Introduction
高い整合性を持つRNAの単離は、ノーザンブロット法9、定量RT-PCRの1または5の遺伝子発現プロファイリングなどの日常的な分子生物学の実験のために必要とされている。 RNA単離の最も現代的な方法は、グアニジンチオシアネートプロトコル2、3の修正に基づいている。グアニジンチオシアネートは、強力なタンパク質変性剤であり、効果的に、最も条件の下でリボヌクレアーゼの活性を破壊します。をChomczynskiおよびSacchi 3の一般的な方法は、約4時間までの単離時間を短縮する、チオシアン酸グアニジン溶解溶液にフェノールを組み合わせる。多くの市販のRNA抽出試薬をChomczynskiおよびSacchi法3に基づいている。
例えば、ヒトやマウスの膵臓リボヌクレアーゼ多い組織は、RNAを分離するための新たな課題が発生します。マウスの膵臓は、そのうちのいくつかは、ドゥリンリリースされるリボヌクレアーゼ6の75ミリグラムを含有することができるg組織の自己消化、その結果膵臓組織の破壊。グアニジンチオシアプロトコルの改変に成功し、高い完全性2、4、7、10の膵臓からRNAを単離するために使用されてきた。RNA安定化試薬の注入マウスの膵臓中へ、高い整合性4、7、10の一方注入をRNAの単離を容易に膵臓へのソリューションは素晴らしいスキルを必要とし、このような解剖顕微鏡などの特殊な機器を必要とし、処置の間に組織構造を崩壊させることは、細胞溶解の原因となります。 RNA安定化試薬を用いて組織を灌流すると、タンパク質の単離と組織染色など、他のアプリケーションに干渉することがあります。さらに、この技術は、ヒト膵臓からRNAを単離するには適していない。他のプロトコルは、研究者2による特定の溶液の調製を必要とする。
我々は、マウスの膵臓からの高い整合性RNAを単離するためのプロトコルを報告する。目Eプロトコルは、以前に発表された方法の要素を使用しており、大部分は、標準的なフェノール/グアニジンチオシアネート·ベースの溶解試薬プロトコルに基づいています。これは、専門の溶液の調製を必要とせず、また膵臓に試薬の注入を必要としません。成功したRNAの単離のための重要なステップは、未消化組織の除去は、得られたRNA溶液にリボヌクレアーゼ阻害剤の分離および包含を位相の前に、組織比に高いフェノール/グアニジン系、溶解試薬を含む。これらおよび他の変更を使用して、我々は、典型的には、7より大きいルーチン遺伝子発現解析に用いるRINでRNAを単離する。
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Protocol
1。準備
次のプラクティスは機関の動物実験委員会（IACUC）によって設定されたポリシーに準拠しています。
- これは、任意の日にはもう6よりもマウスの膵臓を分離することをお勧めします。清潔でオートクレーブし、すべての手術器具、動物あたり1セットがあります。
- すべてのマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。動物あたり4つの2 mlチューブ。
- 氷上の50ml遠心管中で溶解試薬の8ミリリットルを配置します。注：精製キットは、膵臓の分離に適していますグアニジンチオシアネートフェノール試薬が付属していますが、溶解試薬があるため、分離ごとに必要な大量の使用されています。
- ホモジナイザーのブレードを洗浄するための15ml遠心チューブに以下の溶液約10mlを分注する。エタノール、70％（2本）、HPLCグレードの水（1管）とアウェイのRNaseの約200μLを含むHPLCグレードの水または同等のリボヌクレアーゼ不活性化。 2。手術、膵臓の解剖及び均質化
- コットンガーゼやペーパータオルを含むJARにイソフルラン1〜2mlのを配置します。マウスはイソフルランのソースに到達するのを防止するプラットフォーム上に配置されている。前各マウスを麻酔にジャーに新鮮イソフルランを追加します。
