Introduction
Isolering af RNA med høj integritet er nødvendig for rutinemæssige molekylærbiologiske eksperimenter såsom Northern blotting 9, qRT-PCR 1 eller genekspression profilering 5.. De fleste moderne fremgangsmåder til RNA-isolering er baseret på modifikationer af guanidinthiocyanat protokoller 2, 3. Guanidinthiocyanat er en stærk proteindenatureringsmiddel og effektivt vil forstyrre aktiviteten af ribonuclease under de fleste forhold. Den populære Chomczynski og Sacchi 3 kombineret phenol til guanidinthiocyanat lyseopløsning reducere isolation tid til omkring 4 timer. Mange kommercielt tilgængelige RNA-ekstraktionsmetoder reagenser baseret på Chomczynski og Sacchi metode 3.
Ribonuklease rige væv, såsom human eller mus bugspytkirtlen er en yderligere udfordring for at isolere RNA. Mus bugspytkirtlen kan indeholde op til 75 mg ribonuclease 6 hvoraf nogle vil blive frigivet During afbrydelse af pancreasvæv resulterer i væv autolyse. Modifikationer af guanidinthiocyanat protokoller er blevet anvendt til at isolere RNA fra bugspytkirtel med høj integritet 2, 4, 7, 10. Infusion af RNA-stabilisering reagens i muse pancreas lettere isolering af RNA med høj integritet 4, 7, 10, men infusion af løsninger i bugspytkirtlen kræver stor dygtighed, kan kræve specialiserede instrumenter såsom et dissektionsmikroskop og forstyrrer vævsarkitekturen under proceduren, kan resultere i cellelysis. Perfusion væv med RNA stabilisering reagens kan forstyrre andre programmer, herunder protein isolation og histologisk farvning. Endvidere er denne teknik ikke egnet til isolering af RNA fra human pancreas. Andre protokoller kræver udarbejdelse af konkrete løsninger af investigator 2.
Vi rapporterer en protokol til at isolere RNA med høj integritet fra mus bugspytkirtlen. The protokollen bruger elementer af tidligere publicerede metoder og er i vid udstrækning baseret på standarden phenol / guanidinthiocyanat-baserede lysis reagens protokoller. Det kræver ikke udarbejdelse af specialiserede løsninger kræver heller ikke infusion af reagenser i bugspytkirtlen. Kritiske trin til vellykket RNA isolation omfatter en høj phenol / guanidin-baserede lysis reagens væv forholdet, fjernelse af ufordøjet væv forud for fase separation og optagelse af et ribonucleaseinhibitor til den resulterende RNA-løsning. Ved hjælp af disse og andre modifikationer, vi typisk isolere RNA med RIN større end 7, der skal anvendes til rutinemæssig genekspressionsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse
De følgende fremgangsmåder overholde de politikker, der er fastsat af institutionens Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
- Det anbefales at isolere mere end 6 mus pancreases på en given dag. Har alle kirurgiske instrumenter rene og autoklaveres, et sæt per dyr.
- Mærke alle mikrocentrifugerør. Fire 2 ml rør per dyr.
- Placer 8 ml lysis reagens i 50 ml centrifugerør på is. Bemærk: Mens rensning kit leveres med en guanidinthiocyanat phenolreagens der er egnet til bugspytkirtel isolation, der lysis reagens, der anvendes på grund af de store mængder, der er nødvendige pr isolation.
- Hældes omkring 10 ml af følgende løsninger i 15 ml centrifugerør til rengøring homogenisatoren s vinger. Ethanol, 70% (2 rør), HPLC-kvalitet vand (1 tube) og HPLC-kvalitet vand, der indeholder cirka 200 pi RNase Away eller tilsvarende ribonuclease inaktivator. 2.. Surgery, Pancreas Dissektion og Homogenisering
- Placer 1-2 ml isofluran i en krukke, der indeholder bomuld gaze eller køkkenrulle. Mus er placeret på en platform, der forhindrer dem i at nå kilden til isofluran. Føj frisk isofluran til krukken før bedøve hver mus.
- Anbring forsigtigt musen ned i glasset, der indeholder isofluran. Sæt låg på krukken og overvåge virkningerne af anæstesi ved forsigtigt at dreje krukke frem og tilbage. Dyret bedøves, når den er i stand til at stå på sin egen.
