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Medicine

외상성 뇌 손상에 대한 제어 피질 충격 모델

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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외상성 뇌 손상 (TBI)은 뇌 기능의 변경, 또는 외력에 기인 뇌 병리의 기타 증거로서 정의된다. TBIs에, 특히 미국에서, 전 세계적으로 심각한 건강 문제가 남아있다. 질병 통제 및 예방 센터에 따르면, 적어도 170 만 TBIs에 모든 부상 관련 사망의 30.5 %의 결과로 미국에서 매년 발생합니다. 2000 년, 직접 의료 비용과 TBIs에의 간접 비용이 미국에서만 예상 7백65억달러 억원. 이전 수십 년간의 기술 및 치료의 발전은 TBIs에 고통받는 사람들을 위해 삶의 질과 길이를 개선했지만, 효과적인 약제 또는 예방 치료는 현재 존재하지 않습니다. 때문에 복잡하고 조직의 병변, 세포 죽음, 그리고 축삭 변성 등의 TBIs에, 넓은 광범위한 효과, 두 개의 상해는 동일하지 않습니다; 따라서, 동물에 대한 현재 TBI 모델은 정확하게 재생하지TBI의 모든 측면은 인간의 본. 그러나, 동물 모델은 또한 TBIs에의 임상 양상 승낙의 희망과 TBI의 여러가지 효과를 조사 할 필요가 거의 동일한 부상을 생산하는 능력을 제공 하나.

제어 피질 충격 (CCI) 모델 동물의 노출 된 경질에 물리적 충격을 전달하는 충격 시스템을 사용한다. 마일드에서 인간에 의해 경험 된 것과 유사한 심각한에 이르기까지 TBIs에를 유도한다. 이 부상은 먼저 흰 족제비 2 특징으로하고 나중에 쥐 3,4, 마우스, 5-7, 그리고 양 8에 사용하기 위해 적응했다. 첫 번째 특성 때문에, 부상의 사이트는 중간 선 2.9과 외측 피질골 (10)에 모두 배치되었습니다. CCI는 TBIs에 대한 효과와 치료 가능성을 조사하기 쉽고 정확한 방법을 제공합니다.

CCI 모델, 유체 타악기 및 체​​중 저하뿐만 아니라 모델 공동 있습니다mmonly TBIs에를 생산하는 데 사용. 그러나 이러한 모델 적은 부상 매개 변수를 제어, 인간 TBIs에 볼 수없는 histopathalogical 변화를 생산하고, 마우스 3,5,10 우발적 죽음의 더 큰 발병률을 포함하여 현재 제한. 폭풍 파 모델은 TBIs에를 생산하는 데 사용됩니다. 폭풍 파 모델은 기계적 충격에 다음과 같은 본 histopathalogical 변경을 재현하지 않지만,이 모델은 정확하게 특히 군인 (11)에 의해 경험 TBIs에 생산 않습니다. 제어 피질 충격 모델에 따라 같은 시간, 속도 및 충격 5의 깊이로 변형 매개 변수를 통해 정확한 컨트롤을 제어하기 쉽다. 이러한 정확도는 더 가능한 동물의 그룹 전체에 걸쳐 거의 동일한 상해를 복제 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은, CCI는 인간 TBIs에 12에서 본 기능을 TBIs에 재현. 그러나 병적 인 찬의 전체 스펙트럼을 재생에 완전히 성공적으로 단일 동물 모델이 없다TBI 후 관찰 GES. 더 자세한 연구가 완전히 TBI 후 발생하는 급성 및 만성 변화를 공개 할 필요가있다.

기본 및 보조 부상 : 부상의 두 가지 유형의 TBI 다음 발생합니다. 기본 부상은 충격의 순간에 발생하고 치료 치료에 대한 구분하지 않습니다; 그러나, 초기 부상 후 유지 보조 부상은 치료 13 될 수 있습니다. 제어 피질 충격 모델은 따라서 연구진은 보조 부상의 가능성이 오래 지속되는 효과를 TBI의 효과와 잠재적 인 치료 치료를 조사 할 수 있도록, 차 상해를 생산하고 있습니다. CCI 모델을 사용하여 잠재적 인 연구 분야는 신경 세포의 죽음, 대뇌 부종, 신경, 혈관 효과, histopathalogical 변경 및 메모리 적자 3,13-16이 포함됩니다.