- 優しくイソフルランを含むJARにマウスを置きます。 jarファイルに蓋をし、ゆっくりと前後に瓶を回転させることによって、麻酔の効果をモニターする。それはそれ自身で立つことができないになると動物に麻酔をかけている。
- 麻酔の確認のために、ジャーから動物を削除して、しっかりと足指のピンチを適用します。マウスはつま先のピンチに反応しない場合は、2.5に進みます。
- マウスはつま先のピンチに反応する場合は、ステップ2.3に2.2を繰り返します。
- 腹臥位で作業台の上に、麻酔した動物を配置します。しっかりと、マウスの子宮頸部に左手を置くことで、マウスの子宮頸部を脱臼。私達右手はマウスの尾をつかみ、素早く子宮頸部を脱臼に対して約上向きに45°の角度を引くING。
- 25ゲージの皮下注射針を使用して、平らな面に動物の四肢のそれぞれを貫通して表面（ペーパータオルで覆われた発泡スチロールのレベルピース）に死体を固定します。
- 無菌手術器具を使用して、開いてすぐにマウスから膵臓を削除マウスの中央部をカット。膵臓を保持し、春のはさみを使用して、脾臓、小腸からそれをカットする鉗子を使用してください。マウスからの除去の間に膵臓を伸ばすないように注意してください。組織の破壊は、リボヌクレアーゼをリリースできた。注：マウスの膵臓を削除するのにかかる時間が非常に重要です。当業者は、約1分以下で膵臓を解剖することができるはずです。
- 氷冷溶解試薬の8ミリリットルを含む50ミリリットルチューブに膵臓全体を置きます。チューブに蓋をし、簡単にTIを浸漬振る試薬にssue遅滞なく次のステップに進みます。組織への溶解試薬の比率が非常に重要です。溶解試薬の異なるボリュームを使用して単離されたRNAの完全性の比較の結果の項を参照してください。
- 5秒間均質化する。これは、組織が効率的な均質化のためにブレードに引き込まれることを可能にする遠心分離管の底部にホモジナイザーブレードを押圧することが重要である。
- 転送2ミリリットルの微量遠心チューブに溶解した膵臓を含む溶解試薬の2ミリリットル。アイソレーションごとホモジネートの2マイクロチューブを収集します。今後の研究のために-80℃で、残りのホモジネートまたはストアを破棄します。
- セント4℃で、未消化の組織をペレット化する5分間12,000×gでrifuge。これはおそらく、リボヌクレアーゼ（ステップ5.13）で試料を汚染するRNAのその後のソリューションに未消化の組織のキャリーオーバーなどの重要なステップです。
- 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す上清の1ミリリットル。すぐに分離を進め、将来の使用のために-80℃で複製チューブを格納します。次のステップに進むながら濡れた氷の上にホモジネートを含むすべてのチューブを配置します。
- 適切な化学廃棄物容器に残った溶解試薬を処分。
- 次の単離に進む前に、70％エタノール10ml中に置くことにより、ホモジナイザーをクリーニングブレード。刃に巻き込まれることがあり、組織の任意の塊を除去するために20秒程度のためのホモジナイザーをアクティブにします。
- ホモジナイザーブレードに残っている部分を除去するために200μlのピペットチップを使用してください。 水、一般的なRNA分解酵素を不活性化し、70％エタノールでの手順を繰り返し4.1。キムワイプクリーンでホモジナイザーシャフトを乾燥させます。
- 残りの動物の膵臓の分離について、手順2.1、むしろRNAをプールとは別の各動物から単離されたRNAを保つ。
- 凍結したホモジネート溶液を使用した場合、5分間RTでスタンドを濡れた氷の上で解凍してみましょう。
- 200μlのクロロホルムを加え、チューブにキャップをし、15秒間、手でよく振る。チューブは2〜3分間室温で放置。
- 12,000 XG、4℃で15分間遠心
- マイクロ遠心チューブに上層の水層を転送します。イソプロパノール1.5ボリュームを追加し、上下に数回ピペッティングしてよく混ぜ。
