Introduction
Isolering av RNA med høy integritet er nødvendig for rutinemessig molekylærbiologiske eksperimenter som nordblotting 9, QRT-PCR en eller genuttrykk profilering fem. De fleste moderne fremgangsmåter for RNA-isolering er basert på modifikasjoner av guanidin thiocyanate protokoller 2, 3.. Guanidine tiocyanat er en sterk protein denaturant, og vil effektivt forstyrrer aktiviteten av ribonuklease under de fleste forhold. Den populære metode for Chomczynski and Sacchi 3 kombinerte fenol til guanidin-tiocyanat lysis-løsning, noe som reduserer isolasjons gang til om lag 4 hr. Mange kommersielt tilgjengelige RNA ekstraksjon reagenser er basert på den Chomczynski og Sacchi metode tre.
Ribonuklease rike vev som human eller mus pancreas presenterer en ytterligere utfordring for å isolere RNA. Mus bukspyttkjertelen kan inneholde opp til 75 mg av ribonuklease 6 noen som vil bli utgitt During forstyrrelse av pankreatisk vev resulterer i vev autolyse. Modifikasjoner av guanidin-thiocyanate protokoller har blitt brukt for å isolere RNA fra bukspyttkjertelen med høy integritet 2, 4, 7, 10. Infusjon av RNA stabilisering reagens i mus pancreas lettere isolering av RNA med høy integritet 4, 7, 10, men infusjon løsninger inn bukspyttkjertelen krever stor dyktighet, kan kreve spesialiserte instrumenter som en dissekere mikroskop og forstyrre vevsarkitektur under prosedyren kan føre til cellelyse. Perfusert vev med RNA stabilisering reagens kan forstyrre andre programmer, inkludert protein isolasjon og histologiske flekker. Videre er denne teknikk ikke er egnet for å isolere RNA fra human bukspyttkjertel. Andre protokoller krever utarbeidelse av konkrete løsninger av utprøver to.
Vi rapporterer en protokoll for å isolere RNA med høy integritet fra mus bukspyttkjertelen. The-protokollen bruker elementer av tidligere publiserte metoder og er i stor grad basert på standard fenol / gua-nidin thiocyanate basert Lysereagens protokoller. Det krever ikke utarbeidelse av spesialiserte løsninger heller ikke det krever tilførsel av reagenser i bukspyttkjertelen. Kritiske fremgangsmåte for vellykket RNA isolasjon omfatter et høyt fenol / guanidin-baserte lyse-reagens til vev-forhold, å fjerne ufordøyd vev før faseseparasjon og inkludering av en ribonuklease inhibitor til det resulterende RNA-løsningen. Ved hjelp av disse og andre modifikasjoner, vi vanligvis isolere RNA med RIN større enn 7 til å bli brukt for rutine genekspresjonsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse
Følgende praksis å følge retningslinjene som er fastsatt av institusjonens Animal Care og bruk Committee (IACUC).
- Det anbefales å isolere ikke mer enn seks mus pancreases i en gitt dag. Har alle kirurgiske instrumenter rene og autoklaveres, ett sett per dyr.
- Merk alle mikrosentrifugerør. Fire 2 ml rør per dyr.
- Plasser 8 ml lyserings reagens i 50 ml sentrifugerør på is. Merk: Mens rensing kit kommer med en guanidine thiocyanate fenol reagens som er egnet for bukspyttkjertelen isolasjon, er lysis reagens brukt på grunn av de store volumene som er nødvendig per isolasjon.
- Tilsett ca 10 ml av følgende løsninger i 15 ml sentrifugerør for rensing homogenisatoren skiver. Etanol, 70% (to rør), HPLC-kvalitet vann (1) og rør-HPLC kvalitetsbestemt vann inneholdende omtrent 200 pl RNase bort eller tilsvarende ribonuklease inaktivator. 2. Kirurgi, Pancreas Dissection og homogenisering
- Plasser 1-2 ml av isofluran i en krukke som inneholder bomull gasbind eller tørkepapir. Mus blir plassert på en plattform som forhindrer dem fra å nå kilden til isofluran. Legg frisk isofluran til glasset før bedøvelse hver mus.