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Protocol

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동물 관리
남성 C57 BL / 6 마우스는 그룹 보관되어 있었고, 음식과 물을 임의로 액세스 할 수있는 방법을 무료로 12분의 12 시간 빛 / 어둠주기를 유지하고 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 동물 10-12 주 이전이었다. 모든 절차는 인디애나 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 수술 준비

  1. 케타민 / 자일 라진 혼합물 (87.7 ㎎ / ㎖ 케타민 및 12.3 ㎎ / ㎖의 자일 라진)을 사용하여 마우스를 마취하고 IP 주입을 통해 (1 ㎖ / kg)을 투여.
  2. 귀 사이 마우스의 머리를 면도.
  3. 수술하는 동안 건조 방지하기 위해 마우스의 눈에 석유 기반의 젤리를 적용합니다.
  4. 10 %의 요오드 면도 영역을 청소합니다. 그런 다음 요오드를 정리하는 70 % 에탄올을 사용합니다.
  5. 귀 바, 물린 플레이트를 사용하여 정위 프레임에 마우스 머리를 고정합니다. 뇌가 안정되어 있는지 확인합니다.

2. Craniectomy

  • 가위 헤드의 중앙에 길이 방향을 절개한다. 왼쪽에 떨어져 피부를 잡아 지혈을 사용합니다.
  • 두개골을 노출하는 뼈의 혈액과 조직을 제거하기 위해 면봉을 사용합니다. 노출 된 두개골은 1 분 동안 건조 할 수 있습니다.
  • 압력을 적용하고 두개골은 움직이지 유지되도록하기 위해 집게를 사용합니다. 해부학 적에게 람다 (꼬리 측면)과 브레 그마 (정면 측면을) 확인합니다. 4 mm 직경 멀리 정중선에서 0.5 mm로 람다와 브레 그마의 중앙에 원을 그립니다.
  • 표시된 원을 따라 잘라 드릴을 사용합니다. 부드럽게 떨어져 뼈 먼지를 날려. 경막의 손상을 방지하기 위해 뼈를 완전히 드릴하지 마십시오.
  • 뼈를 제거하고 경막을 노출 집게를 사용합니다.
  • 3. 끼워 넣기

    충격 장치는 충격 파라미터를 설정하는 제어 박스, 끼워 넣기를 수행하는 액츄에이터 및 행동을 확보하기 정위 프레임을 포함영향에 대한 uator와 마우스 머리.

    1. 수술 전 3m / 초에 액추에이터의 속도를 미리 설정합니다.
    2. 다른 부상의 심각도를 유도하기 위해 서로 다른 변형의 깊이를 미리 설정합니다. 0.0-0.2 mm, 0.5 ~ 1.0 ㎜, 1.2-2.0 mm의 변형 깊이는 각각, 중등도, 중증 TBIs에 될 것입니다. 이 프로토콜은 3m / 초의 속도를 사용하여 1mm의 변형 깊이와 적당히 심각한 뇌 손상을 달성하는 방법을 설명했다.
    3. 정위 프레임 홀더에 액츄에이터를 부착하고 오픈 두개골 영역의 중심에있는 액추에이터 (3 mm 직경)의 둥근 플랫 팁 보호를위한 이동 미세 조작기를 사용합니다. 그런 영향 사이트의 표면에 평행 한 각도로 끝을 조정한다.
    4. 선단이 충격 사이트의 표면에 닿을 때까지 연장되는 모델 액추에이터를 이동하여 영점을 설정. 그런 제로 정위 제어판의 Z 채널을 설정합니다.
    5. 임팩터 팁 후퇴동시에 1mm 아래 액추에이터를 이동시키면서.
    6. 부상 사이트를 공격, 1 mm의 변형 깊이를 달성하기 위해 충격 버튼을 누르십시오.

    4. 상해 사이트 폐쇄

    1. 모든 혈액 다음과 같은 영향을 제거하기 위해 면봉을 사용하지만, 부상 영역을 만지지 마십시오.
    2. 체온을 유지하기 위해 따뜻한 패드에서 마우스를 놓습니다.
    3. 출혈이 중지되면, 폐쇄 상처를 봉합. 깨끗한 케이지에 다시 동물을 넣어 따뜻한 패드 밤새 수술에서 회복 할 수 있습니다.
    4. 관리 프레 놀핀 0.05-0.10 ㎎ / kg SQ 수술 후 2 일간 매일 8 ~ 12 시간.