- Til bekræftelse af anæstesi, skal du fjerne dyret fra krukken og anvende en fast tå knivspids. Hvis musen ikke reagerer på tå knibe, gå videre til trin 2.5.
- Hvis musen reagerer på tå knibe, gentag derefter trin 2,2-2,3.
- Placer bedøvede dyr på bænken øverst i bugleje. Forskubbe musens livmoderhalsen ved stramt at placere venstre hånd på musen livmoderhalsen. Osning højre hånd fat musens hale og hurtigt trække opad på cirka en vinkel på 45 ° forskubbe livmoderhalsen.
- Fastgør slagtekroppen til en overflade (et niveau stykke styrofoam dækket med papirhåndklæder) ved at stikke hver af dyrets fire poter i den flade overflade ved anvendelse af 25 gauge kanyler.
- Brug sterile kirurgiske instrumenter, skæres midtersektionen af musen åben og hurtigt at fjerne bugspytkirtlen fra mus. Brug pincet til at holde bugspytkirtlen og klippe det fra milten og tyndtarmen ved hjælp af foråret saks. Vær forsigtig med ikke at strække bugspytkirtlen under fjernelsen fra musen. Forstyrrelse af vævet kunne frigøre ribonuclease. Bemærk: Den tid det tager at fjerne bugspytkirtlen fra mus er kritisk. En fagmand bør være i stand til at dissekere bugspytkirtlen i omkring 1 min eller mindre.
- Anbring hele bugspytkirtlen i et 50 ml rør med 8 ml iskold lysis reagens. Sæt låg på røret og kortvarigt ryste at fordybe TIssue i reagenset og gå videre til næste trin uden forsinkelse. Forholdet mellem lysis reagens væv er kritisk. Se afsnittet Resultater til sammenligning af RNA-integritet isoleret under anvendelse af forskellige mængder af lysis reagens.
- Homogeniseres i 5 sek. Det er vigtigt at trykke homogenisatoren vinger til bunden af centrifugerøret for at tillade væv at blive trukket ind i vingerne til effektiv homogenisering.
- Overfør 2 ml lysis reagens indeholder de lyserede bugspytkirtlen til et 2 ml mikrocentrifugerør. Saml to mikrocentrifugerør homogenat pr isolation. Kassér den resterende homogenatet eller opbevares ved -80 ° C for fremtidige undersøgelser.
- Centrifuge ved 4 ° C, 12.000 × gi 5 min til pelletering af ufordøjet væv. Dette er et afgørende skridt, da fremførsel af ufordøjet væv ind efterfølgende opløsninger af RNA vil sandsynligvis forurene prøven med ribonuclease (trin 5.13).
- Overfør 1 ml af supernatanten i et 2 ml mikrocentrifugerør. Fortsæt med isolation samme og gemme den replikat rør ved -80 ° C til senere brug. Læg alle rør indeholdende homogenisat på våd is, mens du går videre til næste trin.
- Bortskaf de resterende lysis reagens i en passende kemisk affaldsbeholder.
- Inden vi går videre til den næste isolation, rengøre homogenisatoren knive ved at placere dem i 10 ml 70% ethanol. Aktiver homogenisatoren for omkring for 20 sekunder for at fjerne eventuelle klumper af væv, der kan blive fanget af knivene.
- Brug en 200 ul pipettespids til at fjerne nogen stykker, der forbliver i homogenisatoren vinger. Gentag trin 4.1 i vand, general Rnase inaktivator og 70% ethanol. Tør homogenisatoren skaft med en ren Kim tørre.
- Gentag trin 2.1 for bugspytkirtlen isolation af de resterende dyr, holder RNA isoleret fra hvert dyr særskilt snarere end at samle RNA.
- Hvis du bruger frosne homogenisat løsning, optø på våd is og lad stå ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Tilføj 200 pi chloroform, cap røret og rystes kraftigt med hånden for 15 sek. Lad røret stå ved stuetemperatur i 2-3 min.
- Centrifuger i 15 minutter ved 12.000 x g, 4 ° C.