- Forsiktig plassere musen ned i glasset inneholder isofluran. Sett lokk på glasset og overvåke effekten av anestesi ved å forsiktig rotere glasset frem og tilbake. Dyret ble bedøvet når den er i stand til å skille seg i sin 'egen.
- For bekreftelse av anestesi, fjerne dyret fra glasset og bruke en fast tå klype. Hvis musen ikke reagerer på tå klype, fortsett til trinn 2.5.
- Hvis musen reagerer på tå klype, og gjenta trinn 02.02 til 02.03.
- Plasser bedøvet dyret på benken toppen i liggende stilling. Forrykke musen livmorhals ved tett plassere venstre hånd på musen livmorhals. Ossing høyre hånd gripe musens hale og raskt trekke oppover i ca en 45 ° vinkel for å forrykke livmorhalsen.
- Fest kadaveret til en overflate (et nivå stykke styrofoam dekket med tørkepapir) ved piercing hver av dyrets fire poter i den flate overflaten med 25 gauge sprøyte nåler.
- Bruk sterile kirurgiske instrumenter, kutte midsection av musen åpen og raskt fjerne bukspyttkjertelen fra musen. Bruk pinsett til å holde bukspyttkjertelen og klippe det fra milten og tynntarmen ved hjelp av våren saks. Vær forsiktig så du ikke å strekke bukspyttkjertelen under flyttingen fra musen. Forstyrrelse av vevet kunne frigjøre ribonuklease. Merk: Tiden det tar å fjerne bukspyttkjertelen fra musen er kritisk. En fagmann skulle være i stand til å dissekere bukspyttkjertelen på ca 1 min eller mindre.
- Plasser hele bukspyttkjertelen i et 50 ml rør inneholdende 8 ml iskald lyserings reagens. Sett lokk på røret og kort riste å fordype TIssue inn i reagens og gå videre til neste trinn uten forsinkelse. Forholdet mellom lysis reagens til vev er kritisk. Se under resultatene for en sammenligning av RNA integritet isolert ved anvendelse av forskjellige mengder av lysis reagens.
- Homogen for 5 sek. Det er viktig å trykke homogenisatoren bladene til bunnen av sentrifugerøret, slik at vevet som skal trekkes inn i bladene for effektiv homogenisering.
- Overføring 2 ml lysis-reagens inneholdende lyserte bukspyttkjertelen til et 2 ml mikrosentrifugerør. Samle to mikrosentrifugerør av homogenate per isolasjon. Kast den gjenværende homogenatet eller lagres ved -80 ° C i fremtidige studier.
- Centrifuge ved 4 ° C, 12.000 x g i 5 minutter for å pelletere ufordøyd vev. Dette er et kritisk punkt som carry av ufordøyd vev til påfølgende løsninger av RNA vil sannsynligvis forurense prøven med ribonuklease (trinn 5.13).
- Overføring 1 ml av supernatanten til et 2 ml mikrosentrifugerør. Fortsett med isolering og oppbevare den replikere rør ved -80 ° C for fremtidig bruk. Plasser alle rør som inneholder homogenate på våt is mens du går videre til neste trinn.
- Kast den gjenværende lysis reagens i en passende kjemisk avfall mottaket.
- Før du går videre til neste isolasjon, rengjøre homogenisatoren bladene ved å plassere dem i 10 ml 70% etanol. Aktiver homogenisatoren i ca 20 sekunder for å fjerne eventuelle biter av vev som kan fanges opp av knivene.
- Bruk en 200 mL pipette spissen for å fjerne eventuelle brikker som gjenstår i homogenisatoren bladene. Gjenta trinn 4.1 i vannet, generell Rnase inaktivator og 70% etanol. Tørk homogenisatoren akselen med en ren Kim tørk.
- Gjenta trinn 2.1 for bukspyttkjertelen isolering av de gjenværende dyr, holder RNA isolert fra hvert dyr separat i stedet for å samle RNA.
- Hvis du bruker frosne homogenate løsning, tine på våt is og la stå i romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 200 ul kloroform, hetten røret og rist kraftig for hånd i 15 sekunder. La røret stå ved RT i 2 til 3 min.
- Sentrifuger i 15 minutter ved 12 000 x g, 4 ° C.
