispersione della luce di emissione limita l'applicatura di FIONA in spessore-tessuti-imaging.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH Grants 068.625, sovvenzioni NSF 1.063.188 e Centro di Fisica di cellule viventi 0822613. Un ringraziamento particolare va al Dr. Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology per il dono di occhi di coniglio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
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