- Overfør det øverste vandige lag i et mikrocentrifugerør. Tilføj 1,5 volumen isopropanol og blandes grundigt ved pipettering op og ned flere gange.
- Overfør op til 700 pi af prøven i en centrifugesøjle, som er placeret i et 2 ml opsamlingsrør. Luk låget og centrifugeres ved 8000 xg i 15 sekunder ved stuetemperatur.
- Kassér gennemstrømning.
- Gentag trin 5,5-5,6, ved hjælp af resten af prøven.
- Tilføj 700 pi buffer RWT til spinsøjle. Centrifugér i 15 sekunder ved 8000 x g. Kassér gennemstrømning.
- Pipetter 500 pi Buffer RPE i spinsøjle. Centrifuger i 15 sekunder ved 8000 xg for at vaske søjlen. Kassér gennemstrømning.
- Tilsæt 500 pi Buffer RPE til spinsøjle. Centrifuger i 2 minutter ved 8000 xg for at tørre kolonnen.
- Overfør spinkolonne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pipet 80 pi ribonuklease-frit vand direkte på spinsøjle membran. Centrifugeres i 1 min ved 8000 xg for at eluere RNA'et.
- Tilsæt 1 pi RNase inhibitor til RNA-opløsning. Opbevar ved -80 ° C eller videre til 5.13.
- For at validere integriteten af RNA, først beregne RNA koncentration og 260/280 forholdet ved hjælp af et spektrofotometer.
- Fortynd en del af RNA-opløsning til ca 500 ng / pi med molekylærbiologisk kvalitet vand.
- Bestem RNA Integrity (dvs. RIN) under anvendelse af kapillarelektroforese analyse. Ca. 5 pi af RNA opløsning er tilstrækkelig til analysen.
- Afmål RNA opløsning (se figur 2) og opbevares ved -80 ° C.
3.. Fjernelse af ufordøjet Tissue
Bemærk: Efter homogenisering vil små stykker væv forbliver i lysis reagens. Det er mere vigtigt hurtigt lysere vævet forlader nogle væv ufordøjet snarere end over homogenisering og risiko nedbrydning af RNA.
4.. Rensning af homogenisatoren Blades
5.. RNA Isolation
Det følgende afsnit er identisk med den oprensningskit protokollen. Fordelen ved oprensning kit er, at det vil isolere total RNA herunder små RNA'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den totale RNA udbytte fra 1 ml lysis homogenat 20-40 ug. OD 260/280 ratio er typisk omkring 2,0 og RIN er konsekvent større end 7,0. Hvis RIN er ≤ 6 vil isoleringen skal gentages. Lejlighedsvis er et RIN der er højere end 8,0 opnået.
De to mest anvendte metoder til euthanizing mus før fjernelse af bugspytkirtlen er CO 2 kvælning eller indånding af isofluran. Begge teknikker følges ved cervikal dislokation. Da det er muligt, at det kemiske stof og / eller procedure tid kan have indflydelse på RNA integritet, RIN af muse pancreas RNA isoleres ved hjælp af begge teknikker blev sammenlignet. Musene blev bedøvet ved hjælp af CO 2-kvælning eller isofluran inhalering; begge teknikker blev fulgt ved cervikal dislokation. Tidspunktet for at bedøve dyrene forud for cervikal dislokation var ca 1 til 2 minutter længere for CO 2 kvælning i forhold til isoflurane. RNA isoleret efter inhalation af isofluran produceret en RIN på 7,5 ± 0,31 sammenlignet med en RIN på 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, middelværdi ± standardafvigelse, tredobbelte isolationer) for CO 2 kvælning. Metoden til eutanasi har en dramatisk effekt på RNA integritet og teknikken af isofluran inhalation foretrækkes til CO 2 kvælning.
Integriteten af RNA isoleret fra mus bugspytkirtler, der blev homogeniseret i 2, 4 og 8 ml lysis reagens blev sammenlignet. Vi antager, at øge mængden af lysis reagens vil føre til en større grad af ribonuclease inaktivering. Andre end mængden af lysis reagens alle forhold var identiske med dem, der er anført i protokollen. Der var en direkte sammenhæng mellem omfanget af lysis reagens, der anvendes homogenisering og RNA-integritet (figur 1). The RIN af RNA isoleret ved anvendelse af 2, 4 og 8 ml lysis reagens var 4,2, 6,5 og 7,4, henholdsvis (middelværdi, triplo erkelser ophører). Derfor bør der anvendes 8 ml lysis reagens i denne protokol.