- Overfør det øvre vannlaget i en mikrosentrifuge tube. Tilsett 1,5 volumer av isopropanol og blandes grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Overfør opptil 700 pl av prøven inn i et spinn kolonne som er plassert i en 2 ml prøverør. Lukk lokket og sentrifuger ved 8000 xg i 15 sekunder ved romtemperatur.
- Kast gjennomstrømning.
- Gjenta trinn 05.05 til 05.06, ved hjelp av resten av utvalget.
- Legg 700 mL buffer RWT til spin kolonnen. Sentrifuger i 15 sekunder ved 8000 x g. Kast gjennomstrømning.
- Pipet 500 mL buffer RPE inn i spin kolonnen. Sentrifuger i 15 sekunder ved 8000 x g for å vaske kolonnen. Kast gjennomstrømning.
- Legg 500 mL buffer RPE til spin kolonnen. Sentrifuger i 2 min ved 8000 x g for å tørke kolonnen.
- Overfør spin kolonnen til en 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Pipet 80 mL ribonuklease fritt vann direkte på membran spin kolonnen. Sentrifuger i 1 min ved 8000 x g for å eluere den RNA.
- Legg en mL RNase inhibitor til RNA løsning. Oppbevar ved -80 ° C eller gå videre til 5,13.
- For å validere integriteten av RNA, først beregne RNA concentration og 260/280 ratio ved hjelp av et spektrofotometer.
- Fortynn en del av RNA-oppløsningen til omtrent 500 ng / mL med molekylærbiologi grad av vann.
- Bestem RNA Integrity (dvs. RIN) ved hjelp av kapillær elektroforese analyse. Omtrent 5 pl av RNA-oppløsningen er tilstrekkelig for analyse.
- Aliquot av RNA-løsning (se figur 2) og oppbevares ved -80 ° C.
Tre. Fjerning av ufordøyd Tissue
Merk: Etter homogenisering blir små biter av vev forblir i lysis-reagens. Det er mer viktig å raskt lyserer vevet later noen vev ufordøyd stedet for over homogenisere og risiko degradering av RNA.
4. Rengjøring av homogenisatoren Blades
5. RNA Isolation
I det følgende er identisk med rensing kit-protokollen. Fordelen med rensesettet er at det vil isolere total RNA med små RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det totale RNA utbytte fra 1 ml av homogenatet lyse er 20 til 40 ug. OD 260/280 forholdstall er vanligvis rundt 2,0 og RIN er gjennomgående større enn 7,0. Hvis RIN er ≤ 6, vil det isolert sett må gjentas. Av og til blir en RIN som er høyere enn 8,0 oppnådd.
De to mest brukte metodene for euthanizing mus før fjerning av bukspyttkjertelen er CO 2 kvelning eller innånding av isofluran. Begge teknikker er fulgt ved cervikal dislokasjon. Siden det er mulig at den kjemiske middel og / eller fremgangsmåte tid kan påvirke RNA integritet, RIN mus pankreatisk RNA isolert ved anvendelse av begge metoder ble sammenlignet. Mus ble bedøvet ved hjelp av CO 2 kvelning eller isofluran innånding; begge metoder ble fulgt ved cervikal dislokasjon. Tidspunktet for bedøvelse dyrene før halshugging var omtrent 1 til 2 min lenger for CO 2 kvelning forhold til isoflUrane. RNA isolert etter inhalasjon av isofluran produsert en RIN på 7,5 ± 0,31 i forhold til en RIN på 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, gjennomsnitt ± SD, triplikate isoleringer) for CO 2 kvelning. Fremgangsmåten eutanasi har en dramatisk effekt på RNA integritet og teknikken av isofluran inhalering er foretrukket til CO 2 kvelning.
Integriteten av RNA isolert fra mus pancreases som ble homogenisert i 2, 4 og 8 ml lyserings reagens ble sammenlignet. Vi antok at øke volumet av lysis reagens vil føre til en større grad av ribonuklease-inaktivering. Annet enn volumet av lyseringsmiddel, alle betingelser var identiske med dem som er oppført i protokollen. Det var en direkte korrelasjon mellom volumet av lysis reagens som brukes i homogenisering og RNA integritet (se figur 1). Den RIN av RNA isolert ved bruk av 2, 4 og 8 ml lyserings reagens var 4,2, 6,5 og 7,4 henholdsvis (gjennomsnitt, er triplikatolations). Derfor 8 ml lyserings reagens bør brukes i denne protokollen.