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    Representative Results

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    제어 피질 충격 모델은 온화한에서 심한 정도에 이르기까지 TBIs에 발생합니다. 포스트 영향 뇌 부종의 양, 출혈, 및 영향 사이트에서 두개골 변형 속도와 변형 깊이 매개 변수로 인한 부상의 심각도를 발표 할 예정이다. 온화한 TBIs에 의한 제한 경질 위반에 미치는 영향 사이트와 약간의 출혈로 뇌 부종의 원인. 적당한 TBI는 뇌 부종을 전시 인해 끼워 따라 경질 위반 (그림 1)에 출혈이 증가했다. 중등도 TBI 차이점은 현미경 (도 2)를 이용하여 고정 된 조직에서 가시화 될 때까지 구별하는 것이 어려울 수있다; 그러나, 심한 TBI 가끔 증폭 왜곡과 뇌 부종 포스트에 미치는 영향을 표시 할 수 있습니다. CCI 모델은 조직 변형 (도 2), 신경 세포 죽음과 histopathalogical TBIs에 변화 등의 여러 측면의 효과를 결정하기 위하여 사용될 수있다.

    = "jove_content"FO : 유지 - together.within 페이지를 = "항상"> 그림 1
    그림 1. 중간 외상성 뇌 손상에 대한 대뇌 피질의 영향 모델 제어. 제어 대뇌 피질의 영향을위한 절차는이 그림에 나와 있습니다.) 마우스 머리가 안정적으로 이어 줄 입 비트. B와 정위 프레임에 고정 된) 왼쪽 두개골이었다 노출 4mm 원이 브레 그마 및 람다의 중앙에 그려진. C) 뼈가 영향. D)에 대한 윈도우를 생성하기 위해 시추에 의해 제거 된 액추에이터는 Z 축에 정위 프레임과 제로 점에 있었다 부착 된 설정합니다. E) 뇌 조직이 왜곡 충격. F) 출혈 발생 된 출혈 충격 후 몇 분을 중지하고 혈액면 도포하여 제거 하였다./ ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    보통 외상성 뇌 손상에 대한 그림 2. 조직학. A) 순진 10-12주 된 마우스의 뇌가 제거되었습니다. B) 10 ~ 12 주 된 마우스의 뇌는 10 ~ 12 주 된 마우스의 뇌는 적당한 후 24 시간을 제거 가짜 제어 할 수 있습니다. C)를 사용 하였다 TBI)이 D. CCI 모델을 사용하여 10 ~ 12 주령의 마우스의 뇌 CCI 모델을 사용 6주 적당한 TBI 후에 제거 하였다. 뇌 조직에 들여 쓰기가 충격의 사이트에 분명하다. E) Nissl 염색이 정상 조직학을 보여 가짜 제어 10-12주 된 마우스의 뇌에서 수행 하였다. F) Nissl 염색은 10 ~ 12 주 이전에 수행 된 했다 마우스의 뇌CCI 모델을 사용하여 적당한 TBI를 받았다. 공동 깊은 피질로 확장 볼 수 있습니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

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    성공적으로 CCI를 일으키는 전자 자석 영향 시스템을 사용 TBIs에 일관성을 생성하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1)를 안정적으로 정위 프레임에서 마우스의 머리를 고정; 2) 생쥐 사이 뼈 창의 동일한 크기를 생성하고 craniectomy 중에 하에서 경막 손상없이 뼈를 제거하는 단계; 3) 올바로 개방 영역의 중심에 영향 팁을 위치 및 영향 전에 영점을 설정.

    마우스의 머리는 매우 밀접하게 영향을 미치기 전에 정위 프레임에 고정해야합니다. 느슨한 고정 부상 수준에서 큰 변화가 발생합니다. 고정이 안정 보장하기 위해, 마우스 머리가 정위 프레임에 고정 두개골은 움직이지 남아 있는지 확인되면 두개골에 압력을 적용하는 집게를 사용합니다. 노출 된 두개골의 감염을 방지하기 위해 필요한 조치를 취할 것. 두개골을 노출 한 후, 제어 대뇌 피질의 영향 수술의 가장 어려운 부분으로 이동 : 순환 드릴링아래 경막 손상을주지 않고 두개골로 절단.