For nogle forsøg kan det være nødvendigt at indsamle både RNA og protein fra samme bugspytkirtlen. For eksempel kan RNA anvendes til QRT-PCR og protein kan visualiseres ved hjælp af immunhistokemi. Hvis dette er tilfældet, anbefales det at skære bugspytkirtlen i halvdelen fra hoved til hale. Dette er vigtigt, da bugspytkirtlen adskiller anatomisk fra hoved til hale. For at demonstrere, om eventuelle forskelle i RNA integritet eksisterer mellem RNA isoleret fra enten halvdelen af bugspytkirtlen, blev følgende eksperiment udført. RNA blev isoleret fra den første halvdel af bugspytkirtlen. RIN bestemmes ud fra dette RNA blev sammenlignet med RNA isoleret fra den anden halvdel af bugspytkirtlen efter det sad ved RT i omkring 30 sekunder under oparbejdningen af den oprindelige halvdel. The RIN for den første halvdel af bugspytkirtlen var 7,4 ± 0,20 sammenlignet med en RIN på 6,9 ± 0,55 for den efterfølgende halvdel. Mens der skæres bugspytkirtlen idenne måde ikke synes at frigive ribonuklease og fordøjelse af RNA, hvis bugspytkirtlen, der skal skæres, anbefales det at bruge den første halvdel for RNA-analyse og den anden halvdel for protein.
Lysis reagens forstyrrer proteiners struktur, og derfor reducerer ribonukleaseaktivitet. På grund af den store mængde af ribonuklease, der er til stede i bugspytkirtlen, er det muligt, at nogle aktive ribonuklease forbliver i lysis homogenatet og dette ribonuklease vil ækvilibrere til den vandige fase. Enhver ribonuklease, der forbliver i den sidste RNA løsning vil hindre integritet. For at overvinde dette har vi tilføjet en ribonucleaseinhibitor til den vandige opløsning af RNA. RNA integritet blev sammenlignet ud fra et RNA-opløsning, som indeholdt ribonucleaseinhibitor til en, der ikke gjorde. Efter en fryse tø RIN til løsning af RNA med inhibitor var 7,3 ± 0,15 i forhold til 2,9 ± 0,65 (fig. 2, p <0,001, middelværdi ± SD, tredobbelte isolationer) tilløsning, der ikke indeholder inhibitor. Et andet problem er den mulighed, at gentagne fryse optøning vil denaturere ribonucleaseinhibitor gør det ineffektivt. For at undersøge denne mulighed blev en opløsning af RNA indeholdende ribonucleaseinhibitor nedfryses og optøs. RNA-løsninger, der er blevet nedfrosset og optøet op til 5 gange stadig produceret en RIN på 7 eller højere, mens de løsninger, der blev frosset og optøet 6 gange eller højere produceret en RIN under 7 (figur 2). Det anbefales at udportionerer RNA opløsningen forud for frysning og begrænse antallet af fryse-tø cykler.
For at demonstrere anvendeligheden af denne metode, vi udførte qRT-PCR på den isolerede RNA. Den gennemsnitlige RIN fra tredobbelte RNA isolationer var 7,4 ± 0,20 (gennemsnit ± SD). Tilfældigt primet cDNA blev syntetiseret fra RNA og ekspressionen af tre housekeeping-gener blev målt ved qPCR anvendelse af standardteknikker. Vist i figur 3 validerer datavores evne til at bruge musen til pancreas RNA i en standard molekylær biologi teknik.
Fig. 1. Høj lysis reagens væv forhold forbedrer RNA integritet. Integriteten af RNA isoleret fra mus bugspytkirtler, der blev homogeniseret i 2 (A, D), 4 (B, E) eller 8 (C, F) ml lysis reagens var sammenlignet. Andet end omfanget af lysis reagens alle betingelser var identiske med dem beskrevet i protokollen heri. En direkte korrelation mellem mængden af lysis reagens, der anvendes homogenisering og RNA integritet. (G) Mean ± SD, tredobbelte isoleringer. p <0,05, ** p <0,001. Klik her for at se en større versionaf dette tal.
