Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er definert som en endring i hjernefunksjonen, eller andre tegn på hjernen patologi forårsaket av en ytre kraft 1.. TBIs fortsatt et alvorlig helseproblem i hele verden, spesielt i USA. Ifølge Centers for Disease Control and Prevention, minst 1,7 millioner TBIs forekommer årlig i USA resulterte i 30,5% av alle skaderelaterte dødsfall. I 2000, de direkte medisinske kostnader og indirekte kostnader av TBIs utgjorde anslagsvis $ 76.5 milliarder i USA alene. Selv om teknologiske og terapeutiske fremskritt i foregående tiår har bedret kvaliteten og lengden på livet for de som lider av TBIs, ingen effektiv farmasøytisk eller forebyggende behandlinger i dag eksisterer. På grunn av kompleksiteten og vidtrekkende effekter av TBIs, inkludert vev lesjoner, celledød, og axon degenerasjon, ikke to skader er identiske; dermed ingen nåværende TBI modell for dyr reproduserer nøyaktigalle aspekter av TBI som sett hos mennesker. Men gjør dyremodeller gir mulighet til å produsere nesten identiske skader er nødvendige for å undersøke effekten av en rekke TBI med håp om ytterligere å forstå de kliniske manifestasjoner av TBIs.
Den kontrollerte kortikal innvirkning (CCI) modellen benytter en innvirkning system for å levere fysisk påvirkning til den eksponerte dura av et dyr. Det induserer TBIs som strekker seg fra mild til alvorlig lik de som oppleves av mennesker. Denne skaden ble først karakterisert i ilderen 2 og ble senere tilpasset for bruk i rotte 3,4, 5-7 mus og sauer 8.. Siden den første karakterisering, har skadestedet blitt plassert både over midtlinjen 2,9 og den laterale cortex 10. CCI gir en enkel og nøyaktig metode for å undersøke effekter og mulige behandlinger for TBIs.
I tillegg til den CCI-modellen, fluid slagverk og vekt dråpe modeller er commonly brukes til å produsere TBIs. Men disse modellene nåværende begrensninger, inkludert mindre kontroll over skade parametere, produsere histopathalogical endringene ikke sett i menneskelig TBIs, og større forekomst av dødsulykker i mus 3,5,10. Eksplosjonen bølgemodell er også brukt til å produsere TBIs. Selv om eksplosjonen bølgemodell klarer å gjenskape ikke de histopathalogical endringer sett etter en mekanisk påvirkning, gjør denne modellen produsere nøyaktig TBIs opplevd særlig av militært personell 11. Den kontrollerte kortikal slagmodell er lett å kontrollere på grunn av den nøyaktige kontroll over deformasjon parametere slik som tid, hastighet og dybde av virkningen 5. Slik nøyaktighet gjør replikere nesten identiske skader over en hel gruppe av dyr mer gjennomførbare. Viktigst, gjengir CCI TBIs med funksjonene sett i menneskelig TBIs 12. Men det er ingen enkelt dyr modell som er helt vellykket i å reprodusere hele spekteret av patologisk chantot. observert etter TBI. Videre forskning er nødvendig for å fullt avsløre de akutte og kroniske forandringer som oppstår etter TBI.
To typer skader oppstår etter en TBI: primære og sekundære skader. Den primære skade oppstår i øyeblikket for støt og ikke er følsom for terapeutiske behandlinger; imidlertid, de sekundære skader som vedvarer etter den første skaden er gjenstand for behandling 13. Den kontrollerte kortikal innvirkning modellen produserer den primære skaden, og dermed tillater forskerne å undersøke effektene av TBI og potensielle terapeutiske behandlinger for de potensielt langvarige effektene av sekundære skader. Områder med potensiell forskning ved hjelp CCI modellen inkluderer neuronal død, hjerneødem, neurogenesis, vaskulære effekter, histopathalogical endringer, og minne underskudd og mer 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Mann C57 BL / 6 mus var gruppe-huset og holdt i en 12/12 timers lys / mørke syklus med fri tilgang til mat og vann ad libitum. Dyrene som brukes i denne protokollen var 10-12 uker gammel. Alle prosedyrer ble utført under protokoller godkjent av Indiana University Animal Care og bruk komité.
En. Kirurgisk Forberedelse
- Anesthetize musen med en Ketamin / xylazin-blanding (87,7 mg / ml ketamin og 12,3 mg / ml xylazin) og administrere (1 ml / kg) via IP-injeksjon.
- Barbere hodet av musen mellom ørene.
- Påfør en petroleumsbasert gelé til øynene av musen for å hindre uttørking under operasjonen.
- Rengjør barbert med 10% jod. Deretter kan du bruke 70% etanol for å vaske av jod.