- 70まで転送する2 mlのコレクションチューブに配置されているスピンカラムへの試料液の0。室温で15秒間8000×gで蓋をし、遠心分離機を閉じます。
- フロースルーを捨てる。
- 繰り返してサンプルの残りを使って、5.5から5.6を繰り返します。
- スピンカラムに700μlのBuffer RWTを追加します。 8,000 X gで15秒間遠心します。フロースルーを捨てる。
- スピンカラムにピペットで500μlのBuffer RPE。カラムを洗浄するために8000×gで15秒間遠心分離する。フロースルーを捨てる。
- スピンカラムに500μlのBuffer RPEを追加します。カラムを乾燥するために8000×gで2分間遠心分離する。
- 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移す。直接スピンカラム·メンブレンにピペットで80μlのリボヌクレアーゼを含まない水。 RNAを溶出するために8000×gで1分間遠心分離する。
- RNA溶液に1μlのRNase阻害剤を追加します。 -80℃で保存するか、5.13に進みます。
- RNAの完全性を検証するために、最初のRNA conceを計算分光光度計を用いてntrationと吸光度比260/280。
- 分子生物学グレードの水で約500 ngの/μlにRNA溶液の一部を希釈する。
- キャピラリー電気泳動分析を用いてRNA完全性（ すなわち 、RIN）を決定します。 RNA溶液約5μlを分析のために十分である。
- -80℃でRNA溶液（ 図2を参照）、店舗を分取
未消化の組織の3。取り外し
注意：均質化に続いて、組織の小さなビットは溶解試薬に残ります。それはすぐに均質化し、RNAのリスク低下を介してではなく、未消化いくつかの組織を残して組織を溶解することがより重要である。
ホモジナイザーブレードの4。クリーニング
5。RNAの単離
次のセクションでは、精製キットプロトコルと同じです。精製キットの利点は、低分子RNAを含む全RNAを単離することである。
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Representative Results
溶解ホモジネートの1ミリリットルからの全RNAの収量は20〜40μgのです。 OD 280分の260の比率は、典型的には約2.0であり、RINは7.0よりも一貫して大きい。 RINは6≤されている場合は、アイソレーションが繰り返される必要があります。時々、8.0より高いRINが達成される。
前膵臓の除去にマウスを安楽死させる2つの最も一般的に使用されている方法は、CO 2窒息またはイソフルランの吸入である。両方の技術は、頸椎脱臼に続いている。それは、化学剤及び/又は処置時間は、RNAの完全性に影響を与える可能性があることが可能であるので、マウス膵臓RNAのRINは、両方の技術を用いて単離し比較した。マウスをCO 2窒息またはイソフルラン吸入を用いて麻酔した。両方の技術は、頸椎脱臼により追跡した。動物を麻酔の際には、事前の頸椎脱臼にisoflに比べて、CO 2窒息のために、約1から2分長かったurane。イソフルランの吸入後単離したRNAは、CO 2窒息のための2.2±0.3のRIN（P <10 -4、アイソレーションを三重、平均±SD）に比べて7.5±0.31のRINを生産した。安楽死の方法は、RNAの完全性に劇的な影響を与え、イソフルラン吸入の技術は2窒息をCOに好ましい。
溶解試薬の2,4、および8中でホモジナイズしたマウスの膵臓から単離したRNAの完全性を比較した。我々は、溶解試薬の体積を増加させることリボヌクレアーゼ不活性化の大きな程度につながるという仮説を立てた。溶解試薬の体積を除く、全ての条件は、プロトコルに記載されたものと同一であった。均質化およびRNAの完全性（ 図1）で使用される溶解試薬 の量との間に直接的な相関関係が認められた。 RNAのRINは溶解試薬の2,4、および8ミリリットルを用いて単離する三連で、意味（それぞれ、4.2、6.5および7.4であったolations）。したがって、溶解試薬8mlのは、このプロトコルで使用されるべきである。