Figur 2. RNA sidst nedbrydes ved gentagne fryse optøning. RNA isoleret fra muse pancreas blev gentagne gange frosset og optøet i nærvær eller fravær af ribonucleaseinhibitor (RNase I). Middelværdi ± SEM, ** p <0,001.
Figur 3. QRT-PCR af muse pancreas RNA. RNA blev isoleret fra tre mus bugspytkirtler hjælp af optimerede protokol. Ekspressionen af 18S rRNA, β-2-mikroglobulin og snoRNA251 blev bestemt under anvendelse QRT-PCR (gennemsnit ± SD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolerende RNA fra væv, som ribonukleaseaktivitet rige repræsenterer en stor udfordring for molekylærbiologiske eksperimenter. Forskellige reagenser og kits er kommercielt tilgængelige, der primært er baseret på phenol guanidinthiocyanat metode til RNA-ekstraktion. Guanidinthiocyanat denaturerer protein og dermed reducerer aktiviteten af ribonuclease. , Selve omfanget af ribonuklease i bugspytkirtlen kræver imidlertid yderligere ændringer standardprotokoller RNA isolation. En protokol er rapporteret her, der er baseret på standard guanidinthiocyanat metode endnu indeholder flere kritiske ændringer samt tips til en vellykket isolering af RNA fra ribonuklease rige væv såsom bugspytkirtlen.
Standard retningslinjer til isolering af RNA, skal noteres. Disse teknikker er afgørende for en vellykket isolering af RNA, selv fra prøver, der er mindre ribonuklease-rige end bugspytkirtlen. Nogle eksempler kan nævnes hjælp molekylærbiologisk kvalitet water, ribonuklease-fri hjælpematerialer og engangs plast ware snarere end glas. Det anbefales at skifte handsker mellem hver isolation. For en person, der er uerfaren med at isolere RNA, anbefales det, at de får erfaring med at isolere RNA fra ribonuklease fattige prøver, såsom lever eller fra cellekulturer, inden der iværksættes arbejde, der kræver at isolere RNA fra bugspytkirtlen. Der findes udmærkede protokoller, der tilbyder en bred vifte af point for succes arbejdet med RNA 8.
Flere vigtige faktorer for at isolere RNA med høj integritet fra mus pancreas rapporteres her. Disse omfatter mængden af lysis reagens, der anvendes under homogenisering og inddragelse af en ribonucleaseinhibitor til RNA løsning. Fremgangsmåden ifølge herunder ribonucleaseinhibitor fungerer godt, vil imidlertid gentagne fryse optøningscykler sidst reducere RIN, sandsynligvis på grund af denaturering ribonucleaseinhibitor. Det skal bemærkes, at alle RNA-løsninger used i denne undersøgelse gik igennem en fryse tø før RIN beslutsomhed. En anden fremgangsmåde til reduktion af nedbrydning ved fryse tø er at gemme RNA-opløsning ved -20 ° C i et udfældet form, 2. Dette giver nogle ulemper, nemlig at fjerne ethanol og re-opløse pillen inden brug af RNA. Sammenlignet med phenol / guanidinthiocyanat reagens protokoller 2, fordelene ved protokollen rapporteret her er enkelheden i at arbejde med lysis reagens og rensning kit, der ikke kræver udarbejdelse af specialiserede løsninger og buffere. Det bør også bemærkes, at denne protokol er blevet anvendt med succes til isolering af små RNA'er fra muse pancreas.
Yderligere tips omfatter hastigheden af bugspytkirtlen dissektion og fremgangsmåden af anæstesi før eutanasi (isofluran inhalering foretrækkes til CO2 kvælning). Adskillige forsøg på at praktisere bugspytkirtlen kirurgi anbefales før foregribe høj kvaty RNA. Tilpasning af denne protokol til ribonuklease-rige væv, såsom milt eller lunger bør være let opnåelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo og Satyanarayana Rachagani for deres nyttige kommentarer, forslag og deling af deres protokoller. Dette arbejde blev støttet af tilskud U01CA111294 og en Idéudvikling Award fra Ohio State University Intramural Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