- Fest musehode i stereotactic rammen med øret barer og bite plate. Sørg for at hjernen er stabil.
2. Craniectomy
Tre. Else
Virkningen Systemet inkluderer en styreboks for å stille inn slagparametre, en aktuator for å utføre toppelse, og en stereotaktisk ramme å feste actuator og musehode for påvirkning.
- Pre-set av hastigheten av aktuatoren til 3 m / sek før kirurgi.
- Pre-set annen deformasjon dybde å indusere ulike skadegradene. Deformasjon dybder på 0,0 til 0,2 mm, 0,5-1,0 mm, og 1,2 til 2,0 mm ville resultere i mild, moderat og alvorlig TBIs, henholdsvis. Denne protokollen forklart hvordan man skal oppnå en moderat alvorlig hjerneskade med en deformasjon dybde på 1 mm ved hjelp av en hastighet på 3 m / sek.
- Fest aktuatoren til holderen i stereotaktisk ramme og bruke micromanipulators bevege den for å sikre den runde, flate ende av aktuatoren (3 mm diameter) i senteret av den åpne hodeskallen området. Deretter stilles spissen på skrå parallelt med overflaten av slagside.
- Etablere nullpunktet ved å bevege ned aktuatoren i utvide modellen inntil spissen berører overflaten av slagside. Deretter sette Z-kanalen på stereo kontrollpanelet til null.
- Trekk impactor tipsog samtidig betjene aktuatoren ned 1 mm.
- Hit virkningen knappen for å slå skaden området og oppnå en deformasjon dybde på 1 mm.
4. Injury Side Closure
- Bruk bomull-tipped applikator for å fjerne blod følgende utslag, men ikke røre skaden området.
- Plasser musen på en varm pad for å opprettholde kroppstemperaturen.
- Når blødningen har stoppet, sy såret lukket. Sett dyret tilbake i rent bur og la den komme seg etter operasjonen over natten på den varme pad.
- Administrer Buprenorfin 0,05-0,10 mg / kg SQ hver 8-12 timer for to dager etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontrollerte kortikal innvirkning modellen produserer TBIs varierer i alvorlighetsgrad fra mild til alvorlig. Post-effekt mengden av kranie hevelse, blødning, og kranie forvrengning på virkningen området vil avsløre skadegradstetthet som følge av farts og deformasjon dybdeparametrene. Milde TBIs resultere i kranie hevelse på virkningen området og liten blødning på grunn av begrenset dura brudd. En moderat TBI viser kranie hevelse og økt blødning på grunn av dura brudd på toppelse (Figur 1). Forskjellen mellom en moderat og alvorlig TBI kan være vanskelig å skille inntil visualisert på faste vev ved bruk av et mikroskop (fig. 2); kan imidlertid en alvorlig TBI tidvis vise forsterket forvrengning og kranie hevelse post-effekt. CCI-modellen kan brukes til å bestemme virkningene av flere aspekter av TBIs, inkludert vev deformasjon (figur 2), neuronal død, og histopathalogical endringer.
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 1. Kontrollert kortikal slagmodell for moderat traumatisk hjerneskade.. Fremgangsmåten for kontrollert kortikal effekten er illustrert i denne figuren. A) Musen hodet var stabilt festet på stereotaktisk ramme med øret bar og munn biter. B) Den venstre kranie eksponert og 4 mm ble trukket sirkel i sentrum av bregma, og lambda. C) Benet ble fjernet ved boringen for å generere et vindu for påvirkning. D) Aktuatoren er festet på stereotaktisk ramme og nullpunktet på Z-aksen er oppstilling. E) Hjernevevet ble forvrengt og blødning forårsaket ved slag. F) Blødningen stoppet flere minutter etter påvirkning og blod ble fjernet ved bomull applikator./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Histologi for Moderate Traumatiske hjerneskader. A) En naiv 10-12 uker gamle mus i hjernen ble fjernet. B) En 10-12 uker gamle musehjerne ble anvendt som en falsk kontroll. C) hjernen til en 10 til 12 uker gamle mus ble fjernet 24 timer etter en moderat TBI hjelp av CCI-modellen. D) hjernen til en 10 til 12 uker gamle mus ble fjernet 6 uker etter en moderat TBI hjelp av CCI-modellen. Et innrykk i hjernevev er tydelig på stedet av virkningen. E) Nissl farging ble utført på en humbug kontroll 10-12 uker gamle mus hjernen til å vise normal histologi. F) Nissl farging ble utført på en 10-12 uker gammel muse hjernen som haddefikk en moderat TBI bruker CCI modell. Et hulrom er synlig som strekker dypt inn i hjernebarken. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for med hell å generere konsistente TBIs ved hjelp av et elektronisk magnetslagsystemet å forårsake en CCI er: 1) stabilt feste musehodet i stereotaktisk ramme; 2) generering av den samme størrelse på benet vinduet mellom mus og fjerning av ben uten å skade dura i henhold til den under craniectomy; 3) riktig posisjonering av slagspissen i sentrum av det åpne området, og opprettelse av nullpunktet før det påvirker.