いくつかの実験のために、同じ膵臓からのRNAおよびタンパク質の両方を収集する必要があり得る。例えば、RNAは、定量RT-PCRのために使用することができ、タンパク質は免疫組織化学を用いて可視化することができる。このような場合は、それが頭から尾まで半分に膵臓をカットすることをお勧めします。膵臓は先頭から末尾まで、解剖学的に異なるため、これは重要です。 RNAの完全性の違いは、膵臓の半分のいずれかから単離されたRNAの間に存在する場合に証明するために、以下の実験を行った。 RNAを、膵臓の前半から単離した。 RINは、このRNAから決定は、それが最初の半分の精密検査の間、約30秒間、室温で座った後、膵臓の後半から単離されたRNAと比較した。膵臓の初期の半分RINは、後続の半分6.9±0.55のRINに比べて7.4±0.20であった。膵臓をカットしながらこの方法は、膵臓が区分けされる場合、それはRNA解析やタンパク質の後半前半を使用することが推奨され、リボヌクレアーゼとRNAの消化を解放するためには表示されません。
溶解試薬は、タンパク質の構造を破壊し、従って、リボヌクレアーゼ活性を減少させる。による膵臓中に存在するリボヌクレアーゼを多量に、それはいくつかのリボヌクレアーゼ活性は、溶解ホモジネートに残り、このリボヌクレアーゼを水相に平衡化することが可能である。最後のRNA溶液中に残っている任意のリボヌクレアーゼは、整合性を妨げます。これを克服するために、我々は、RNAの水溶液にリボヌクレアーゼ阻害剤を添加した。 RNAの完全性はなかったものにリボヌクレアーゼ阻害剤を含んでいたRNA溶液から比較した。 1凍結解凍時に、阻害剤を用いたRNAの解のRINはため（ 図2、P <0.001、アイソレーションを三重、平均±SD）2.9±0.65に比べて7.3±0.15であった阻害剤が含まれていませんでしたソリューションを提供します。もう一つの問題は、凍結融解が無効それをレンダリングする阻害剤リボヌクレアーゼを変性します繰り返さ可能性である。この可能性を調べるために、RNA含有リボヌクレアーゼ阻害剤の溶液を繰り返し凍結融解した。凍結し6倍以上が融解し、これらのソリューションは、図7（ 図2）の下方RINを生成しながら、凍結し、5回まで解 凍したRNA溶液は、依然として7以上のRINを生成した。これは、凍結前にRNA溶液を分取し、凍結融解サイクルの数を制限することをお勧めします。
この方法の有用性を実証するために、我々は、単離されたRNAに定量RT-PCRを行った。三連のRNAの単離からの平均RINは7.4±0.20であった（平均±SD）。ランダムプライムcDNAをRNAから合成した三ハウスキーピング遺伝子の発現は、標準的な技術を用いてqPCRにより測定した。 図3に示したデータを検証首尾よく標準的な分子生物学の手法でマウスの膵臓のRNAを使用する当社の能力。
溶解試薬 の図1の組織比が高い溶解試薬 は、RNAの完全性を向上させる。2（A、D）で均質化したマウスの膵臓から単離したRNAの完全性を、図4（B、E）または8（C、F）溶液であった比較した。溶解試薬の体積を除く、全ての条件は、プロトコル本明細書に記載のものと同一であった。直接的な相関関係が均質化し、RNAの完全性で使用される溶解試薬 の量の間に存在する。（G）の平均±SD、三連単離。 P <0.05、** P <0.001。 拡大バージョンを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
図2 RNAは最終的に繰り返される凍結融解の際に分解する。マウスの膵臓から単離したRNAを繰り返しリボヌクレアーゼインヒビター（RNアーゼI）の存在下または非存在下で凍結し、解凍した。 ±SEM、** P <0.001を意味する。
図3：マウス膵臓RNAの定量RT-PCR。RNAは、最適化されたプロトコルを使用して、3つのマウスの膵臓から単離した。 18S rRNAの発現は、β-2ミクログロブリンおよびsnoRNA251は、定量RT-PCRを（平均±SD）を用いて決定した。