For noen eksperimenter, kan det være nødvendig å samle både RNA-og protein fra samme bukspyttkjertelen. For eksempel kan RNA bli brukt for QRT-PCR og proteinet kan bli visualisert ved hjelp av immunohistokjemi. Hvis dette er tilfelle, er det anbefalt å kutte bukspyttkjertelen i halvparten fra hode til hale. Dette er viktig siden bukspyttkjertelen anatomisk forskjellig fra hode til hale. For å påvise om noen forskjeller i RNA integritet eksisterer mellom RNA isolert fra en av halvdelene av bukspyttkjertelen, ble følgende eksperiment utført. RNA ble isolert fra den første halvdelen av bukspyttkjertelen. Den RIN bestemmes ut fra dette RNA ble sammenlignet med RNA isolert fra den andre halvdel av pankreas etter at det satt ved romtemperatur i ca 30 sek under opparbeidelse av den første halvparten. Den RIN for den første halvparten av bukspyttkjertelen var 7,4 ± 0,20 i forhold til en RIN på 6,9 ± 0,55 for den påfølgende halvår. Mens kutte bukspyttkjertelen idenne måte synes ikke å frigi ribonuklease og fordøyelsen av RNA, hvis bukspyttkjertelen er for å bli delt, er det anbefalt å bruke den første halvdel for RNA-analyse, og den andre halvdel for protein.
Lysis reagens forstyrrer proteinstruktur og derfor reduserer ribonuklease-aktivitet. På grunn av den store mengden av ribonuklease som er tilstede i bukspyttkjertelen, er det mulig at noen aktive ribonuklease forblir i lysis homogenat og dette ribonuklease vil stabilisere seg i den vandige fase. Enhver ribonuklease som gjenstår i den siste RNA løsning vil hindre integritet. For å overvinne dette, la vi en ribonuklease inhibitor til den vandige oppløsning av RNA. Den RNA integritet ble sammenlignet av en RNA-løsning som inneholdt ribonuklease-inhibitor til en som ikke har. Ved en fryse tine, RIN for løsning av RNA med inhibitor var 7,3 ± 0,15 i forhold til 2,9 ± 0,65 (Figur 2, p <0,001, gjennomsnitt ± SD, triplikate isoleringer) for detløsning som ikke inneholdt inhibitor. En annen sak er muligheten for at gjentatte fryse tining vil denature ribonukleasehemmer gjengi det ineffektive. For å undersøke denne mulighet, ble en oppløsning av RNA inneholdende ribonuklease inhibitor gjentatte ganger frosset og tint. RNA løsninger som ble frosset og tint opp til fem ganger fortsatt produsert en RIN av 7 eller høyere mens de løsningene som ble frosset og tint seks ganger eller høyere produsert en RIN under 7 (figur 2). Det anbefales å delmengde RNA løsning før frysing og begrense antall fryse tining.
For å demonstrere nytten av denne metoden, utførte vi QRT-PCR på den isolerte RNA. Middelverdien RIN fra tredoble RNA isoleringer var 7,4 ± 0,20 (gjennomsnitt ± SD). Tilfeldig primet cDNA ble syntetisert fra RNA og ekspresjonen av tre husholdningsgener ble målt ved qPCR ved anvendelse av standard teknikker. De som er vist i figur 3 validerer datavår evne til å lykkes med å bruke musen bukspyttkjertelen RNA i en standard molekylær biologi teknikk.
Figur 1. Høy lysis reagens til vev-forhold forbedrer RNA integritet. Integriteten av RNA isolert fra mus pancreases som ble homogenisert i 2 (A, D), 4 (B, E) eller 8 (C, F) ml lysis reagens var sammenlignet. Annet enn volumet av lyseringsmiddel, alle betingelser var identiske med de som er i beskrevet i protokollen heri. En direkte korrelasjon mellom volumet av lysis reagens som brukes i homogenisering og RNA integritet. (G) Gjennomsnitt ± SD, tredoble isoleringer. p <0,05, ** p <0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjonav denne figur.