En mus hode må festes i stereotaktisk ramme svært tett før virkningen. Løs fiksering vil generere store variasjoner i skadenivå. For å sikre fiksering er stabil, bruke tang for å legge press på skallen når musen hodet er fast i stereotaktisk ramme og bekrefte at hodeskallen er fortsatt immobile. Ta forholdsregler for å unngå smitte av den eksponerte skallen. Etter å utsette skallen, flytte til den vanskeligste delen av den kontrollerte kortikale innvirkning kirurgi: bore en sirkulærskåret i skallen uten å skade dura mater under.
Den optimale størrelsen på boret er 0,5 mm. Den passende hastighet er 10,000-20,000 rpm; Imidlertid kan bruk av en høyere hastighet forenkle boring av et bedre ben-vinduet. Boringen vil generere varme som kan skade hjernen, spesielt i unge mus som har ben og dura er festet. For å unngå skade på hjernen, anvende saltvann til skalleoverflaten under boring. Bruk av saltoppløsning vil gjøre det nødvendig å bruke et disseksjonsmikroskop for å se boret sirkel. Når musene modne, utvikler et rom mellom benet og dura, og dermed virkningen av varme generert av boringen ville gi en minimal innvirkning.
Mens boring, beveger borekronen langsomt og kontinuerlig langs en sirkelformet bane. Hvis ikke kan bevege seg litt utenfor den linje eller gå direkte gjennom benet og skade hjernevev. Forsiktig berøre benet vinduet ved hjelp av pinsett til å inspisere boring. Hvis skallebenet easily beveger seg opp og ned, beveger den fine spiss av pinsettangens inn i rommet mellom benet og dura. Deretter løfter opp for å fjerne hele benet, og dermed skape vinduet. Ikke løft bein fra en side til en annen, fordi det kan skade hjernevevet. Making identisk bein vinduer er kritisk for å generere konsistente hjerneskader. På grunn av intrakranialt trykk, vil hjernen bule ut av det åpne område når benet er fjernet, og dermed forårsaker mindre hjerne deformasjon. Hvis størrelsen på benet vinduet varierer, vil nivået i hjernen deformasjon være annerledes, å være lik den hjerneoverflaten kurve i slagside. Benet ble ikke flyttes over slagside etter operasjonen siden det var mindre enn benet vinduet. Gjør du det vil føre til at bein å følge direkte til hjernevevet. Bruke lim for å forsegle bein vinduet kan føre til økt trykk i hjernen. Undersøke en innvirkning nettstedet tre uker etter en CCI kirurgi en ny membran ble funnet dekker hjernevev wed no hjernevev vekst utsiden av slagside. Ingen kjente histologiske forandringer oppstå på grunn av manglende bein dekker.
Det elektroniske magnet virkningen system er meget stabile og kan nøyaktig kontroll av hastigheten og deformasjon dybde. Imidlertid, på grunn av utformingen, kan spolen er koblet til slag spissen skift mens slående og resultere i en forskyvning av slagside. Dette er den viktigste årsaken til inkonsistente skader, sperring ingen andre komplikasjoner. Til tross for muligheten for skiftende virkningen området, forblir kontrollert kortikale innvirkning metoden mer presis og enklere å kontrollere i forhold til væske perkusjon og vekt slipp metoder, og dermed gjør CCI en foretrukket metode for å undersøke de kortsiktige og langsiktige effekter av TBIs , så vel som mulige terapeutiske behandlinger. Selv viktig for TBI forskning, fjerning av en del av skallen før virkningen begrenser den kliniske relevansen av CCI-modellen.
Protokollen ovenfor describes fremgangsmåten for å produsere en moderat TBI i en mus. Virkningen side kan ligge i området 1-6 mm i diameter, avhengig av dyret, og skaden kan være ønskelig. Selv protokollen angitt virkningen spissen var 3 mm i diameter, en 4 mm i diameter craniectomy ble utført for å hindre utilsiktet treffer benet. I tillegg til å endre størrelsen på slagside, kan hastigheten på den impactor og dybden av deformasjon bli justert for å oppnå graden nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Indiana Spinal Cord & Brain Injury Stipend (SCBI 200-12), Ralph W. og Grace M. Showalter Research Award, Indiana University Biologisk Forsknings Grant, NIH tilskudd RR025761 og 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