    드릴 팁의 최적의 크기는 0.5 mm이다. 적당한 속도는 10000 RPM입니다; 그러나, 더 높은 속도를 사용하는 것이 더 나은 뼈 윈도우 시추 용이하게 할 수있다. 드릴링은 특히 그의 뼈와 경막 부착 된 젊은 생쥐의 뇌를 손상시킬 수있는 열을 생성합니다. 뇌 손상을 방지 시추하는 동안 두개골 표면에 식염수를 적용합니다. 식염수를 적용하면 필요한 드릴 원을보기 위해 해부 현미경을 사용하는 것입니다. 생쥐가 성숙 할 때 공간 따라서 드릴링에 의해 발생하는 열의 영향이 최소한의 영향을 생산할 것이며, 뼈 및 경막 사이 개발한다.

    시추는 원형 경로를 따라 천천히 그리고 지속적으로 드릴 비트를 이동하는 동안. 그렇지 않으면, 비트 라인을 이동하거나 뼈를 통해 직접 가서 뇌 조직을 손상시킬 수 있습니다. 조심스럽게 훈련을 검사 집게를 사용하여 뼈 창을 터치합니다. 만약 두개골 뼈 개sily은 뼈와 경막 사이의 공간에 집게의 좋은 팁을 이동, 위, 아래로 이동합니다. 그렇다면, 창을 생성, 전체 뼈를 들어 올려 제거합니다. 이렇게하면 뇌 조직을 손상시킬 수 있기 때문에, 다른 한쪽에서 뼈를 들어 올리지 마십시오. 동일 크기의 뼈 창을 만드는 것은 일관성있는 뇌 손상을 생성하기위한 중요합니다. 뼈가 제거되면 인해 두개 내 압력, 뇌는 이렇게 작은 뇌의 변형을 일으키는 원인이되는 개방 영역 밖으로 부풀어 오를 것입니다. 뼈 윈도우 사이즈가 변화하는 경우, 뇌의 변형의 레벨은 충격 사이트의 뇌 표면 곡선과 유사한 것으로, 다를 것이다. 그것은 뼈 창보다 작은 때부터 뼈 수술 후 충격 사이트 위치가 변경되지 않았습니다. 이렇게하면 뼈가 뇌 조직에 직접 고착시킬 것입니다. 뼈 창을 밀봉하기 위해 접착제를 적용하면 증가 두개 내 압력이 발생할 수 있습니다. 삼주 새로운 막을 승 뇌 조직을 포함 발견 된 CCI 수술 후 영향 사이트를 검사충격 사이트 외부 i 번째 제공된 뇌 조직 성장 없다. 알려진 조직 학적 변화로 인해 뼈의 취재의 부족으로 발생하지 않습니다.

    전자 마그넷 영향 시스템은 상당히 안정하고 정확하게 속도와 변형 깊이를 제어 할 수있다. 그러나 띄는 반면 인해 설계에 영향 팁에 연결된 코일 시프트 수 및 충돌 위치의 시프트가 발생할. 즉, 다른 합병증을 금지하지, 일치하지 않는 부상의 주요 원인이다. 충격 사이트 시프트 가능성에도 불구하고, 제어 피질 충격 법 따라서 TBIs에의 단기 및 장기 효과를 조사하기 위해 CCI 바람직한 방법을 만드는 유체 타악기 및 체​​중 드롭 방식에 비해 제어가 더 정확하고 쉽게 유지 뿐만 아니라, 가능한 치료 치료. 중요하지만 TBI 연구를 위해, 이전의 충격에 두개골의 일부를 제거하면 CCI 모델의 임상 적 관련성을 제한한다.

    데 위의 프로토콜마우스에 적당한 TBI를 생성하는 절차를 cribes. 충격 사이트는 원하는 상해의 동물과 정도에 따라 직경 1~6밀리미터 범위 일 수있다. 프로토콜은 충격 선단 직경 3mm, craniectomy 실수 띄는 뼈를 방지하기 위해 수행되었다 직경 4mm이었다 진술했지만. 충격 사이트의 크기를 변경하는 것 외에도, 변형 임팩터와 깊이의 속도가 필요 심각도에 도달하도록 조절 될 수있다.

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    Acknowledgments

    이 작품은 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 보조금 (SCBI 200-12)에서 자금에 의해 지원되었다, 랄프 W. 그레이스 M. 쇼월터 연구 상, 인디애나 대학 생물학 연구 그랜트, NIH 보조금 RR025761 및 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

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    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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