Figur 2. RNA nedbrytes til slutt ved gjentatt frysetining. RNA isolert fra mus pancreas ble gjentatte ganger frosset og tint i nærvær eller fravær av ribonuklease-inhibitor (RNase I). Gjennomsnitt ± SEM, ** p <0,001.
Fig. 3. QRT-PCR av mus pankreatisk RNA. RNA ble isolert fra tre mus pancreases ved hjelp av optimalisert protokollen. Uttrykket av 18S rRNA, β-2 mikroglobulin og snoRNA251 ble fastsatt ved hjelp QRT-PCR (Mean ± SD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolere RNA fra vev som er ribonuklease rik representerer en stor utfordring for molekylærbiologi eksperimenter. Forskjellige reagenser og kit er kommersielt tilgjengelig som primært er basert på fenol-guanidin-tiocyanat-metoden av RNA ekstraksjon. Guanidin-tiocyanat denatures protein og dermed reduserer aktiviteten av ribonuklease. Men selve omfanget av ribonuklease i bukspyttkjertelen krever ytterligere endringer i standardprotokoller av RNA isolering. En protokoll som er rapportert her som er basert på standard guanidin-tiocyanat-metoden ennå inneholder flere viktige modifikasjoner samt tips for vellykket isolering av RNA fra ribonuklease rike vev som bukspyttkjertelen.
Standard retningslinjer for å isolere RNA som skal noteres. Disse teknikkene er kritisk for vellykket isolering av RNA, selv fra prøver som er mindre enn ribonuklease-rik bukspyttkjertelen. Noen eksempler er ved hjelp av molekylær biologi klasse water, ribonuklease frie forbruksvarer og disponibel plast ware snarere enn glass. Det anbefales å skifte hansker mellom hver isolasjon. For en som er uerfaren med å isolere RNA, anbefales det at de får erfaring med å isolere RNA fra ribonuklease fattige prøver som lever eller fra cellekulturer før du tar fatt på arbeidet som krever isolere RNA fra bukspyttkjertelen. Utmerket protokoller finnes som tilbyr en rekke punkter for vellykket arbeid med RNA åtte.
Flere viktige faktorer for å isolere RNA med høy integritet fra mus bukspyttkjertelen rapporteres her. Disse omfatter volumet av lysis-reagens som brukes under homogenisering og inkluderingen av en ribonuklease inhibitor for RNA-løsningen. Fremgangsmåte av å inkludere ribonuklease inhibitor fungerer godt, vil imidlertid gjentatte fryse tinesykluser etter hvert redusere RIN, sannsynligvis på grunn av denaturering av ribonuklease-inhibitor. Det bør bemerkes at alle RNA-løsninger used i denne studien gikk gjennom ett fryse tine før RIN besluttsomhet. En annen metode for å redusere nedbrytning ved fryse tine er å lagre den RNA-løsning ved -20 ° C i et utfelt skjema 2.. Dette har noen ulemper, nemlig fjerning av etanolen og re-oppløsende pellet før bruk av RNA. Sammenlignet med fenol / gua-nidin thiocyanate reagent protokoller 2, rapporterte fordeler ved den protokoll her er enkelheten ved å arbeide med lysis reagens og rensesett som ikke krever fremstilling av spesielle løsninger og buffere. Det bør også bemerkes at denne protokoll har blitt brukt for å isolere små RNA fra muse bukspyttkjertelen.
Flere tips inkluderer hastigheten på bukspyttkjertelen disseksjon og metoden for bedøvelse før avlivning (isofluran inhalering er foretrukket til CO 2 kvelning). Flere forsøk på å praktisere bukspyttkjertelen kirurgi er anbefalt før forutse høy kvality RNA. Tilpassing av denne protokollen til ribonuklease rike vev som milt og lunger bør være lett oppnåelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo og Satyanarayana Rachagani for nyttige kommentarer, forslag og deling av sine protokoller. Dette arbeidet ble støttet av stipend U01CA111294 og en Idea Development Award fra Ohio State University egenutført Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