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Discussion
リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離することは分子生物学的実験のための大きな課題を表しています。様々な試薬およびキットは、主にRNA抽出のフェノールグアニジンチオシアネート法に基づいているが市販されている。グアニジンチオシアネートは、タンパク質を変性し、このようにリボヌクレアーゼ活性を低下させる。しかし、膵臓リボヌクレアーゼの膨大な大きさは、RNA単離の標準プロトコルへの追加の変更が必要になります。プロトコルは標準のグアニジンチオシアネート法に基づいていること、ここで報告されていな膵臓リボヌクレアーゼ豊富な組織からのRNAの成功を単離するためのいくつかの重要な修正だけでなく、ヒントが含まれています。
RNAを単離するための標準的なガイドラインは、留意されるべきである。これらの技術は、さらに少ないリボヌクレアーゼが豊富な膵臓よりも標本から、RNAの成功の単離に重要である。いくつかの例は、分子生物学グレードのWAを使用することを含むTER、リボヌクレアーゼフリーの消耗品や使い捨てのプラスチック製食器ではなく、ガラス。それは、それぞれの分離の間に手袋を変更することをお勧めします。 RNAを単離すると不慣れな人のために、それらは肝臓などの膵臓からRNAを単離する必要とする作業に着手する前に、細胞培養物からリボヌクレアーゼの少ないサンプルからRNAを単離するの経験を積むことをお勧めします。優れたプロトコルが成功し、RNA 8を操作するための様々なポイントを提供することが存在します。
マウスの膵臓からの高い整合性RNAを単離するためのいくつかの重要な要因は、ここで報告されています。これらは、均質化の間に使用される溶解試薬の容積及びRNA溶液のリボヌクレアーゼインヒビターを含めることを含む。リボヌクレアーゼ阻害剤がうまく機能を含む方法は、しかしながら、凍結融解サイクル、最終的に起因リボヌクレアーゼ阻害剤を変性する可能性が高いRINを減少させる繰り返す。なお、すべてのRNA溶液のuSEDこの研究に先立って、RIN測定に1凍結融解を通り抜けた。凍結融解の際に劣化を低減する別の方法は、沈殿形態2に-20℃でRNA溶液を記憶することである。これはすなわち、事前のRNAを用いたエタノールと再溶解ペレットを除去し、いくつかの不都合を提供しています。 2フェノール/グアニジンチオシアネート試薬プロトコルと比較すると、ここで報告されたプロトコルの利点は、溶解試薬 と専門ソリューションおよびバッファの準備を必要としない精製キットでの作業の簡単さです。また、このプロトコルは正常マウスの膵臓から低分子RNAを単離するために使用されていることに留意すべきである。
追加のヒントは、膵臓解剖の速度と前安楽死（イソフルラン吸入を2窒息COが好ましい）に麻酔の方法が挙げられる。膵臓の手術の練習でのいくつかの試みが、高いクアリを予想する前に、推奨されているTY RNA。脾臓や肺などのリボヌクレアーゼが豊富な組織へのこのプロトコルの適応は容易に達成可能である必要があります。
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Acknowledgments
我々は彼らの有益なコメント、提案やそのプロトコルの共有のため建華玲、レイモンド·マクドナルド、ガルビンスウィフト、ミシェル·グリフィン、ポールGrippoとSatyanarayana Rachaganiに感謝します。この作品は、付与U01CA111294、オハイオ州立大学学内研究プログラムからのアイデア開発賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
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